國立台東大學生命科學研究所 碩士論文
指導教授: 邱文慧 博士
五爪金英誘導人類肝癌細胞 HepG2 之凋亡作用
Tithonia diversifolia induced apoptosis on human hepatoma cell HepG2
研究生:盧泯任 撰
中華民國一百年六月
國立台東大學生命科學研究所 碩士論文
五爪金英誘導人類肝癌細胞 HepG2 之凋亡作用
Tithonia diversifolia induced apoptosis on human hepatoma cell HepG2
研究生:盧泯任 撰 指導教授: 邱文慧 博士
中華民國一百年六月
誌謝
對於我來說，這一次我花了三年完成了一個夢想，腦海中逐 漸浮現出不同時期曾經幫助我架構藍圖與逐步完成的築夢師，在 即將踏入人生的另一個生涯階段前，內心真誠的感謝您們。
回想三年前隻身到台北，首先必須感謝我的指導教授邱文慧 老師，在台北的日子裡，老師對於實驗或學業上的專業與熱誠，
幫助我成長了不少，印象最深刻的是在我的人生中第一份英文 paper 報告，老師花了一個下午，不限次數有耐心的講解與添加我
那絞盡腦汁的十三張PPT，同時也感謝實驗室的學長姐們，慧珠、
宇柔、慶芸、品文、小鈺、文澤、揆廷、銘宏，在碩士生涯的前 半段幫助我解決了許多難題，當然我的同學欣諭也很辛苦的幫了 我直到畢業為止。
由於實驗上額外的需求，我回到大學母校，非常感謝黃瑞齡 老師在擔任學務長最忙碌的時候，答應讓我回到我最熟悉的地 方，再續大學前緣繼續指導我，同時也因此獲得更多舊雨新知的 幫助，這裡特地感謝我大學時代的同學兼好朋友文泓，多年來無 私的幫忙，在我常常必須兩地往返來回時，照顧我的細胞，讓我 在實驗上無後顧之憂；另外感謝子文，呵呵！他教會我如何在大 街上高喊中華民國萬歲，從此每當想到這件事，上台報告再也不 緊張了；另外也感謝屏東科技大學的佩勳、秀蓉、冬琪、家祥，
解除我對天然物化學的恐懼，教會我從來都不敢碰觸的領域。當 然也感謝我的家人，爸爸、媽媽、哥哥，不論發生任何事，一直 以來總是默默在身後保護我，真的非常的謝謝。
最後感謝口試委員，指導教授-邱文慧老師、弘光科技大學- 陳建志老師、美和科技大學-黃瑞齡老師，於論文上提供許多寶貴 的意見，使我的論文內容更加充足完美。
泯任 2011/06
五爪金英誘導人類肝癌細胞 HepG2 之凋 亡作用
盧泯任
國立台東大學生命科學研究所
中文摘要
五爪金英Tithonia diversifolia為菊科(Compositae)多年生草本植 物。民間傳統使用以全草來治療肝病。近年來許多報告已證實具有保 肝，抗發炎以及抗腫瘤活性，然而目前並無五爪金英抗肝癌相關機制 之研究。
本研究首先篩選出五爪金英葉部之乙酸乙酯層TdLEA相較於枝條之 乙酸乙酯層Td-S-EA具有更強抑制人類肝癌細胞HepG2 生長作用其細 胞毒性為IC50 為 13.5 g/mL。選取葉部之乙酸乙酯層Td-L-EA萃取物 進行分離，並追蹤有效分劃。Fraction-2(Td-F2)處理 24 小時IC50 為 6.7
g/mL；處理 48 小時IC50為 3.0 g/mL，具有時間與濃度依賴性。接著 以五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人類肝癌細胞 HepG2，藉由顯微鏡觀察、DNA膠體電泳、ELISA kit、流式細胞儀測 定，結果顯示產生細胞外觀型態改變、DNA片段化、細胞凋亡率增加 與sub-G1 峰之細胞凋亡現象，進一步探討細胞凋亡調控機制方面，證 實具有活化上游的啟動者Caspase-8、Caspase-9 與下游執行者Caspase-3 以及切割其目標物DNA修復酶PARP之作用，此外Bcl-2 家族蛋白之促 凋亡蛋白Bax表現上升以及抗凋亡蛋白Bcl-xL失活。綜合上述結果證明 五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 具有誘導人類肝癌細 胞HepG2 細胞凋亡之活性，具有成為癌症化學預防劑之潛力。
關鍵詞: 五爪金英、細胞凋亡、肝癌、化學預防劑、Caspase.
Tithonia diversifolia induced apoptosis
on human hepatoma cell HepG2
Min-Ren Lu
Abstract
Traditional folk has applied the whole plant of Tithonia diversifolia, which belongs to the perennial herb family of Compositae, for the treatment of liver disease. In recent years, many reports have indeed confirmed their hepato-protective, anti-inflammatory, anti-cancer activities.
However, researches regarding the exact anti-cancer mechanisms of Tithonia diversifolia on hepatoma are still lacking.
In this study, we first showed that the ethyl acetate extract from leaves of Tithonia diversifolia (i.e., Td-L-EA) exhibits much stronger inhibition on human hepatoma cells HepG2 proliferation activities over the extract from the shoot of the same plant (i.e., Td-S-EA). The cytotoxicity effects (IC50) on the HepG2 of the ethyl acetate extract from leaves of Tithonia diversifolia is found to be 13.5 g/mL. We further isolated and tracked the effective fraction from Td-L-EA. The cytotoxicity effects (IC50) on the HepG2 of Fraction-2(i.e., Td-F2) are found to be 6.7 and 3.0
g/mL at 24 and 48 hours, respectively, showing a dose and time dependency. Next, the Td-F2-treated human hepatoma cell line HepG2 was carefully analyzed by using microscopic observation, DNA gel electrophoresis, ELISA kit, and flow cytometry. Our results clearly show apoptotic features such as DNA fragmentation, increased apoptosis rate and apoptosis occurring at the sub-G1 peak. We further explored the mechanisms of apoptosis regulation, and confirmed the activation of the upstream activators (i.e., Caspase-8, Caspase-9) and downstream effector (i.e.,Caspase-3), and the cutting of the function of the DNA repair enzyme (i.e., PARP) in the target substrate. In addition, the pro-apoptosis protein
(i.e., Bax) expression of Bcl-2 family proteins is found to increase, while their anti-apoptotic proteins (i.e., Bcl-xL) are inactivated.
In summary, our results unambiguously show that Td-F2 has induced apoptosis activities in human hepatoma cells HepG2, suggesting its potential application as a cancer chemo-preventive agent.
