實驗方法

14. 桌上型高速微量離心機（Centrifuge）：Eppendorf 公司製造，Centrifuge 5415D 型。

15. 恆溫振盪水槽（Thermostatic reciculator）： DENG YNG 公司製造，

DKW40 型。

16. 酸鹼度計（pH meter）：SUNTEX 公司製造，PC-310 型。

17. 磁石攪拌器：購自於台灣，Fargo MS-90 型。

18. 氣體發生器（Kipp's Apparatus）：購自日盛玻璃儀器公司。

圖3-1 電紡織裝置圖。

3.2.2 脂肪分解酵素種類之選擇

在生質柴油相關的研究中，許多學者選用Pseudomonas屬微生物所生 產的非特定切位脂肪分解酵素，並指出Pseudomonas cepecia脂肪分解酵素 每單位量展現出最高活性能力（Noureddini et al., 2005）。因此本研究選用 由日本Amano公司菌株為Pseudomonas cepecia生產的Lipase PS Amano脂 肪分解酵素產品，作為製備固定化酵素之原料，期望發展出完整且兼具 成本優勢的生質柴油酵素製程。

3.2.3 固定化酵素之製備

本研究中利用 amidination reaction（Handa et al., 1982）活化聚丙烯 腈奈米纖維膜上的 CN 官能基，藉此可與脂肪分解酵素上 NH2官能基形 成 NC-N 共價鍵結，達到固定脂肪分解酵素在奈米纖維膜上之目的，圖 3-2 為此活化步驟之反應機制。

首先，將製備完成的奈米纖維膜裁剪成適當的面積，然後放置於無 水乙醇之中，再利用氣體產生器所製造的鹽酸氣體拍打奈米纖維膜數分 鐘，以達到活化之目的，活化完成後將奈米纖維膜以蒸餾水清洗數次，

洗除膜上的殘留乙醇，將其置入由 50 mM 的磷酸鹽緩衝溶液配製而成 的脂肪分解酵素溶液之中，然後放入恆溫震盪水槽中，於適當溫度下以 100 rpm 的速度震盪數分鐘，即完成固定化脂肪分解酵素於奈米纖維膜 之步驟。由於固定化酵素活性受活化時間（2.5 min、5 min、7.5 min、

10 min）、固定化時間（15 min、30 min、60 min、120 min、180 min）、

酵素濃度（0.5 wt%、1 wt%、1.5 wt%、2 wt%）、固定化溫度（30°C、

40°C、50°C、60°C）與固定化 pH 值（5、6、7、8、9）等參數影響，

因此為固定化程序之探討變因，詳細反應條件列於第四章節。

圖3-2 固定化脂肪分解酵素於奈米纖維膜之反應機制圖

3.2.4 酵素蛋白質定量分析

蛋白質的定量分析方法是採用 Braford 法（1976）。加入Bradford 蛋 白質分析染劑於樣品中，放置於 30°C 下震盪反應五分鐘後，再於 OD₅₉₅ 下測量其吸收值。檢量線則是以不同濃度範圍（0 ~ 1.5 mg/mL）的牛血 清蛋白（BSA）來當作標準品。

3.2.5 酵素固定化之活性分析

在酵素固定化過程中，固定化條件直接影響著蛋白質固定量與酵素 活性，本研究根據固定化酵素催化三油酸甘油酯反應生成油酸甲基酯的 活性，透過實驗設計的方式，以尋找固定化酵素最佳比活性之固定化條 件。

詳細步驟如下：將 0.1 mL 三油酸甘油酯與 1.9 mL 正己烷溶劑混合 均勻後，再加入15 μL 甲醇量與 0.1 mg 游離酵素（或 4 cm²固定化酵素）， 將其放置於恆溫水槽中，並以 100 rpm 的速度在 30°C 下進行反應 1 小 時，反應方程式如圖 3-3 所示。反應結束後，取出 0.2 mL 樣品與 0.3 mL 正己烷溶劑混合稀釋後，再加入 0.5 mL 濃度為 2 g/L 亞麻油酸甲基酯作 為標準品，最後以氣相層析儀進行分析，測定反應後樣品中油酸甲基酯 的含量。以下為氣相層析儀之操作條件：

„ 注射器溫度（injector）：250°C。

„ 偵測器溫度（detector）：280°C。

„ 烘箱溫度（oven）：初溫150°C 以 10°C /min 升溫速率加熱至 180°C，

再以 1.5°C /min 升溫速率加熱至 200°C，最後以 30°C /min 加熱至 230°C，並維持 230°C 溫度 5 分鐘，全程共計 23 分鐘。

