酵素固定化之參數探討

由於酵素製程主要礙於酵素高成本及酵素不易回收等缺失可供改 進的方向，若酵素固定於載體之上製備成固定化酵素，將有利於酵素的 回收並可再重複使用，與強化酵素構形可防止酵素失活的優點。因此藉 由固定化技術的應用將可提升酵素的安定性，以下將探討活化時間、固 定化時間、酵素濃度、固定化溫度及固定化 pH 值之參數。

4.2.1 活化時間對酵素固定化的影響

由 4.1.1 節結果得知活化程序不會破壞奈米纖維膜表面結構，於是 每單位奈米纖維膜的表面積為定值，藉由活化時間與蛋白質固定量的關 係如圖 4-9 所示，探討奈米纖維膜活化完成之時間。由圖中可知活化奈 米纖維膜 2.5 分鐘，其蛋白質固定量為最低值，顯示了奈米纖維膜未活 化完全；在活化 5、7.5 及 10 分鐘條件下，蛋白質固定量幾乎沒有差異，

其平均值約為 113 mg-protein/g-material，証實活化時間 5 分鐘已可將奈 米纖維膜活化完全，並使得蛋白質固定量達到最大值。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0

50 100 150

Pr ote in loa ding (mg prote in / g ma te ri al )

Time of activation (minutes)

圖 4-9 活化時間對蛋白質固定量之影響。固定化時間：1 小時；酵素濃 度：1 wt%；固定化溫度：30°C；固定化 pH 值：7。

4.2.2 固定化時間對酵素固定化的影響

經由固定化時間的探討，獲得酵素鍵結於載體之時間，圖 4-10 表示 固定化時間對蛋白質固定量與比活性的影響。從比活性方面分析，理論 上蛋白質固定量愈多其所展現之活性為愈高，但是從實驗數據之蛋白質 固定量愈高其活性並非以等比例上升，導致比活性於 30 分鐘後有下降 的趨勢；另一方面可發現蛋白質固定量隨著固定化時間增長有些微增加 的趨勢，文獻指出酵素固定化之載體官能基短時間就能與蛋白質鍵結

0 25 50 75 100 125

（Mateo et al., 2007），因此固定量有些微增加的現象主要是因為蛋白質 推疊所造成的結果，此現象可能會造成酵素活性位置互相阻礙。經圖 4-10 中比活性之趨勢驗証了文獻所述，在固定化時間 60 分鐘後有蛋白 質推疊之現象發生，使得部份酵素無法催化反應基質，造成酵素成本消 耗。

由以上酵素固定化時間的研究發現，最適固定化時間為 30 分鐘，

其 蛋 白 質 固 定 量 與 比 活 性 分 別 為 99 mg-protein/g-material 及 1.69 U/mg-protein。

0 50 100 150 200 250 300

0 30 60 90 120 150 180

Pr ote in loa ding (mg prote in / g ma te ri al )

Immobilization time (minutes)

Relat iv e sp eci fi c act iv ity (%)

圖 4-10 固定化時間對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間：5 分

4.2.3 酵素濃度對酵素固定化的影響

在酵素製程中酵素成本佔總成本的比重相當高，於是如何有效率地 使用酵素且符合經濟效益為重要之議題。圖4-11 為酵素濃度對蛋白質固 定量與比活性的影響，由圖中可明顯地看出酵素濃度增高時，奈米纖維 膜上之蛋白質固定量隨著增加，主要是因為高酵素濃度使得碰撞頻率較 高酵素易固定於奈米纖維膜上；然而 0.5 wt%酵素濃度的蛋白質固定量 為最低值，但是其催化反應之比活性卻優於其他條件酵素濃度，造成此 現象可能為高酵素濃度易造成蛋白質推疊發生機率，使得部份酵素無法 展現其活性，導致了比活性於 1 wt%酵素濃度時有下降的趨勢。

基於經濟上的考量，選用 0.5 wt%酵素濃度進行固定化研究為最適 當之條件，其蛋白質固定量與比活性分別為 49 mg-protein/g-material 及 3 U/mg-protein。

0 20 40 60 80 100 120

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

0 50 100 150 200 250

Protein loading (mg pr ote in / g m ate ri al )

Enzyme concentration (wt%)

Relat iv e speci fi c acti vit y (%)

圖 4-11 酵素濃度對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間：5 分鐘；

固定化時間：30 分鐘；固定化溫度：30°C；固定化 pH 值：7。

4.2.4 固定化溫度對酵素固定化的影響

酵素屬於生物觸媒其活性易受到環境因素影響而損失酵素活性，例 如：高溫會造成酵素構形改變導致其反應性變差甚至變性失去反應能 力，因此決定出最適固定化溫度操作，將有助於提升酵素製程之潛力。

固定化溫度對蛋白質固定量與比活性的影響如圖 4-12 所示，由於各溫度 條件之蛋白質固定量幾乎相同，顯示了固定化溫度與蛋白質固定量沒有

0 20 40 60 80 100

受到破壞前提下，溫度的提升可提供能量給酵素展開至較佳構形，與增 加酵素與載體間之鍵結（Mateo et al., 2007），使得酵素活性位置更容易 與基質接觸，促使其反應催化更有效率。

由以上所述，酵素固定化於 50°C 溫度下可擁有最佳性質，其蛋白 質固定量與比活性分別為 51 mg-protein/g-material 及 4.6 U/mg-protein。

0 25 50 75 100 125

30 40 50 60

P rote in loa ding (m g prote in / g m ater ia l)

Temperature (

C)

Rel at iv e sp eci fi c act iv ity (%)

圖 4-12 固定化溫度對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間：5 分 鐘；固定化時間：30 分鐘；酵素濃度：0.5 wt%；固定化 pH 值：7。

4.2.5 pH 值對酵素固定化的影響

酵素的活性部位含有許多可離子化基團（ionizable groups），其作用 為維持活性部位的構形，以利於基質與活性位置接觸進行催化反應，但 是離子化基團會因 pH 值變化而改變其離子型態，進而影響酵素觸媒機 能，因此了解 pH 值對酵素構形的影響，將可提高酵素展現之活性。pH 值對蛋白質固定量與比活性的影響如圖 4-13 所示，從圖中可得知酸性或 鹼性條件之蛋白質固定量有些微的差異，推測為經活化後奈米纖維膜上 的官能基於鹼性條件下較穩定，有助於酵素鍵結上奈米纖維膜，雖然鹼 性緩衝溶液有助於蛋白質固定量的提升，但是其反應活性卻不理想；反 之酸性條件下，其比活性明顯地大幅度提升，說明了酸性離子會影響酵 素固定於奈米纖維膜上，但是有助於酵素活性部位之離子化基團展開，

使其展現較佳之活性。

經過 pH 值的探討可歸納最適固定化 pH 值為 6，其蛋白質固定量與 比活性分別為 43 mg-protein/g-material 及 6.9 U/mg-protein。

0 20 40 60 80 100

0 25 50 75 100 125

5 6 7 8 9

P rote in loa ding (m g pr ote in / g ma te ri al )

pH value

Relative specific activity (%)

圖 4-13 pH 值對蛋白質固定量與比活性之影響。活化時間：5 分鐘；固 定化時間：30 分鐘；酵素濃度：0.5 wt%；固定化溫度：50°C。