Keyword: Tithonia diversifolia, apoptosis, Hepatocellular carcinoma, Cancer chemopreventive, Caspase
目次
中文摘要... i
Abstract... ii
目次... iv
表目次... vi
圖目次... vi
第壹章 緒論...1
第一節、癌症化學預防劑...1
第二節、細胞週期...4
(一)細胞週期(cell cycle)簡介 ...4
(二)週期素(Cyclin)與週期素依賴酶(Cyclin-dependent kinase , CDK)簡介與調控...5
(三)週期素依賴激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor , CDKI)與檢查點(checkpoint)簡介調控 ...7
第三節、細胞凋亡...9
(一)細胞凋亡簡介 ...9
(二)細胞凋亡調控 ...12
第四節、肝癌簡介...16
第五節、五爪金英之相關研究...17
（一）、五爪金英簡介...17
（二）、五爪金英生物活性與成分...19
第貳章 研究目的...23
第参章 材料與方法...24
第一節、實驗架構...24
第二節、實驗材料...25
（一）、實驗藥品及試劑...25
（二）、儀器與設備...26
第三節、實驗方法...27
(一)、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法...27
(三)、細胞培養 ...29
(四)、細胞毒性試驗 MTT assay...29
(五)、細胞型態觀察 ...30
(六)、DNA片段化分析 ...30
(七)、細胞凋亡免疫酵素分析法...31
(八)、細胞週期分析 ...31
(九)、蛋白質電泳與西方墨點法...32
(十)、統計分析 ...34
第肆章 結果...35
(一)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物與不同分劃對人類肝癌 細胞株HepG2 細胞毒性之作用 ...35
(二)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人 類肝癌細胞HepG2 之細胞型態影響 ...42
(四)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人 類肝癌細胞HepG2 DNA片段化之作用 ...44
(五)、以ELISA kit 測定五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二 分劃Td-F2 誘導人類肝癌細胞HepG2 細胞凋亡之作用...46
(六)、以流式細胞儀分析五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二 分劃Td-F2 處理人類肝癌細胞HepG2 細胞週期分佈之影響...48
(七)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人 類肝癌細胞HepG2 後 Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、 PARP、Bcl-xL與Bax之蛋白質表現 ...53
第伍章 討論...55
第陸章 結論...58
表目次
表I、細胞凋亡與細胞壞死特徵. ...10
表II、五爪金英化學成份...21
表一、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物與不同分劃對人類肝癌細胞 HepG2 與人類正常肝細胞Chang liver cell細胞毒性之作用表。..40
表二、以流式細胞儀分析五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理人類肝癌細胞HepG2 細胞週期分佈之影響。...52
圖目次
圖I、癌症化學預防劑目標分子. ...3圖II、細胞週期調控示意圖...6
圖III、細胞凋亡與細胞壞死示意圖. ...11
圖IV、Pathways of Apoptosis Signal Transduction.。 ...15
圖V、五爪金英(Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gary)圖。 ...18
圖一、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法流程圖。...28
圖二、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物Td-L-EA對人類肝癌細胞He 細胞毒性之作用。 pG2 1 圖六 圖七 圖八 47 ...37
圖三、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物不同分劃Td-F1~Td-F6 對人類 肝癌細胞HepG2 細胞毒性之作用。...38
圖四、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 對人類正常肝 細胞Chang liver cell細胞毒性之作用。...39
圖五、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 對人類肝癌細 胞HepG2 與人類正常肝細胞Chang liver cell細胞毒性之作用。..4
、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人類肝癌 細胞HepG2 之細胞型態影響。...43
、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人類肝癌 細胞HepG2 DNA片段化之作用。 ...45
、以ELISA kit 測定五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 誘導人類肝癌細胞HepG2 細胞凋亡之作用。...
51 圖十
圖十
Td-F2 處理人類肝癌細胞HepG2 細胞週期分佈之影響。...
、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處理人類肝癌 細胞HepG2 後 Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、PARP、Bcl-xL 與Bax之蛋白質表現 。 ...54 一、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 誘導人類肝 癌細胞HepG2 之細胞凋亡調控機制圖。...60
第壹章 緒論
第一節、癌症化學預防劑
生 物 體 生 長 過 程 中 ， 細 胞 需 經 增 殖(proliferation) 、 分 化 (differentiation)與死亡(death)三階段，依所需分化成各種型態器官 以及不斷的衰老更新來維持正常的生理機能。癌症的形成原因很 多，但目前研究認為與環境中許多的致癌因子(carcinogens)有關。
當長期接觸物理性(如:放射線)、化學性(如:香菸)致癌物質、病毒(帶
有致癌基因)等外來因素以及細胞內部自然發生的基因複製錯
誤、遺傳(天生帶有不好的基因)，不論是什麼原因都可能會造成去 氧核醣核酸的突變(DNA mutant)，使抑癌基因 p53、Rb 功能喪失、
致癌基因 myc、Bcl-xL 活化、細胞週期失控等，細胞開始不正常 分化，不受週期控制的快速增殖，堆積成塊狀物組織，稱之為惡 性 腫 瘤(malignant tumor) ， 也 就 是 目 前 大 家 所 熟 知 的 癌 症 (cancer)。癌症可怕之處，依 Douglas Hanahan 等學者於 2000 年報 告指出惡性腫瘤七大特徵:自我充實的增殖訊號、不回應停止增殖 訊號、迴避細胞凋亡、無限制的複製能力、持續性的血管新生、
組織侵襲(Invasion)與轉移(metastatic)、基因的不穩定性。由上述 得知癌症是生命力強且非常難醫治的疾病，目前傳統治療方式以 外科手術、化學療法(chemotherapy)、荷爾蒙治療、免疫療法 (immunotherapy)、放射線療法或合併療法來達到清除癌細胞的目 的，但往往必須取決於病患年紀與身體狀態、腫瘤的位置、惡性 及發展程度，受到許多因素限制，且造成病患身體難以負荷因治 療所帶來的副作用。因此研發更有效的抗癌治療方法成為世界各 國共同新目標。