„ 管柱（column）：THERMO TR-FAME Part NO.260M142P。

400 mL/min。

本研究酵素活性單位 1 U 定義為：在分析條件下，每分鐘生成 1 μmole 的油酸甲基酯產物所需要的酵素量。酵素比活性定義為：每毫

克蛋白質所表現的脂肪分解酵素活性（U/mg-protein）。相對比活性定義 為：操作參數值中之最大比活性定義為 100%的相對比活性。

圖 3-3 脂肪分解酵素轉酯化之反應方程式

3.2.6 酵素之安定性探討

安定性為評估酵素特性重要指標之一，可幫助了解酵素性質並應用 於適當條件下達成設計酵素製程之目的。以下為探討酵素安定性之參 數：

(1) 熱安定性：將游離酵素和固定化酵素浸於 pH 7 緩衝溶液中，並分 別置於 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C 的溫度下保存 2 小時後，

再以活性分析測量其活性。

(2) pH 值安定性：將游離酵素和固定化酵素分別浸於 pH 5、pH 6、pH

7、pH 8、pH 9 緩衝溶液中，並置於 30°C 下保存 2 小時後，再以活 性分析測量其活性。

(3) 儲存安定性：將游離酵素和固定化酵素分別浸於 pH 7 和 pH 6 緩衝 溶液中，並置於 30°C 下保存 1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、7 天、

10 天、15 天、20 天後，再以活性分析測量其活性。

(4) 操作安定性：將製備完成之固定化酵素以活性分析方法測量，反應 結束後以正己烷清洗固定化酵素數次直至無殘留樣品，並重複 10 次以上步驟以測量其活性。

3.2.7 酵素反應動力學之探討

將游離酵素與固定化酵素分別加入於基質濃度 12.8 mM、25.6 mM、51.2 mM、102.4 mM、204.8 mM 三油酸甘油酯溶液中進行反應，

並以測定活性方法測量，再利用 Michaelis-Menten 方程式如 3-1 式，以 Lineweaver-Burk 作圖法求出游離酵素與固定化酵素之 Vmax及 K_m。

（3-1）

3.2.8 固定化酵素轉酯化大豆油之探討

大豆油反應生成生質柴油的實驗。本實驗自製膜反應器（Tan et al., 2006）

其構造如圖3-4 所示，內層為多孔性聚甲基丙烯酸甲酯（壓克力；PMMA）

支架；外層為玻璃。首先將 50 cm² 之固定化酵素披覆於壓克力支架之 上，並放置於反應器內，再分別加入 10 克大豆油和適當甲醇量於反應 器中，在固定含水量、固定溫度與固定脂肪酸含量下進行反應如圖 3-5 所示，達到反應時間後取出 0.4 mL 的反應液，利用氣相層析儀進行分 析。由於甲醇量（1 g、2 g、2.5 g、3 g、4 g、5 g）、含水量（0.8 g、1.6 g、2.4 g、2.88 g、3.2 g、3.84 g、4 g、4.8 g）、反應溫度（30°C、40°C、

50°C）與脂肪酸含量（0%、25%、50%、75%）等參數會影響生質柴油 轉化率，因此為固定化酵素催化反應油脂之探討變因，詳細反應條件列 於第四章節。

3.2.9 脂肪酸之定量分析

本研究中有不同脂肪酸含量油脂之探討參數，因此建立脂肪酸之定 量分析，以定量反應物油脂中脂肪酸含量。首先將 100%的脂肪酸油品 與大豆油以不同比例混合配製，配製完成後取 20 μL 油脂與 0.98 mL 正 己烷溶劑混合稀釋後，於 35°C 下以 HPLC 分析油脂中脂肪酸（fatty acid；FA）的含量（Holcapek et al., 1999）。HPLC 分析之移動相分別為 溶劑 A（甲醇）以及溶劑 B（正己烷/異丙醇，以 4：5 的體積比例混合），

圖 3-4 實驗室自製批次薄膜反應器裝置圖

層析管柱為 C18 逆向層析管柱，流速設定為 1 mL/min。溶劑 B 在 30 分 鐘內以等梯度增加到 50%，並於 35 分鐘時再以等梯度降到 0%；紫外光 度計的吸收波長為 205 nm。脂肪酸含量定義為脂肪酸面積佔油脂總面積 之分率，如 3-2 式所示：

（3-2）

3.2.10 生質柴油之定量分析

將轉酯化大豆油實驗中取出 0.4 mL 之油水混合液以 10,000 轉離心 後，從上層油相取出 10 μL 油脂並稱重，再與 0.49 mL 正己烷溶劑混合 稀釋後，最後加入 0.5 mL 濃度為 2 g/L 十五烷酸甲基酯作為標準品，最 後以氣相層析儀進行分析，測定反應後樣品中生質柴油的含量；氣相層 析儀之操作條件如 3.2.5 節所示。轉化率定義為生質柴油重量佔油脂總 重量之分率，如 3-3 式所示：

（3-3）