第三章 材料與方法
第三節 基因型檢定
第三節第三節 基因型檢定基因型檢定基因型檢定基因型檢定
抽取研究對象 10ml 靜脈血之後，由長庚醫院心臟內科實驗室，將研 究個案的全血，經由 Kit DNA 萃取試劑組（QIAGEN, Hilden, Germany）
萃取出 DNA，放入-20℃冰箱加以保存。DNA 檢體利用聚合酶連鎖反應 及 限 制 片 段 長 度 多 型 性 （ PCR-RFLP ； Polymorphism chain reaction-restriction fragment length polymorphism）之方法，進行 MnSOD、
CAT 和 GPx1 三種基因型之分析。三種基因型所用之核酸引子（primer）
序列，如下表所示。
表、MnSOD、CAT、GPx1 基因型之核酸序列 基因型 核酸引子序列(5’-3’)
MnSOD 5’-GCACCAGCAGGCAGCTGGCGCCGG-3’
5’-TGCGCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3’
CAT 5’-TAAGAGCTGAGAAAGCATAGCT-3’
5’-AGAGCCTCGCCCCGCCGGACCG-3’
GPx1 5’-TGTGCCCCTACGGTACA-3’
5’-CCA AATGACAATGACACAGG-3’
一、MnSOD 基因多形性分析 (一) PCR 反應溶液之配置
1.濃度為 100 ng/ul 之 DNA 0.5ul 2.10×buffer((NH4)2SO4) 3ul
3.2.5mM 之 Mg2＋ 2.4ul
4.MnSOD forward primer (5 p mole) 0.5ul 5.MnSOD reverse primer (5 p mole) 0.5ul 6.濃度為 0.2 mM 之 dNTP 0.6ul
7.Taq polymerase (Fermentas) 0.5ul 8.最後以蒸餾水調製成 30ul
(二) PCR-RFLP 反應步驟
先以 95℃加熱五分鐘；其次以 95℃一分鐘，61℃一分鐘，72℃兩分 鐘的條件循環反應 35 次；最後再以 72℃七分鐘使產物反應更完全。
（denaturation at 95℃，annealing at 61℃，elongation at 72℃）。
接著在 15ul PCR 產物內加入 NgoM IV 限制酶 5ul、限制酶緩衝液 3 ul 及蒸餾水至總體積 30ul，放置於 37℃烘箱內 12 小時，使其完全反應。再 以 6% acrylamine gel 進行電泳分析（180V，40 min），以溴化乙錠（ethidium bromide）染色，接著在紫外光燈下觀察與照相。
(三)MnSOD 基因型之判定
二、CAT 基因多形性分析 (一) PCR 反應溶液之配置 1.濃度為 5 ng/ul 之 DNA 10 ul 2.10×buffer 1.5ul
3.CAT forward primer (5 p mole) 0.4ul 4.CAT reverse primer (5 p mole) 0.4ul 5.濃度為 0.2 mM dNTP 0.3ul
Line 1：Val/Va type（112bp）
Line 2：Ala/Ala type（112bp，，，，90bp，22bp）
Line 3：Val/Ala type （90bp，22bp）
Line 4：negative control（NTC）
Line 5：100 bp ladder marker
1 2 3 4 5
500 bp
200 bp 100 bp 90 bp
112 bp
(二) PCR-RFLP 反應步驟
PCR 實驗反應一開始為熱開始（Hot start），94℃加熱五分鐘使雙股 DNA 變性；其次以 94℃30秒，59 35℃ 秒，72 35℃ 秒的條件循環反應 35 次；最後設定在反應 72℃五分鐘使產物反應更完全。（denaturation at 94℃，annealing at 59℃，elongation at 72℃）。
接著在 15ul PCR 產物內加入 Sma I 限制酶 4u、限制酶緩衝液 3ul 及 蒸餾水至總體積 30 ul，放置於 30℃烘箱內 12 小時，使其完全反應。再 以 8% acrylamine gel 進行電泳分析（120V，70 min），以溴化乙錠（ethidium bromide）染色，最後在紫外光燈下判斷基因型與照相。
(三)CAT 基因型之判定
1 2 3 4 5
155 bp 185 bp
500 bp
200 bp
100 bp Line 1：C/C type（155bp）
Line 2：T/T type（185bp）
Line 3：C/T type（185bp，，，，155bp，30bp）
Line 4：negative control（NTC）
Line 5：100 bp ladder marker
三、GPx1 基因多形性分析 (一) PCR 反應溶液之配置
1.濃度為 100 ng/ul 之 DNA 0.5ul 2.10×buffer 3ul
3.GPx1 forward primer (5 p mole) 0.5ul 4.GPx1 reverse primer (5 p mole) 0.5ul 5.濃度為 0.2 mM 之 dNTP 0.6ul 6.Protech Taq 濃度為 2U/λ 取 0.5ul 7.最後以蒸餾水調製成 30ul
(二) PCR-RFLP 反應步驟
PCR 實驗反應一開始為熱開始（Hot start），94℃加熱五分鐘使雙股 DNA 變性；其次以 94℃30秒，63 30℃ 秒，72 35℃ 秒的條件循環反應 35 次；最後設定在反應 72℃五分鐘使產物反應更完全。（denaturation at 94℃，annealing at 63℃，elongation at 72℃）。
接著在 15ul PCR 產物內加入 Apa I 限制酶 20u、限制酶緩衝液 3ul 及蒸餾水至總體積 30ul，放置於 30℃烘箱內反應 16 小時。再以 6%