Michael Sporn 等學者於 1976 年首度提出了癌症化學預防(cancer
chemoprevention)的概念(Sporn et al., 1976).即利用單一、多重或合 成的化合物，使用來達到預防、阻斷、抑制或逆轉癌化作用或過 程，藉此降低癌症形成的危險因子或減少癌症復發的機會(Tsao et al., 2004)。天然物中有許多化合物，其種類的豐富性與多樣化具 有不同的生物活性，也因此提供治療癌症的新契機(Auyeung, et al., 2009; Zakaria, et al., 2009)。
現今也有許多的癌症化學預防劑，如 Wall 與 Wani 研究團隊於 1971 年間所發表的紫杉醇(taxol)和喜樹鹼(camptothecin)化合物，
也 分 別 為 美 國 食 品 暨 藥 物 管 理 局 （U.S. Food and Drug Administration, FDA)核准上市用來治療乳癌、大腸癌、肺癌、卵 巢癌的抗癌藥物(Wall et al., 1972; Wani et al., 1971)。此外特別的 是這兩種抗癌藥物在發現與上市至今依然是最有效的，簡單來說
紫杉醇與喜樹鹼分別有效抑制癌細胞細胞分裂與DNA 複製，也就
是具有獨特的抗癌機制(Wall et al., 1996)。目前許多抗癌目標分子 機制(詳述圖 I)，最原始的目的就是希望能抑制癌細胞生成因子和 路徑如:環氧化酶(COX-2)、抑制抗凋亡家族蛋白生成、NF-κB pathway 與造成細胞週期阻滯(cell cycle arrest)如:降低癌細胞週期
素蛋白生成、停止 DNA 複製以及促進癌細胞以細胞凋亡方式死
亡，最終抑制癌細胞增殖達到抗癌效果，因此找尋獨特抑癌機制 的癌症化學預防劑為本論文重點之ㄧ(Proskuryakov, et al., 2003;
Kulms, et al., 1995; Ding, et al., 2009)。
圖I、癌症化學預防劑目標分子.( Dorai et al., 2004)
第二節、細胞週期
(一)細胞週期(cell cycle)簡介
細胞是構成生物體的基本元件，最初經由增殖、分化與死亡 來形成所需器官以及後期穩定生理機能，這一切皆需精密的調 控，而我們稱之為細胞週期(cell cycle)。細胞週期簡單來說就是細 胞分裂結束到下次細胞分裂結束的過程。目前也已知分為間期 (Interphase-G0、G1、S、G2 phase)以及有絲分裂期(Mitosis phase-M phase)。
1.Gap 0 phase (G0):通常細胞皆處於此期也就是休止期，此時
停止一切細胞活動，但仍有 RNA、蛋白質合成的能力，直到收到
生長訊號便會開始前往下階段。
2.Gap 1 phase (G1):此期細胞逐漸變大，並且合成大量 RNA、
蛋白質，以提供 DNA 複製所需能量準備。此時細胞 DNA 含量為 二倍體(2N)。
3.Synthesis phase (S):為 DNA 合成期，以供未來分裂成兩子細 胞之所需。由於 DNA 正處於大量複製時期，因此 DNA 含量介於 二倍體至四倍體間(2N~4N)。
4.Gap 2 phase (G2): DNA 複製便到有絲分裂準備期，此時細 胞DNA 含量為四倍體(4N)。細胞繼續增大與合成 RNA、蛋白質，
以提供有絲分裂所需能量準備。
5.Mitosis phase (M):此期為有絲分裂期，停止細胞生長與RNA、蛋 白質合成，將專心進行細胞分裂直到母細胞(mother cell)一分為二 成為兩個子細胞(daughter cell)為止，最後細胞DNA含量也由4N又 變為2N。
(二)週期素(Cyclin)與週期素依賴酶(Cyclin-dependent
kinase , CDK)簡介與調控
細胞 週期能如 此井 然有序， 是受 到許多蛋白激酶複合體 (Protein kinase complex)所控制，其中主要由週期素(Cyclin)與週期 素依賴激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)所結合之複合物於特定 週期出現來進行調控(圖 II)。
Cyclins family(週期素家族) :一般在特定的週期才會被合成 出來。由文獻指出已知有29 種Cyclins的存在，這些Cyclins的N端 有皆具有 150 胺基酸結合區，稱為Cyclin box，是專門與特定的 CDKs結合。目前研究出與週期有關的有Cyclin A、Cyclin B123、 Cyclin D123、Cyclin E、Cyclin H；Cyclin-dependent kinase ,而 CDK family( 週 期 依 賴 素 家 族 ): 屬 於 一 種 絲 胺 酸 / 蘇 胺 酸 蛋 白 酶 (serine/threonine protein kinase)，通常穩定存於細胞內且不具有活 性，需特定Cyclin結合才具有活性。目前也已知有 20 種CDKs，而 與細胞週期有關的有CDK 1(cdc2)、CDK 2、CDK 4、CDK 6、CDK 7。(Vermeulen, K et al., 2003; Malumbres and Barbacid , 2005)。
由上述得知細胞週期需要由週期素(Cyclin)與週期素依賴激 酶(C
B-CDK 1(cdc2)會形成成熟促進 因子
yclin-dependent kinase , CDK)結合來進行調控。首先在 G1 初 期最先出現的是Cyclin D-CDK 4、Cyclin D-CDK 6，這兩種複合 體會對Rb(retinoblastoma protein)來進行部分磷酸化，使少許轉錄 因子E2F 因而解離活化，促進大量 E2F 與合成 Cyclin E，直到 G1 晚期Cyclin E-CDK 2 更進一部磷酸化 Rb-E2F 複合物，當累積一 定程度的E2F 時，也使週期由 G1 期往 S 期推進。S 期則是由 Cyclin A-CDK 2 來参與 DNA 的複製。
在G2/M 期方面一開始 Cyclin
(maturation or mitosis promoting factor, MPF)，接著 Cyclin
H-CDK 7 會結合成細胞週期蛋白依賴活化激酶(CDK activating kinase, CAK)來磷酸化 MPF 之 CDK 1(cdc2)上 Thr161(threonine)位 置，使MPF 具有活性，但 Wee1 和 Myt-1 同時也磷酸化 CDK 1(cdc2) 之 Thr-14(threonine)和 Tyr-15(Tyrosine)位置，因此 MPF 此時又不 具有任何活性。當 Cyclin B-CDK 1(cdc2)累積至 G2 末期時，會出 現 (Cell Division Cycle 25C, CDC25C) 將 CDK 1(cdc2) 之 Thr-14(threonine)和 Tyr-15(Tyrosine)位置去磷酸化，使 MPF 具有 活性，當累積至 M 期便開始磷酸化有絲分裂相關蛋白(如:Histone H1)，開始進行有絲分裂，直到 APC(anaphase-promoting complex) 出現將MPF 降解，最後完成細胞週期(Vermeulen, K et al., 2003)。
圖II、細胞週期調控示意圖. (Vermeulen, K et al., 2003)
(三)週期素依賴激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase
inhibitor , CDKI)與檢查點(checkpoint)簡介調控
正常情況下細胞出現問題時，也有其自己的防護功能，稱為 檢查點(check point)或限制點(restriction point)，其中在 G1 與 G2
以及 M 期皆有一個。細胞週期過程中發現細胞體積大小與 DNA
複製錯誤或是遭受損傷以及有絲分裂過程出現錯誤時，便會啟動 其功能，使週期無法往S 期和 M 期邁進以及停止有絲分裂，也就 造成細胞週期阻滯(cell cycle arrest)，直到細胞認定修復完成後才 會繼續往下個週期前進，如無法修復完成便引導走向細胞凋亡，
以維持正常生理機能。
這 些 負 向 調 控 的 蛋 白 稱 為 週 期 素 依 賴 激 酶 抑 制 因 子 (Cyclin-dependent kinase inhibitor , CDKI)，一共分為兩大家族（一）
INK4 family(inhibitor of cyclin-dependent kinas 4): 有 p15 (INK4b)、p16 (INK4a)、p18 (INK4c)、p19 (INK4d)，從文獻得知 這類家族專門抑制CDK 4 與CDK 6 蛋白的活性，阻止與Cyclin D 結合；（二）Cip(Cdk inhibitory
