實驗方法

(一)、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法

五爪金英(購自屏東惠明中藥行)乾燥葉片 15 kg，經研磨後秤 取13.5 kg乾燥粉末，以 100 L乙酸乙酯有機溶液室溫下浸泡 3 天，

重複萃取 8 次，分別將有機溶劑萃取液以布氏漏斗抽氣過濾後，

以減壓濃縮機在42 ℃下濃縮移除溶劑，濃縮後之粗萃物再進行真 空冷凍乾燥將水分完全抽乾，得到乙酸乙酯層，以矽膠(silica gel) 分離進行柱相層析，並分別以正己烷(hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate) 、 甲 醇 (methanol) 為 溶 媒 進 行 梯 度 沖 提 分 為 6 個 fraction(Td-F1、Td-F2、Td-F3、Td-F4、Td-F5、Td-F6)(圖一)，經 真空冷凍乾燥將水分完全抽乾，密封存放於-20℃凍箱，供細胞活 性試驗用。供試藥物以DMSO配置存放於室溫，添加於培養基中 DMSO之最終濃度不超過 0.25％。

葉片(13.5 kg)

乙酸乙酯萃取(100L)

（每次浸泡3天，共8次）

乙酸乙酯抽出物

矽膠管柱層析法

(6:4) (4:6) (2:8)

TdF5 TdF6 TdF1

正己烷/乙酸乙酯 正己烷/乙酸乙酯 正己烷/乙酸乙酯 乙酸乙酯

TdF3 TdF4 (8:2)

正己烷/乙酸乙酯 甲醇

TdF2

圖一、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法流程圖。

(三)、細胞培養

本論文使用兩種細胞株，一為人類肝癌細胞HepG2(Aden et al., 1979)，以此細胞進行五爪金英萃取物抗腫瘤作用之探討及活性成 分的追蹤。另一為肝臟正常細胞Chang live cell(Chang et al., 1954) 購自食品工業發展研究所(Food Research and Development Institute, Hsin Chu, R.O.C)，以此細胞株做為五爪金英萃取物之正常細胞毒 性對照組。

HepG2 及 hang liver cell細胞分別培養於含 10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)的 DMEM培養基中。每毫升的培養基內 添加 00 I.U.青黴素 (penicillin)、100g鏈黴素(streptomycin)、2.5g 防治黴 (fungizone)、2 mM麩氨酸(L-glutamine)及 100M之非必需 性氨基酸(non-essential amino acid，包括 14.7g glutamic acid, 7.5g glycine, 8.9g alanine, 13.3g aspartic acid, 11.5g proline, 15g asparagine及 10.5g serine)，以上稱完全培養基，置於含 5% CO

C succinate dehydrogenase 還原成藍紫色的 formazan，可用來檢測細 胞存活與生長變化。

於室溫下震盪 5 分鐘，待紫色結晶完全溶解後，在 540nm測定吸 光值，將不同處理後之吸光值扣除空白組吸光值後，帶入下列公 式以求得細胞存活率Cell viability(%)。

Cell viability(%)=[OD₅₄₀(sample) / OD₅₄₀(control)] ×100%

(五)、細胞型態觀察

在24 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 3 × 10⁵細胞，培養 於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新培養 基，同時給予Td-F2(12.5、6.25、3.125、1.5625g/mL)之供試藥物，

給藥處理24 小時後，以倒立顯微鏡觀察細胞型態並拍照紀錄。

(六)、DNA片段化分析

在 6 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 8 × 10⁵細胞，

培養於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新 培養基，同時給予Td-F2 (12.5、6.25、3.125、1.5625 g/mL)之供 試藥物。給藥處理 24 小時後，將well內細胞液全部吸至離心管 (eppendorf)，若為貼附細胞需先以trypsin-EDTA取下。首先以 1,500 rpm離心 5 分鐘，再將上清液移至新的離心管，以 13,000 rpm離心 5 分鐘，兩管所取得的細胞pellet均以 1X PBS沖洗一次後，加入 400μL extraction buffer(50mM, pH 8.0、 Tris-HCl、10mM EDTA, pH 8.0、0.3% triton x-100)沖散並混勻於同離心管內，放置冰上作 用30 分鐘後，加入 10μL RNase A(20mg/mL)於 55℃作用 30 分鐘 後，再加入8μL proteinase K(20mg/ml)在 55℃作用 30 分鐘。加入 等倍體積之phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25：24：1）混合 均勻，以13,000 rpm離心 30 分鐘，小心吸取上清液 300μL，並加 入 1/10 倍體積的 3M NaOAc 及 2 倍體積的絕對酒精，於-20℃