acrylamine gel 進行電泳分析（120V，55 min），以溴化乙錠（ethidium bromide）染色，並在紫外光燈下觀察與照相。
(三)GPx1 基因型之判定
第四節 第四節 第四節
第四節 血漿蛋白質羰基濃度分析血漿蛋白質羰基濃度分析血漿蛋白質羰基濃度分析血漿蛋白質羰基濃度分析(carbonyl assay)
一、使用比色法分析來做標準值
(一) 製作氧化 BSA（bovine serum albumin）步驟
1.將 0.234 g 的 FeSO4‧H2O 溶解到 150 ml 的 PBS（phosphate-buffered saline）中
2.加入 16.7 ml 的 H2O2
3.將 5 g 的 BSA 溶入 100 ml 的 PBS 中，使得 BSA 濃度為 50 mg/ml 1 2 3 4
Line 1：100 bp ladder marker Line 2：negative control（NTC）
Line 3：Pro/Leu type（337bp，，，258bp，79bp） ， Line 4：Pro/Pro type（258bp）
100 bp 500 bp
200 bp
337 bp 258 bp
4.在 37℃的水中，水浴培養一小時
5.加入 17.6 mg 之 BHT()（butylated hydroxytoluene）停止氧化反應 6.貯存在-70℃中
(二) 氧化與未氧化的 BSA 中羰基與蛋白質濃度 1.將未氧化的 BSA 溶入 PBS 中使濃度為 50 mg/ml
2.分別加入 0.25 ml 氧化與未氧化的 BSA 到兩個 3.6 ml 的試管中
3.加入 1 ml 的 10 mM 之 2,4 DNPH（2,4 - dinitrophenylhydrazine）溶解在 2.5 M HCl 到其中一管當作是樣本
4.加入 1 ml 2.5 M HCl 到另一管當作是對照
5.在室溫中避光培養一小時，每 15 分鐘 vortex 一次 6.加入 1 ml 20%之 TCA（trichloroacetic acid），並 vortex 7.將試管放到碎冰中冰浴 10 分鐘
8.離心 3000rpm 五分鐘
9.丟棄表層物，再加入 1 ml 10%之 TCA，並且 vortex 直到顆粒狀物都溶 解為止
10.再度離心 3000rpm 五分鐘之後，倒掉上層液
11.將體積比 1：1 的乙醇與乙酸乙酯混和液加入試管 wash 三次，每次加 入後都要離心，並且倒掉上層液。經過 3 次的 washing，上層液要幾乎 都沒有顏色
12.加入 6M guanidine hydrochloride 使沉澱物溶解其中 13.在 37℃的環境下培養 10 分鐘，使所有的沉澱物都溶解 14.再離心 3000 rpm 五分鐘，將不能溶解的物質移除
(三)測量氧化與未氧化的 BSA 中羰基與蛋白質濃度
1.將未氧化的 BSA 利用 guanidine hydrochloride 稀釋成 2mg/ml，1.5 mg/ml ，1 mg/ml，0.5 mg/ml，0.25 mg/ml 以建立標準曲線；並以 guanidine hydrochloride 當作空白（blank）
2.利用 375 nm 波長測量羰基濃度；280 nm 波長測量蛋白質濃度 3.計算出 280 nm 波長下之平均吸光值，並且減去空白吸光值 4.算 375 nm 之平均吸光值，也減去空白吸光值
5.將有加入 DNPH 的吸光值，減去加入 HCl 的吸光值 6.羰基濃度＝375 nm 平均吸光值＊45.45
二、羰基酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay；
ELISA）
(一) 蛋白質衍生物
1.參照之前作好的標準曲線，運用氧化與未氧化的 BSA 和 PBS，將濃度 稀釋為 1.0%、0.5%、0.25%、0.125%及 0%
2.用 PBS 將每一個 sample 的蛋白質濃度稀釋成 4 mg/ml
3.將稀釋成 4 mg/ml 的 sample，取 2 ul 到 96-well plate 中，再加入 6ul 之 DNPH 混和
4.在室溫中避光培養 45 分鐘，每 15 分鐘 vortex 一次 5.加入 12 ul 之 2 M Tris 來停止衍生
6.每一個 well 中再加入 1600ul PH = 7.0 的 PBS
(二) ELISA assay
1.將蛋白質衍生物和標準物依次各吸取 200 ul 到 ELISA plate 上，並做二 重複。放入 4℃冰箱 overnight，使其可以 coating 到 plate 上
2.用 300 ul/well 之 wash buffer（0.05% Tween 20 in PBS）來洗 plate，用 0.1%的 BSA in PBS (250 ul/well)來 block，且放置於室溫 1.5 小時。
3.再 wash 一次，加入第一次的抗體 200 ul/well（biotinylated anti-body, Molecular Probes; diluted 1:2000 with 0.1% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS），在 37℃烘箱中培養 1 小時。
4.再 wash 一次，加入第二次的抗體 200 ul/well（streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase conjugate, Amersham; diluted 1:4000 in 0.1% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS），在室溫中培養 1 小時。
5.最後再 wash 一次，加入 TMB substrate（Sigma Chemical Co., MO,USA）
200 ul/well，室溫中避光培養 15 分鐘 6.加入 2.5 M H2SO4 100ul/well 停止反應
7.在 450 nm 的光波長下，讀取其吸光值，減去 blank 之吸光值後，代入 標準曲線換算每個 sample 羰基濃度