蛋
protein)/Kip(kinase inhibitory protein) family:p21 (Waf1, Cip1), p27 (Cip2), p57 (Kip2)，這類則範圍較廣是抑制G1 期CDK複合物以及CDK1-cyclin B複合物的活性(Sherr & Roberts 1995)。
1.G1/S 檢查點(G1/S checkpoint)
當細胞DNA遭受損傷時，會啟動ATM（ataxia telangiectasia mutated）和 ATR（ATM and Rad3-related）訊號路徑，便開始活 化下游p53 蛋白，接著會去磷酸化p21 (Waf1, Cip1), p27 (Cip2)，一旦 Cip/Kip family 白被活化後，G1 期Cyclin-CDK複合物(Cyclin D-CDK 4、Cyclin D-CDK 6、Cyclin E-CDK 2)活性被抑制，造成 Rb(retinoblastoma protein)無法被磷酸化，也就使細胞周期無法往 下階段邁進，造成G1/S細胞週期阻滯(G1/Scell cycle arrest)，此外 還有p53-independent路徑，也就是INK4 family中p15 (INK4b)、p16
(INK4a) 能抑制CDK 4 與CDK 6 蛋白的活性，阻止與Cyclin D結 合，最後也使Rb(retinoblastoma protein)無法被磷酸化造成G1/S細 胞週期阻滯(G1/Scell cycle arrest) (Sherr & Roberts 1998)。
2.G2/M 檢查點(G2/M checkpoint)
當 細 胞 在G2 期 NA 遭 受 損 傷 時 ， 會 啟 動 TM （ ataxia telangiectasia mutated）和 ATR（ATM and Rad3-related）訊號路徑，
接著活化Chk1(checkpoint kinase 1)/Chk2(checkpoint kinase 2)，此 時便分為p53-dependent路徑與p53-independent路徑，前者路徑開始 活化下游p53 蛋白，接著會去磷酸化p21
D A
(Waf1, Cip1), p27 (Cip2)，一旦 Cip/Kip family蛋白被活化後， MPF 活性被抑制，另外也會活化 14-3-3 sigma (14-3-3 )蛋白，其功能為阻止(Cyclin B-CDK 1(cdc2)) 形成MPF複合物，最後也就使細胞週期無法繼續往下階段邁進，
造 成G2/M 細 胞 週 期 阻 滯 (G2/M cell cycle arrest) ， 此 外 還 有 p53-independent路徑，也就是Chk1/Chk2 直接磷酸化抑制CDC25 活 性並且促進14-3-3 sigma (14-3-3 )蛋白與之結合，使其被迫留在 細胞質中無法磷酸化MPF因而失去活性，導致細胞週期無法繼續 進行，造成G2/M細胞週期阻滯(G2/M cell cycle arrest)(Vermeulen, K et al., 2003; Fukasawa, K et al.,2007)。
3.紡錘絲檢查點(Spindle checkpoint)
此階段為檢查細胞在有絲分裂過程中微小管(microtubule)結 構與紡錘體組裝是否錯誤以及染色體是否均勻分配，參與的調控 蛋白分為(Mitotic arrest deficient, Mad)和(budding uninhibited by benomyl, Bub)兩家族(如: BUB1、BUB3、BUBR1、Mad123)，一旦發 現錯誤時便會與分裂後期促進複合體蛋白(anaphase-promoting Complex, APC) 結 合 抑 制 其 活 性 ， 也 因 此 停 止 分 裂 於 中 期 (Metaphase) 無 法 往 後 期 (Anaphase) 邁 進 。 (Musacchio and Hardwick, 2002; Vermeulen, K et al., 2003)。
第三節、細胞凋亡
(一)細胞凋亡簡介
細胞分裂與死亡是每一個細胞必經之路，1972 年 Kerr 等提出 了兩種細胞死亡的形式(Kerr et al., 1972)，一種為大家所熟知的細 胞壞死(necrosis)另一則為程式性細胞死亡(programmed cell death, PCD)，現在稱為細胞凋亡(apoptosis)。細胞凋亡(apoptosis, 源自
希臘文，形容枯葉凋零掉落的現象)，代表生命自然老化死亡的
結束。目前已知這死亡方式是受到嚴密的機制監控，在多細胞生 物體生長及胚胎發育扮演維持正常生理代謝的角色，控制著組織 間的發展與恆定(Schultz, et al., 2003)。
當受到內在生理因素，如人類胚胎發育期手腳趾間的蹼組織 或內層老化皮膚演變為外層角質，其反應與細胞增殖間的平衡關 係(Alenzi et al., 2004)便會自動凋亡結束生命，此外受到外來因子 刺激，而造成細胞、DNA 的損傷與突變，例如 UV 輻射(Lippens et al., 2009) 、抽煙(Massion et al., 2003)或未完成複製病毒之感染 (Fischer et al., 2007)，為了防止危害鄰近細胞和突變遺傳到隔代以 利於其他正常細胞生長，亦會誘導細胞走向細胞凋亡方式死亡。
因此細胞凋亡控制著多細胞生物體，不論是生理或病理環境刺激 下，清除有害、損傷和多餘的細胞來達到自我保護的調節機制 (Voll et al., 1997;Dlamini et al., 2004)。然而細胞壞死一樣走向死 亡，過程卻極為慘烈，當細胞受到強烈理化或生物因素的刺激，
如強鹼酸、燒燙傷、劇毒等所以引起的被動性死亡，表現粒線體 以及其他細胞器腫大、細胞膨脹、導致細胞膜破裂等形態變化與 染色體DNA 被切成不均等的片段生化特徵(表 I)；相較於細胞凋 亡顯著溫和有秩序有階段性的死亡表現，當細胞開始以細胞凋亡 方式死亡時，外觀型態上出現細胞與各胞器萎縮(cell shrinkage)、
膜 空 泡 化 (membrane blebbing) 以 及 染 色 質 濃 縮 (chromatin condensation)成新月狀，接著細胞核崩裂(nuclear collapse)並持續萎 縮空泡化，以水泡出芽(Budding)方式，逐漸形成凋亡小體(apoptoic body)，而凋亡小體所包覆的內含分解的胞質、胞器或核碎片，整 個過程內容物不四散，最後由巨噬細胞吞噬(Fadeel et al., 2003)，
因此也不會引起發炎反應(圖 III)。此外三種明顯的生化特徵在凋 亡初期細胞內膜磷脂醯絲氨酸(phosphatidyl serine, PS)會翻轉至外 膜、凋亡蛋白酵素的活化(Janicke, et al. ,1998)以及於核酸內切酶作 用下，DNA 會以核小體為單位斷裂(DNA fragmentation)，經洋菜 膠(agarose gel)電泳法會於膠體上呈現 180~200 base pair或其倍數 的階梯狀的片段(Nagata, S et al.,2000; Liu et al., 2006)。
表I、細胞凋亡與細胞壞死特徵. (Fishelson et al., 2001)
圖III、細胞凋亡與細胞壞死示意圖. (Kerr et al., 1995)
(二)細胞凋亡調控
當細胞決定走向細胞凋亡時，會有一連串的對應調控蛋白活 化，其中占據中心地位的為半胱胺酸天冬胺酸特異性蛋白酶 (cysteine aspartate-specsific protease, Caspase)，命名由來為因具有 半胱胺酸(cysteine)活性作用位置，開頭便為C，且特異性(specsific) 辨識天冬胺酸殘基(aspartate residue)後面位置切割，此為aspase，