overnight。隔天以 13,000 rpm, 4℃離心 30 分鐘，去除上清液以 70%

酒精沖洗，適度乾燥後，溶解於 12μL 0.1X TE buffer(10mM,

pH8.0、Tris-HCl、1mM EDTA, pH 8.0))，利用 1.5% agarose gel(含 0.5μg/mL ethidium bromide)，以電壓 100V進行膠體電泳(agarose gel electrophoresis)分析，最後以凝膠成像系統(Bio-Rad Gel Doc XR Systems, USA)與Quantity One 4.6.2 分析軟體進行觀察拍照。

(七)、細胞凋亡免疫酵素分析法

在96 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 2 × 10⁴細胞，培養 於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新培養 基，同時給予Td-F2 (3.125、2.34、1.5625、1.17、0.78g/mL)之供 試藥物，每個劑量三重複。給藥處理24 小時後，依照說明書指示，

移除培養液，加入lysis bu fer 200µL，在室溫下反應 30 分鐘，隨 後離心(200 × g, 5 分鐘)，取上清液 20µL放置有streptavidin coat ed的microtiter plate，加入 80µL的immunoreagent(在 20 mL的imm unoreagent中含有 1 mL的Anti-DNA-POD和 1 mL的Anti-histone-bi otin及 18 mL的incubation buffer)並以 200 rpm的轉速震搖 2 小 時，移除上清液並以incubation buffer清洗三次，加入ABTS solut ion 100µL以 250 rpm的轉速避光震搖 10 分鐘，再以 405nm測定 吸光值(以上lysis buffer, immunoreagent, incubation buffer及ABT S solution均為Cell Death Cell Detection ELISA

f

同時給予Td-F2 (6.25、3.125、1.5625g/mL)與Podophyllotoxin (20

g/mL)之供試藥物。給藥處理 12、24 小時後，將well內細胞液全 部吸至離心管(eppendorf)，若為貼附細胞需先以trypsin-EDTA取 下。首先以4000 rpm離心 5 分鐘後，去除上清液以 1X PBS清洗，

加入1mL之絕對酒精於-20℃作用 2 小時。再利用相同離心條件去 除上清液以1X PBS清洗兩次，加入預先配置之 1mL PBS溶液(內 含0.1mg/mL RNase A、0.5 ％ Tritone X-100)於 37℃作用 1 小時，

再加入1mL 50g/mL PI於 4℃避光 30 分鐘，接著以 1X PBS清洗 二 次 後 ， 加 入 200L1X PBS 以 FACScan 流 氏 細 胞 儀 (Becton Dickinson Immunocytometery Systems USA,San Jose, CA)進行分析 細胞內DNA含量，每個處理組分析 10000 個細胞，最後以Modfit 3.0 分析軟體分析sub-G1 phase(apoptotic cells)與細胞週期百分比。

(九)、蛋白質電泳與西方墨點法

1.蛋白質萃取

培養皿(petri-dish)，種入 5 × 10⁶細胞，培養於 5% C

Resolving gels (5mL) 在10cm的細胞 Protein Extraction Buffer (MPEB)添加 20L蛋白酶抑制劑( 1 粒 Protease inhibitor cocktail tablets以 2 mL三次水配置並分裝，於 -70℃凍箱存放)】，於冰上作用 30 分鐘，中途每 10 分鐘震盪 30 秒後，以液態氮(5 秒)與 37℃溫水(溶至小冰塊)來回交替 5 次幫助 細胞裂解，最後於4℃ 以 12000 rpm離心 30 分鐘後，取得之上清 液便為細胞總蛋白質(total protein)，經Bio-Rad Protein Assay reaget 測定白質之含量，分裝後於-70℃凍箱存放供日後實驗用。

2.蛋白質電泳

膠體濃度 8％ 10％ 12％

H2O 2.3 1.9 1.6

30％ acrylamide mix 1.3 1.7 2.0

1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 1.3 1.3 1.3 10％ SDS 0.05 0.05 0.05 10％ ammonium persulfate 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.003 0.002 0.002

