實驗分析方法

1. Genomic DNA 萃取方法

本研究之 DNA 萃取是利用全血萃取方法，其步驟如下：

1. 從採血管中取出新鮮之全血 3 毫升，將其放入空的試管中，加入 3 倍體積的紅血球溶解液 (RBC lysis solution;Puregene,

Gentra)，均勻搖晃使其混合均勻後，靜置十分鐘，再以 4℃、3000rpm 離心十分鐘，去除上清液後，加入 3 倍體積的紅血球溶解液後，均勻 搖晃使其混合均勻後，靜置十分鐘，再以 4℃、3000rpm 離心十分鐘，

去除上清液。

2. 加入與全血等體積的細胞溶解液 (Cell lysis solution;

Puregene , Gentra)，均勻混合後，將其震盪約 20 秒使血球細胞震

碎，再放入 37℃的培養箱 4 小時以上，直至白血球完全溶解。

3. 待白血球完全溶解後，加入 1 毫升的蛋白質沉澱液(Protein precipitation solution; Puregene, Gentra) 震盪混何均勻後，靜 置十分鐘，再以 4℃、3000rpm 離心十分鐘。

4. 取出離心後的上清液至另一個乾淨的試管中，加入約 0.8 倍體積 的異丙醇，輕輕搖晃均勻直至絲狀物出現，之後利用吸管將絲狀物取 出至已滅菌 1.5 毫升的離心管中，以 4℃、13000rpm 離心十分鐘。

5. 離心後，除去上清液所得之 DNA pellet，用 70%之酒精清洗，再 以 4℃、13000rpm 離心十分鐘。

6. 離心後，除去上清液，將 DNA pellet 進行乾燥。

7. 乾燥後，加入適量的 DNA 溶解液 (DNA hydration solution;

Puregene, Gentra)，放置於室溫下約六小時使其均勻溶解。

8. 取出 1μl 的 DNA，加入 99μl 的已滅菌之二次水，用分光光度 計 (Pharmacia) 進行 DNA 濃度的測量(OD260 值)，最後貼上標籤，

將 DNA 溶液冰存於-20℃的冰箱中儲存。

2. 脂締素濃度測試方法

本研究之脂締素濃度係採用 LICAO 公司之 Human Adiponectin RIA

3. 基因多型性分析方法

本研究之基因多型性分析方法，是以聚合酶鏈鎖反應

( polymerase chain reaction, PCR ) 與 限制片段長度多型性分析 方法（restriction fragment length polymorphism, RFLP ），來進 行脂締素基因(adiponectin gene)SNP276 and SNP -11377 的基因型 判定。在 PCR 反應前必須先確定反應的條件與反應所需的試劑，而 反應條件中黏合溫度 ( annealing temperature) 可以利用 PCR 機 器跑 Gradient 來做調整。每次上 PCR 反應的總體積為 25μl，包含 有 DNA 檢體、合成引子 ( primer )、去氧核甘三磷酸 ( dNTPs )、

氯化鎂 ( MgCl2 )、10 倍聚合酵素緩衝溶液、DNA 聚合酵素與滅菌 的二次水。而在 RFLP 的實驗中，每次反應的總體積為 10μl，包含 有 PCR 產物、限制酵素、限制酶緩衝溶液與滅菌的二次水。在 PCR 反 應完成後與 RFLP 反應完成後之產物，會以瓊脂洋菜膠體電泳

( agarose gel electrophoresis ) 來進行基因型的判定。

1. 脂締素基因(adiponectin gene)SNP276

在脂締素基因(adiponectin gene)SNP276 的基因型分析中，所採用 的合成引子 ( primer )序列為 Forward 5-TGGTCCTTTGGTGCTGAGTT -3

＇ 與 Reverse5＇- TACGCCAAGCTTTGCTTTCT-3＇，在 PCR 反應所需 的試劑為 DNA 檢體 1.5μl ( 100ng/μl )、去氧核甘三磷酸 2μl ( 2.5 mM )、氯化鎂 1.5μl ( 25 mM )、合成引子 1.5 ( 5 pM )、10 倍 聚合酶緩衝溶液 2.5μl ( 100 mM )、DNA 聚合酶 Taq 0.2μl ( 5U/

μl )與已滅菌二次水 14.3μl。PCR 反應程式為 95℃ 4 分鐘使完 全升溫，接著變性 95℃ 30 秒，黏合 58℃ 40 秒，延展 72℃ 40 秒，

30 個循環後 72℃ 3 分鐘。

經過 PCR 反應過後，會將 PCR 產物以 2.5%瓊脂洋菜膠體電泳 (agarose gel electrophoresis )來進行判定是否有產物，產物片段 長度為 279 bp。在 RFLP 的部份，需加入的試劑有 PCR 產物 4μl、

限制酶 Bsml 0.5μl、緩衝溶液 1μl、10 倍 BSA 0.5μl 與已滅菌 二次水 4μl，以限制酶 ( Bsml)在 65℃的水浴槽中進行消化 16 小 時。其消化作用後的產物片段長度為 279 bp / 227bp / 52 bp，因 此可以判定出三型分別為 TT ( 279 bp / 279 bp )、TG ( 279 bp / 227 bp / 52 bp )與 GG ( 227 bp / 52 bp )。參照圖 4-2 所示。

2. 脂締素基因(adiponectin gene)SNP-11377

在 adiponectin gene SNP-11377 的基因型分析中，所採用的合成引 子 ( primer )序列為 Forward 5-GCTCTGTGTGGACTGTGGAG-3＇與

Reverse5＇-AGAAGCAGCCTGGAGAACTG-3＇，在 PCR 反應所需的試劑為 DNA 檢體 0.5μl ( 100ng/μl )、去氧核甘三磷酸 2μl ( 1 mM )、

氯化鎂 1μl( 25 mM )、合成引子 0.5 ( 20 pM )、10 倍聚合酶緩 衝溶液 2.5μl ( 100 mM )、DNA 聚合酶 Taq 0.2μl ( 5U/μl )與 已滅菌二次水 17.8μl。PCR 反應程式為 95℃ 4 分鐘使完全升溫，

接著變性 95℃ 30 秒，黏合 58℃ 40 秒，延展 72℃ 40 秒，30 個 循環後 72℃ 3 分鐘。

經過 PCR 反應過後，會將 PCR 產物以 2.5%瓊脂洋菜膠體電泳 ( agarose gel electrophoresis ) 來進行判定是否有產物，產物片 段長度為 302 bp。在 RFLP 的部份，需加入的試劑有 PCR 產物 4μl、

限制酶 Alu I 0.2μl、緩衝溶液 1μl 與已滅菌二次水 4.8μl，以 限制酶( Bsml )在 37℃的水浴槽中進行消化 16 小時。其消化作用後 的產物片段長度為 302 bp / 181 bp / 121 bp，因此可以判定出三 型分別為 CC ( 302 bp / 302 bp )、CG ( 302 bp /181 bp / 121 bp ) 與 GG ( 181 bp / 121 bp )。參照圖 4-3 所示。

4. 實驗室 QA/QC

在實驗室的品質控管方面，在每次進行 PCR 實驗時，都會加入一個 positive control 來確保每次 PCR 反應的正確性，而且每次 PCR 實

驗都會加入一個 negative control 來確定每次 PCR 反應沒有污染。

而在每次的 PCR-RFLP 實驗時，都會加入一組 positive control 來 確保 RFLP 反應的正確性。