故取名為Caspase (Alnemri, E et al.,1996)。Caspase是一個龐大的半 胱胺酸蛋白酶家族，之所以如此重要，因為是許多凋亡信號的共 同路徑，也是決大部分細胞凋亡最終路徑。Caspase通常以無活性 之酶原形式(Procaspase)存在於細胞內，結構為25-53 kDa，由 Prodomain(3-24 kDa) 、 Large subunit(17-21 kDa) 、 Samll subunit(10-13 kDa)組成(Nicholson et al., 1999)，當Caspase需要活化 便會特異性的切割Prodomain與Large subunit間；Large subunit和 Samll subunit間的aspartate residue後位置，一旦切割分離Prodomain 後，Large subunit和Samll subunit會組成二聚體(heterodimer)然後再 結合成四聚體(tetramer)，這時Caspase是具有活性的，當Caspase 活化後會產生級聯反應(caspase cascade)，也就是活化的Caspase會 互相催化並往下游放大效應。目前共有十四種Caspase被發現(Shi, Y et al.,2007)，但與細胞凋亡有關的目前發現有七種(Riedl and Shi, 2004)，依功能分為兩類，(一)起動caspases (initiator caspases)：有 caspases-8、Caspase-10、Caspase-9、Caspase-2，此種Caspase位居 上游與對應凋亡路徑之承接蛋白(adaptor protein)有相同結合區 域，caspases-8、Caspase-10有死亡效應區域(death effector domain, DED)，而Caspase-9、Caspase-2則有凋亡蛋白酶募集區域(caspase recruitment domain, CARD)，當接受凋亡信號並與承接蛋白結合 後，便開始被活化與啟動級聯反應，而且也繼續催化下游的 caspase ； ( 二 ) 執 行 caspase (effector caspase) 又 稱 劊 子 手 (Executioner)：有caspases-3、Caspase-6、Caspase-7，此類caspase
為執行細胞凋亡之動作，經上游caspase活化後，除了會產生更大 級聯反應外，也會進一步切割下游目標蛋白底物(caspase substrates) 使細胞結構解體邁向死亡，依常見細胞凋亡現象大致有下列幾項 底物：1.切割核酸內切酶抑制物 (inhibitor of caspase-activated DNase, ICAD) ， CAD/ICAD 因 而 分 離 造 成 核 酸 內 切 酶 (Caspase-activated DNase, CAD)活化，使DNA遭受降解，DNA斷 裂(DNA fragmentation)現象也因此出現。2.DNA修復因子失活，
如切割多聚ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase, PARP) 與DNA依賴性激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)使細 胞 失 去 修 補DNA 功 能 。 3. 核 纖 層 蛋 白 (Lamins) 和 凝 溶 膠 蛋 白 (Gelsolin)與肌動蛋白(Actin)等遭切割後會細胞結構改變，產生染 色質濃縮(chromatin condensation)、胞器萎縮(cell shrinkage)、膜空 泡化(membrane blebbing)逐漸形成凋亡小體(Apoptotic dodis)。4.
此外還有很多目標底物，如影響細胞訊息傳導Protein kinase C或 MEKK-1 ， 而 細 胞 週 期 阻 滯 的 為 視 網 膜 母 細 胞 瘤 蛋 白 (Retinoblastoma protein, RB)和(mouse double minute-2, MDM2) (Stroh and Schulze-Osthoff, 1998; Nancy, A et al.,1998)。
目前研究較為透澈的細胞凋亡路徑分為（一） 內在路徑 (intrinsic pathway)，又稱為粒線體凋亡路徑(mitochondria apoptosis pathway)(圖IV)。當細胞遭DNA損傷、活性氧化物、死亡受體家族 蛋 白 活 化 導 致 粒 線 體 接 收 到 凋 亡 訊 息 時 ， 首 先 受 到(B cell lmphoma/leukemia-2; Bcl-2)家族蛋白的調控，從文獻得知Bcl-2家 族 依 功 能 分 為 抗 凋 亡 蛋 白(Antiapoptotic protein) ： 有 Bcl-2 、 Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-w、A1/Bfl1等以及促凋亡蛋白(Proapoptotic protein)：有Bax、Bak、Bid、Bad等(Leibowitz and Yu, 2010)，一 般 情 況 下 會 互 相 以 同 源 二 聚 體(homodimers) 的 型 式 結 合 ( 如 Bcl-2/Bcl-xL、Bcl-2/Bcl-2、Bax/Bax)，抗凋亡蛋白會停留於粒線 體外膜上穩定膜通透性，具阻止細胞凋亡功能(Kluck et al.,1997)，
而促凋亡蛋白則游離於細胞質內，當受到凋亡訊號活化便會轉位 (Translocation)至粒腺體外膜上與抗凋亡蛋白結合形成異源二聚體
(heterodimers)(如：Bcl-2/Bax、Bcl-xL/Bax)抑制抗凋亡蛋白活性，
細 胞 的 死 亡 與 否 決 定 於 兩 者 競 爭 結 合 比 例 決 定(Oltval, Z et al.,1997)，若走向細胞凋亡路徑，促凋亡蛋白會促使粒線體外膜形 成孔洞(permeability transition pore, PT pore)，使膜通透性改變，粒 線體穿膜電位(mitochondria membrane potential, ΔΨm)下降，大量 氧化物(reactive oxygen species, ROS)生成並累積加大細胞傷害 (Huang, J et al.,2009)，此外細胞色素C(cytochrome C, cyt.c)會釋放 到細胞質中與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1) 、 (deoxy-Adenosine Triphosphate, dATP) 以 及 Procaspase-9形成凋亡體(Apoptosome) ，同時Caspase-9活化進一步 活化effector caspase (Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)，細胞最終 引發細胞凋亡走向死亡(Adams and Cory, 2002; Alenzi et al., 2010)。
（二）外在路徑(extrinsic pathway)，又稱為死亡受體凋亡路徑 (Death receptor pathway)(圖 V)。細胞除了內部能引發細胞凋亡 外，也可藉由外部細胞膜上的死亡受體(
I
Death receptors, DR)來引 起細胞凋亡訊號，目前在細胞膜上發現屬於腫瘤壞死因子受體家 族(Tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFR superfamily)且 能調控細胞凋亡的受體，共四種有(Tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1 又稱DR1, CD120a, p55 and p60)、(CD95/Fas, 又稱 DR2、
APO-1 ) 、 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1, TRAILR1, 又稱DR4、APO-2)、(TRAILR2, 又稱DR5、KILLER 、 TRICK2) ， 這 些 受 體 N 端 皆 有 富 含 半 胱 胺 酸 區 域 (cysteine-rich domains, CRDs)具穩定蛋白分子作用，而C端於細胞質內含有死亡 區域(Death domain, DD)，首先當接收到死亡訊號時，其對應的配 體 腫 瘤 壞 死 因 子 家 族(Tumor necrosis factor superfamily, TNF superfamily)，有(Fas/CD95 ligand, FasL/CD95L)、(Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)、(Tumour necrosis factor, TNF)會與對應受體配對形成聚合體(oligomerization)並活 化，如(FasL/CD95L- CD95/Fas)、(TRAIL- TRAILR1 與TRAIL-
