第四章 結果與討論
4.3 固定化酵素之特性
0 50 100 150 200 250
為 18.27 U/mg-protein
、
Km為 88.42 mM，從結果中得知固定化酵素 Km值增加，是由於酵素固定化於載體上，載體為酵素創造新的微環境，使 得 固 定 化 酵 素 和 基 質 間 的 反 應 具 有 較 高 阻 力 的 影 響 （Anita et al., 1997）；另一方面固定化酵素 Vmax保持為游離酵素 Vmax的 81%，由以上 二種參數看來，驗証了本研究選用的固定化技術對酵素性質沒有嚴重地 影響。
0 5 10 15
Specific activity (U/mg-protein)
Substrate (mM)
圖4-14 基質濃度對酵素反應速率之影響。（○）游離酵素；（●）固定 化酵素。
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
V-1 (mg-protein/U)
S0-1 (mM-1)
圖4-15 酵素反應速率之 Lineweaver-Burk 作圖。（○）游離酵素；（●）
固定化酵素。
4.3.2 酵素之熱安定性
熱安定性為探討儲存溫度對酵素的影響。首先將游離酵素與固定化 酵素浸於 pH 值 7 緩衝溶液中保存 2 小時後，再取出並測定其殘留活性 如圖 4-16 所示。由於酵素在高溫下會進行自我消化行為（Goldstein, 1973），從圖中數據看來酵素被固定化後其展現的活性優於游離酵素，
在 70°C 下游離酵素相對比活性只剩下 5%，固定化酵素卻仍維持著 90%
30 40 50 60 70
al., 2005），增強酵素對溫度之安定性並且阻止了酵素自我消化行為；也 有文獻指出將游離酵素以多點連接的方式將酵素固定於載體上，將更有 助酵素操作於高溫下提升其應用性（Mateo et al., 2007）。
0 20 40 60 80 100 120
Relative specific activity (%)
Temperature (oC)
圖 4-16 溫度對酵素安定性之影響。（○）游離酵素；（●）固定化酵素。
4.3.3 酵素之 pH 值安定性
pH 值安定性為探討儲存溶液 pH 值對酵素的影響，首先將游離酵素 與固定化酵素於 30°C 下保存 2 小時後，再取出並測定其殘留活性如圖 4-17 所示。由圖中得知游離酵素較適應鹼性緩衝溶液且於 pH 7 最佳，
在酸性緩衝溶液下其比活性下降許多代表著酸性離子對游離酵素影響
5 6 7 8 9
較為嚴重，其間接驗証固定化 pH 值於酸性緩衝溶液下蛋白質固定量較 少有關連性；然而，固定化酵素則置於酸性緩衝溶液較為適應於 pH 6 最佳，其數據趨勢與固定化 pH 值之趨勢相輔，顯示了酸性離子對固定 化酵素構形是有幫助的，同時也輔助說明 4.2.5 節的辨斷能使酵素活性 部位之離子化基團展開，使其展現較佳之活性。
0 20 40 60 80 100 120
Relative specific activity (%)
pH value
圖 4-17 pH 值對酵素安定性之影響。（○）游離酵素；（●）固定化酵素。
4.3.4 酵素之儲存安定性
儲存安定性為探討儲存天數對酵素安定性的影響，先將游離酵素和
0 5 10 15 20
十天後再取出並測定其殘留活性如圖 4-18 所示。由於酵素有自我消化行 為且生物觸媒本身具有自我降解性，因此將酵素保存於溶液中藉以了解 其活性變化，從圖中看來游離酵素隨著儲存天數的增長其活性逐漸地下 降，保存20 天後相對比活性下降至 46%，而固定化酵素於儲存 20 天後 其相對比活性並沒有下降的趨勢，由此結果顯示固定化酵素不受儲存天 數所影響，此優異的安定性大大提升了酵素保存之工業化可行性，並且 在操作安定性之探討將可排除固定化酵素因使用天數所造成的活性下 降變因。
0 20 40 60 80 100 120
Relative specific activity (%)
Storage time (days)
圖 4-18 儲存天數對酵素安定性之影響。（○）游離酵素；（●）固定化 酵素。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4.3.5 固定化酵素之操作安定性
將酵素製備成固定化酵素不但能穩固酵素構形於載體上，使得其操 作條件可更為廣泛；另一方面固定化酵素回收容易因此擁有重複使用特 性，以上優勢將能有效地節省酵素製程的成本，於是操作安定性的探討 是非常重要的參數。圖 4-19 顯示固定化酵素的重複使用次數結果，經過 重複使用 10 次後其幾乎無活性損失，相對比活性仍維持在 98%。因此 由四種安定性探討得知，利用 amidination reaction 方法製備的固定化酵 素安定性優於游離酵素且擁有優異的重複使用性，有應用於真實系統發 展之可行性，於是進一步將其應用於大豆油反應生產生質柴油之探討。
0 20 40 60 80 100 120
Relative specific activity (%)
Recycle number (times)