Stacking gels (4mL)

膠體濃度 5％

取等量的蛋白質(30、50g)與 2X sam ffer 混勻(V:V)，

以10

泡在Trans buffer(Glycine 39 mM、Tris 48 mM、

在 Blocking solution【2g non-fat dry milk 溶於 ple bu

0℃加熱 5 分鐘於室溫冷卻後，每 well 中注入 20L 樣品，便 可進行電泳分析，一開始電壓調至 60V，直到樣品通過 Stacking gel，再將電壓調至 120V，以 Prestained Protein Marker 分子量為標 準，當樣品跑到底部即可結束並進行轉印。

3.西方墨點法 首先把gel取出浸

SDS 0.0375％ w/v、Methanol 20％ ) 30 分鐘，接著將 8 張 3MM filter paper以Trans buffer浸泡沾濕，PVDF膜以Methanol濕 潤，依序由下到上放置 4 張 3MM filter paper、PVDF膜、gel、4 張3MM filter paper於Bio-Rad semi dry上(正負電極板需先以濕潤 Trans buffer之Kimwipes擦拭轉印位置)，並注意是否有有氣泡，再 依PVDF膜面積換算電流(7 cm×8 cm×5.5=310 mA/cm²)，電壓不超 過25V，時間 15~30 分鐘，轉印結束後以二次水清洗PVDF膜，若 需看轉印效果可用Ponceau S red預染PVDF膜觀察，再以二次水清 洗即可。

將PVDF 膜浸泡

18 m

呈

(十)、統計分析

實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean

L TBST buffer(Tris 50mM pH7.5、NaCl 150mM、Tween-20 0.2

％)】中，並封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘後，以 TBST 清洗 PVDF 膜 5 次，每次 10 分鐘，接著再浸泡於配置適當比例之一級 抗體，並封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘後，以 TBST 清洗 PVDF 膜5 次，每次 10 分鐘， 最後配置適當比例之二級抗體(horse-radish peroxidase)，同樣封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘，以 TBST 清 洗 PVDF 膜 5 次，每次 10 分鐘，即可加入 1 mL ECL 呈色劑 (solution A: solution B,40:1) 色反應 1 分鐘，最後以化學發光成 像系統(Bio-Rad ChemiDoc XRs Systems, USA)與 Quantity One 4.6.2 分析軟體進行觀察拍照。

)來表示。數據分析以Student’s t-test 來比較組別間的差 異，當統計結果p＜0.05 時，則認為有統計意義。

第肆章 結果

(Td-F2)1.5625 g/mL)。經細胞毒性試驗MTT assay，由圖二顯示 隨著五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物Td-L-EA隨濃度增加，對細胞 細胞Chang liver cell測試其是否對正常細胞具有細胞毒性，從圖四 實驗結果得知IC₅₀為 12g/mL。以上不同濃度處理於兩細胞之細胞 存活率數據呈現於表一中。

由於決定以五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2

作後續的活性試驗，依實驗設計藥物處理時間最長不超過 24 小

時，便必須挑選在藥物處理時間 24 小時內對人類正常肝細胞

Chang liver cell低毒性且對人類肝癌細胞HepG2 有一定抑制作用 濃度之劑量作實驗，而圖五為所挑選之五爪金英葉部之乙酸乙酯 萃取物第二分劃Td-F2 濃度劑量(1.5625、3.125、6.25 g/mL)，處

理 24 小 時 對 人 類 肝 癌 細 胞 HepG2 之 細 胞 存 活 率 百 分 比 為 97.69±1.60%、67.33±3.31%、50.70±0.95%, IC₅₀為6.7g/mL；而人 類 正 常 肝 細 胞 Chang liver cell 分 比 為 112.98±6.25% 、 107.69±7.35%、102.55±2.49%。另外不含藥物之DMSO於實驗結果 顯 示 皆 未 影 響 兩 細 胞 生 長 ， 其 百 分 比 區 間 為 94.40±1.48%~102.65±2.51%。

百

0 20 40 60 80 100 120

Td-L-EA

50 100 25

12.5 6.25

3.125

Concentration(g/mL)

*

Cell Viability (% of Control)

*

*

*

Control DMSO

圖二、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物 Td-L-EA 對人類肝癌細胞 HepG2 細胞毒性之作用。