TRAILR2)、(TNF-TNFR1)，同時吸引承接蛋白與其(Death domain, DD)結合位結合，除了(TNF-TNFR1)先與(TNF-R1 associated death domain protein, TRADD)結合外，接著分別會與(Fas associated protein with death domain, FADD)結合，FADD除了含有(Death domain, DD)也具有(death effector domain, DED)結合位，因此也吸 引(Procaspase-8 或Procaspase-10)與其DED結合，此時形成了死亡 誘導訊息複合體(death inducing signalling complex, DISC)，一旦 caspases-8、Caspase-10 活化後，會繼續活化Caspase-3 引發細胞凋 亡，另外caspases-8、Caspase-10 活化也可能會活化Bcl-2 family中 促凋亡蛋白的Bid，將其切割成具有活性(truncated ,tBid)後，進一 步於粒線體外膜上與抗凋亡蛋白結合抑制其活性並促進促凋亡蛋 白活化(Lovell et al.,2008)，最後導致粒線體釋放cytochrome C引發 粒線體凋亡路徑(Bhardwaj and Aggarwal, 2003; Lavrik et al., 2005;
Kantari and Walczak, 2011)。
圖IV、Pathways of Apoptosis Signal Transduction.。
(Alenzi et al., 2010)
第四節、肝癌簡介
肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)、簡稱肝癌，在台灣 十大死亡疾病仍居於榜首之位(衛生署，2011)。根據世界衛生組 織統計(World Health Organization, WHO)每年全球大約有 62.6 萬 肝癌新例(發生率 5.7%)，然而存活率只有 3~5%(致死人數 59.8 萬)，世界常見惡性腫瘤(癌症)排名第六，好發於開發中的國家主 要集中於亞洲地區 (Parkin et al., 2005)，上述統計來看肝癌非常具 有攻擊性(aggressive)，發生與致死人數幾乎相近(Hussain et al., 2009) ，是一個非常恐怖的疾病。引發肝癌主要以 B、C 型病毒 性肝炎患者為首，其次為慢性肝病患者，如:肝硬化、肝纖維化、
脂肪肝，其他還有黃麴毒素(aflatoxin)、胰島素抵抗患者(insulin resistance).以及近來年逐漸上升的酒精(alcohol)都是危險族群 (Yip, et al., 2006; Liu et al., 2007; Alter et al., 2007; Gomaa et al., 2008)。目前治療肝癌常使用外科手術、化學療法(chemotherapy)、
免疫療法(immunotherapy) 、放射線療法或合併療法等來治療肝腫 瘤，但是卻沒有一個方法能有效的根除癌細胞，使其不再復發或 轉移，甚至造成患者極大的痛苦與副作用。因此回歸自然從天然 物中找尋有效與最安全的化合物作為癌症化學預防劑來治療癌症 為首要工作(Dorai et al., 2004).
第五節、五爪金英之相關研究
（一） 、五爪金英簡介
五爪金英 Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gary 是一種多年生 的菊科(Compositae)植物（圖 V），又稱小向日葵、提湯菊、假向 日葵、腫柄菊、王爺葵、金花菊。原產地來自墨西哥，至今生長 遍布於非洲、澳洲、亞洲以及北美國家，在台灣生長海濱至海拔 一千公尺陽光充足之處(Wu, et al., 2001)。
五爪金英在民間傳統使用上，依照部位有不同之功效，葉部 具有清熱解毒，消腫止痛、治療急、慢性肝炎、B 型肝炎、黃疸、
急性腸胃炎、膀胱炎、瘡傷腫毒效用；根及莖具有消炎，解毒、
治療急性肝炎、青春痘、癰腫毒瘡、糖尿病、瘧疾(Tona, et al., 1998)、婦女經痛(Kuroda, et al., 2007)效用。書中記載，民間食療 法中取五爪金英莖葉一把，水煎加黑糖服用，用以治療肝炎；取 適量之五爪金英、猪薟草、小山號葡萄、土牛膝、耳鉤草、馬鞭 草、黃水茄、蒼耳根、化石草、大風草、青果根，水煎服，用以 治療肝癌(Chiu, et al., 1992)。
圖V、五爪金英(Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gary)圖。 (Chiu, et al., 1992)
（二） 、五爪金英生物活性與成分
如今已有不少的藥理活性研究報告進一步印證過去先人的智 慧。有研究發現五爪金英地上部之水粗萃物能降低經由鹿角菜膠 (carrageenan)誘發老鼠足蹠浮腫體積與四氯化碳(CCl4)誘發老鼠 急性肝損傷，有效降低 GOT、GPT 值的作用(Lin, et al., 1993)；五 爪金英葉部乙醇粗萃物(濃度 50~200mg/kg)同樣能降低經由鹿角 菜膠(carrageenan)誘發老鼠足蹠浮腫體積與減少棉球誘導老鼠肉 芽腫的重量，另外在鎮痛試驗中，顯示在熱板測痛法能增加老鼠 對熱刺激的反應時間與福馬林舔足試驗中，不論是early phase 或 late phase 均有抑制小鼠舔足的時間(Owoyele, et al., 2004)；由上述 證實五爪金英具有保肝與抗炎以及鎮痛的活性。
五爪金英地上部之熱水粗萃物，發現在濃度小於 100g/ml 下，能抑制第一型和第二型單純皰疹病毒（HSV-1 和HSV-2）的活 性，保護50％以上細胞未因感染而死亡(Chiang, et al., 2004)；另 一學者也研究發現五爪金英地上部之水粗萃物，具有抗HIV-1 病 毒的活性(Cos, et al., 2002)。奈及利亞學者以五爪金英葉部之水與 乙醇粗萃物進行老鼠動物實驗，顯示感染後餵食萃取物能清除老 鼠體內50％及 70％的寄生蟲，若感染前餵食萃取物能減緩老鼠寄 生蟲血症(parasitemia)症狀且延長其壽命(Oyewole, et al., 2008)。比 利時學者研究發現五爪金英葉部之水粗萃物，能有效抑制阿米巴 原蟲(Entamoeba histolytica)的生長 (Herrera, et al., 2007)。將五爪 金英乙醇粗萃物餵食第二型糖尿病鼠(KK-Ay Diabetic Mice)，顯示 能夠降低老鼠血糖值並能減低胰島素阻抗(insulin resistance)改善 血糖代謝功能(Miura, et al., 2005)。此外五爪金英葉部之甲醇粗萃 物 對 急 性 骨 髓 血 癌 細 胞 (HL-60) 也 具 有 細 胞 毒 性 (ED50=15g/ml)(Kuo, et al., 1997)。
至今五爪金英已經被發現不少的化合物，主要以萜類化合物 (Terpenoids)、黃酮類(flavonoid)為主(表II)。其中有些成分被證實
具抗癌活性。如 1β-methoxydiversifolin(IC50=0.13M)毒殺急性骨 髓血癌細胞(HL-60)效果，比Etoposide (IC50=0.43M)高出許多 (Kuroda, et al., 2007) 。 tithofolinolide, 3β-acetoxy-8β-isobutyryloxyreynosin,
4α,10α-dihydroxy-3-oxo-8β-isobutyryloxyguaia-11(13)-en-12,6α-olid e 有 誘 導 急 性 骨 髓 血 癌 細 胞(HL-60) 分 化 作 用；tagitinin-C, 1β,2αepoxytagitinin C 抑 制 人 類 結 腸 癌(col2) 增 生 (Gu et al., 2002)。同時Tagitinin-F對人類肝癌細胞 HepG2 具有細胞毒性(IC
具
能
50
6.5×10-5 mg/ml) (Wu, et al., 2001)。
表 II、五爪金英化學成份
Compound Acetyltagitinin E
Tagitinin-F Tagitinin C
2α-hydroxytirotundin Tithofolinolide
3α-acetoxydiversifolol
3β-acetoxy-8β-isobutyryloxyreynosin 1β,2αepoxytagitinin C
4α,10α-dihydroxy-3-oxo-8β-isobutyryloxyguaia-11(13) -en-12,6α-olide
3α-acetoxy-4α-hydroxy-11(13)-eudesmen-12-oic acid methyl ester
17,20-dihydroxygeranylnerol Tagitinin A
Tirotundin
Tirotundin 3-O-methyl ether
1α-hydroxytirotundin 3-O-methyl ether Deacetylviguiestin
1β-methoxydiversifolin
1β-methoxydiversifolin 3-O-methyl ether
1α-hydroxydiversifolin 3-O-methyl ether
4β,10α-dihydroxy-3-oxo-8β-isobutyroyloxyguaia-11(1 3)-en-6,12-olide
4β,10β-dihydroxy-3-oxo-8β-isobutyroyloxyguaia-11(1 3)-en-6,12-olide
Terpenoids
1,3-dihydroxy-3,10-epoxy-8-(-2-methylpropanoyloxy)-
germacra-11(13)-ene-6,12-olide (1)
1,3-dihydroxy-3,10-epoxy-8-(2-methylpropanoyloxy)- germacra-4,11(13)-diene-6,12-olide (2)
1,3-dimethoxy-3,10-epoxy-8-(2-methylpropanoyloxy)- germacra-4,11(13)-diene-6,12-olide (3)
1-hydroxy-3-methoxy-3,10-epoxy-8-(2-methylpropano yloxy)-germacra-4,11(13)-diene-6,12-olide (4)
1-acetyltagitinin A
8β-isobutyryloxycumambranolide
Methy 4α-hydroxy-11(13)-eudesmen-12-oate Diversifolol
Luteolin Nepetin flavonoids
Hispidulin
(Kuo, et al., 1997; Kuo, et al., 1998; Wu, et al., 2001; Gu, J. Q, et al., 2002; Kuroda, et al., 2004; Herrera, et al., 2007; Ragasa, C, et al., 2008)
第貳章 研究目的
肝癌之所以發生率如此高，主要是因為肝臟是更新與修復受 損細胞以維持人體正常解毒與代謝的器官。如前文所述，正常情 況下細胞會不斷的分裂與死亡，而當如長期受到某些致癌因素刺
激，造成肝臟的受損，極可能DNA 因此突變，如此一來一往形成
肝腫瘤的機率就相當大。有鑒於目前治療肝癌方法有限，從植物 不論是粗萃或分離取得的成分物質，希望能夠從中尋找有效且安 全，能夠讓癌細胞以細胞凋亡方式死亡，進一步抑制癌細胞增殖 的化合物為本論文研究目的。
實 驗 所 挑 選 使 用 的 植 物 為 五 爪 金 英 Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gary。五爪金英在民間傳統偏方使用以全草來治療 急、慢性肝炎、B 型肝炎與肝癌，具有清熱解毒等效用。最早於 1993 年 Lin 以動物實驗證實五爪金英水萃取物在四氯化碳(CCl4) 誘導急性肝損傷下，具有保肝，抗發炎活性作用。近幾年Wu(2001) 發表的報告也指出分離自五爪金英之 Tagitinin-F 能抑制人類肝癌 細胞 (Hep-G2)生長的活性。除此之外，目前尚未有任何相關五爪 金英涉及肝癌細胞凋亡相關機制之研究。
本論文建立以人類肝癌細胞 HepG2 為肝癌篩選模式。實驗初 步證實五爪金英葉部之乙酸乙酯層 Td-L-EA 具有毒殺作用，將其 萃取物經管柱層析法，篩選出五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第 二分劃Td-F2 具有更強抑制人類肝癌細胞株 Hep-G2 生長外，且具 有選擇性毒殺作用，因此未來進一步的來探討此分劃是否具有誘 導細胞凋亡的活性，期待五爪金英不再僅使用於民間偏方，而能 作為具有潛力的化學預防劑，造福全球數百萬肝癌的病患。
第参章 材料與方法
第一節、實驗架構
細胞細胞毒毒性性試試驗驗 MMTTTTaassssaayy 乙酸乙酯
成分萃取分離與追蹤 葉部
DNA 片段化分析
細胞週期分析 細胞凋亡免疫酵素分
細胞型態觀察 細胞試驗
矽膠管柱層析法
五爪金英
篩選活性分劃(Fraction)
西方墨點法
第二節、實驗材料
（一） 、實驗藥品及試劑
1.萃取試劑
Ethyl acetate、n-butanol、n-hexane、methanol (Riedel-de Haën, Germany)
2.活性試驗
Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, USA)、Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche, Germany) 、Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Germany) 、 Phosphate-buffered saline (PBS) (Gene Mark,Taiwan) 、Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) (Gibco, USA) 、 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-zyl-)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide) (Sigma, USA) 、Penicillin-Streptomycin Solution (Gibco BRL, USA) 、 Bio-Rad Protein Assay (500-0006, Bio-Rad Laboratories, USA) 、 Sodium bicarbonate (NaHCO3) (AMRESCO,USA) 、Tris (AMRESCO, USA) 、Triton X-100 (Sigma, USA) 、NaCl (AMRESCO,USA) 、Trypsin-EDTA (Gibco BRL, USA) 、Proteinase K (FOCUS, USA) 、Propidium iodide (PI) (Sigma, USA) 、Ethidium bromide (EtBr) (Sigma, USA) 、Fetal bovine serum(Gibco BRL, USA) 、 Agaros (AMRESCO, USA) 、 Amphotericin B (fungizone) (Sigma, USA) 、Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma, USA) 、Ponceau S Red (Sigma, USA) 、Acetic acid (Fluka, UK) 、Mammalian Protein Extraction Buffer (MPEB) (GE Healthcare, USA) 、Polyvinylidene difluoride PVDF (Millipore, USA ) 、Pre-stained Marker (Bioman, Taiwan) 、Tween 20 (Merck, Germany) 、Tetramethylethylenediamine (TEMED) 、Trypan blue solution (Bioman, Taiwan) (Bio-Rad, USA) 、Amersham ECL Plus™
Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, USA) 、 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) (Sigma, USA)、Rnase A (BBI, USA)。
3.抗體
一級抗體 MW 來源 廠商 批號 稀釋倍數
Caspase 8 57,43,18 Mouse Cell signaling 9746 1：1000 Caspase 9 47,37,35 Mouse Cell signaling 9508 1：1000 Caspase3 35,19,17 Mouse Cell signaling 9668 1：1000 PARP 116/89 Rabbit Cell signaling 9532 1：1000 Bcl-xL 30 Mouse Santa Cruz Sc-8392 1：500