不同濃度的Td-L-EA 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。

0

Cell Viability (% of Control)

100 存活率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean)來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義

（p<0.05）。

0 20 40 60 80 100 120

Td-F2

50 100 12.5 25

3.125 6.25 1.5625

*

*

* *

*

Concentration (g/mL)

Control DMSO

*

Cell Viability (% of Control)

圖四、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 對人類正 常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作用。

不同濃度的 Td-F2 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。

表一、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物與不同分劃對人類肝癌細 胞 HepG2 與人類正常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作用表。

不同濃度的 Td-F2 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。

HepG2

g/mL Td-L-EA Td-F1 Td-F2 Td-F3

1.5625 78.45±5.90%

3.125 103.42±3.99% 101.44±2.30% 39.43±3.59% 94.69±2.04%

6.25 82.13±8.69% 104.31±0.70% 25.52±2.84% 61.90±4.17%

12.5 52.11±0.77% 102.82±0.86% 19.78±0.54% 22.98±0.50%

25 23.73±0.74% 96.63±2.54% 14.41±1.66% 18.15±0.28%

50 19.11±2.11% 77.30±1.71% 2.72±0.34% 17.74±0.61%

100 7.22±0.28% 23.27±2.02% 1.71±0.36% 2.28±0.31%

DMSO 101.76±1.97% 97.52±3.71% 97.52±3.71% 97.52±3.71%

HepG2 Chang liver cell

g/mL Td-F4 Td-F5 Td-F6 Td-F2

1.5625 94.50±3.52%

3.125 95.76±2.43% 95.03±1.83% 98.19±3.13% 83.81±1.05%

6.25 99.45±0.76% 96.18±1.19% 98.55±1.32% 60.51±3.26%

12.5 86.97±7.83% 91.63±1.59% 96.05±2.82% 51.03±2.43%

25 65.53±4.71% 90.81±2.55% 99.63±1.50% 17.66±8.47%

50 31.96±1.51% 94.47±3.03% 93.89±6.01% 2.68±0.36%

100 5.34±1.27% 11.15±1.00% 16.97±3.48% 2.29±0.17%

DMSO 97.52±3.71% 97.52±3.71% 97.52±3.71% 102.56±6.46%

0 20 40 60 80 100 120

140 HepG2

Chang live cell

6.25 3.125

1.5625

*

*

Concentration (g/mL)

Control DMSO

Cell Viability (% of Control)

圖五、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 對人類肝 癌細胞 HepG2 與人類正常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作 用。

不同濃度的 Td-F2 處理 24 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。

(二)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處

理人類肝癌細胞HepG2 之細胞型態影響

人類肝癌細胞HepG2 是一種貼壁型細胞(adherent cell)，以顯 微鏡觀察，於正常生長情況下可看到圖六-A，其貼壁展開生長後，

細胞結構完整且呈多邊菱形，為細胞最健康之狀態。

由細胞毒性試驗MTT assay 實驗結果篩選出五爪金英葉部之

乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 為最有效抑制人類肝癌細胞

HepG2 生長，接著便以顯微鏡觀察給藥處理後之細胞型態變化。

當處理五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 24 小時 後，從圖六-C 可觀察到處理於濃度 1.5625g/mL 時，貼附細胞變 形 產 生 觸 角 ， 細 胞 逐 漸 萎 縮 ， 且 隨 著 處 理 濃 度 增 加(3.125 、 6.25g/mL) 圖六-D, -E，細胞逐漸萎縮死亡，且有空泡化現象，

並產生皺縮(如箭頭所指)。另外處理不含藥物之 DMSO 圖六-B 細 胞型態，於顯微鏡觀察下與未處理藥物之細胞圖六-A 外觀型態相 同，表示0.25% DMSO 並不影響細胞生長。

(A) Control (D) 3.125g/mL

(B) DMSO (E) 6.25g/mL

(C) 1.5625g/mL

圖六、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理人類 肝癌細胞 HepG2 之細胞型態影響。

圖六、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理人類 肝癌細胞 HepG2 之細胞型態影響。

在文檔中 五爪金英誘導人類肝癌細胞 HepG2 之凋亡作用 Tithonia diversifolia induced apoptosis on human hepatoma cell HepG2 (頁 39-81)