Bax 24 Mouse Santa Cruz Sc-7480 1：500
-Actin 43 Mouse Santa Cruz Sc-4778 1：8000 二級抗體
Anti-rabbit Goat Santa Cruz Sc-2004 1：5000 Anti-mouse Goat Santa Cruz Sc-2005 1：5000
（二） 、儀器與設備
1.層析裝置
Silica gel (E. Merck, 0.063-0.2 mm mesh) 、TLC plate Kieselgel 60 F254 (E. Merck, 0.2 mm)
2.萃取儀器
減壓濃縮機(BÜCHI, rotavapor R-220, water bath B-490) 、UV 觀察 箱(Compact Cabinet, C10) 、恆溫冷凍循環水槽(Firstek, B403H) 、 真 空 幫 浦(Vacutronics, DP-90VH) 、 超 音 波 震 盪 器 (Branson, 8200) 、高速研磨機(台灣榮聰鐵工廠，RT-08) 、恆溫循環水槽 (Wisdom, ECB-6) 、 烘 箱 (Kuan sheng, KS-21) 、 冷 凍 乾 燥 機 (Panchum, FD-0240) 、精密電子天平(Mettler Toledo, AB 204)
3.活性檢測相關儀器
低 溫 離 心 機(Kubota, 2800, Japen) 、 細 胞 培 養 箱 (Revco, RCO3000T) 、倒立顯微鏡(Olympus, CKX41, USA) 、ELISA 分 析儀 (Bio-Tek, ELx800, USA) 、凝膠成像系統(Bio-Rad Gel Doc XR Systems, USA) 、化學發光成像系統(Bio-Rad ChemiDoc XRs Systems, USA) 、量化軟體 (Bio-Rad, Quantity One, USA) 、流氏 細胞儀(Becton Dickinson Immunocytometery Systems, USA) 、半乾 式轉漬器(Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell) (Bio-Rad, USA)、電源 供應器Model 200/2.0 power supply (Bio-Rad, CA, USA)。
第三節、實驗方法
(一)、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法
五爪金英(購自屏東惠明中藥行)乾燥葉片 15 kg，經研磨後秤 取13.5 kg乾燥粉末，以 100 L乙酸乙酯有機溶液室溫下浸泡 3 天，
重複萃取 8 次，分別將有機溶劑萃取液以布氏漏斗抽氣過濾後，
以減壓濃縮機在42 ℃下濃縮移除溶劑，濃縮後之粗萃物再進行真 空冷凍乾燥將水分完全抽乾，得到乙酸乙酯層，以矽膠(silica gel) 分離進行柱相層析，並分別以正己烷(hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate) 、 甲 醇 (methanol) 為 溶 媒 進 行 梯 度 沖 提 分 為 6 個 fraction(Td-F1、Td-F2、Td-F3、Td-F4、Td-F5、Td-F6)(圖一)，經 真空冷凍乾燥將水分完全抽乾，密封存放於-20℃凍箱，供細胞活 性試驗用。供試藥物以DMSO配置存放於室溫，添加於培養基中 DMSO之最終濃度不超過 0.25％。
葉片(13.5 kg)
乙酸乙酯萃取(100L)
（每次浸泡3天，共8次）
乙酸乙酯抽出物
矽膠管柱層析法
(6:4) (4:6) (2:8)
TdF5 TdF6 TdF1
正己烷/乙酸乙酯 正己烷/乙酸乙酯 正己烷/乙酸乙酯 乙酸乙酯
TdF3 TdF4 (8:2)
正己烷/乙酸乙酯 甲醇
TdF2
圖一、五爪金英乙酸乙酯層萃取與管柱層析法流程圖。
(三)、細胞培養
本論文使用兩種細胞株，一為人類肝癌細胞HepG2(Aden et al., 1979)，以此細胞進行五爪金英萃取物抗腫瘤作用之探討及活性成 分的追蹤。另一為肝臟正常細胞Chang live cell(Chang et al., 1954) 購自食品工業發展研究所(Food Research and Development Institute, Hsin Chu, R.O.C)，以此細胞株做為五爪金英萃取物之正常細胞毒 性對照組。
HepG2 及 hang liver cell細胞分別培養於含 10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)的 DMEM培養基中。每毫升的培養基內 添加 00 I.U.青黴素 (penicillin)、100g鏈黴素(streptomycin)、2.5g 防治黴 (fungizone)、2 mM麩氨酸(L-glutamine)及 100M之非必需 性氨基酸(non-essential amino acid，包括 14.7g glutamic acid, 7.5g glycine, 8.9g alanine, 13.3g aspartic acid, 11.5g proline, 15g asparagine及 10.5g serine)，以上稱完全培養基，置於含 5% CO
C
1
2
的37℃ 培養箱中。
(四)、細胞毒性試驗 MTT assay
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-zyl-)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide)是一種黃色的染劑，會被活細胞所吸收並經由粒線體中的 succinate dehydrogenase 還原成藍紫色的 formazan，可用來檢測細 胞存活與生長變化。
在96 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 2 × 104細胞，培養 於 5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新培養 基，同時給予(100、50、25、12.5、6.25、3.125、(Td-F2)1.5625 g/mL) 之供試藥物，每個劑量三重複。給藥處理 24、48 小時後，盤中留 下 100µl培養液，加入 25µL含有 5 mg/mL MTT溶液，放回 5%
CO2，37℃incubator中 4 小時，再移除培養液加入 100µL的 DMSO
於室溫下震盪 5 分鐘，待紫色結晶完全溶解後，在 540nm測定吸 光值，將不同處理後之吸光值扣除空白組吸光值後，帶入下列公 式以求得細胞存活率Cell viability(%)。
Cell viability(%)=[OD540(sample) / OD540(control)] ×100%
(五)、細胞型態觀察
在24 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 3 × 105細胞，培養 於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新培養 基，同時給予Td-F2(12.5、6.25、3.125、1.5625g/mL)之供試藥物，
給藥處理24 小時後，以倒立顯微鏡觀察細胞型態並拍照紀錄。
(六)、DNA片段化分析
在 6 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 8 × 105細胞，
培養於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新 培養基，同時給予Td-F2 (12.5、6.25、3.125、1.5625 g/mL)之供 試藥物。給藥處理 24 小時後，將well內細胞液全部吸至離心管 (eppendorf)，若為貼附細胞需先以trypsin-EDTA取下。首先以 1,500 rpm離心 5 分鐘，再將上清液移至新的離心管，以 13,000 rpm離心 5 分鐘，兩管所取得的細胞pellet均以 1X PBS沖洗一次後，加入 400μL extraction buffer(50mM, pH 8.0、 Tris-HCl、10mM EDTA, pH 8.0、0.3% triton x-100)沖散並混勻於同離心管內，放置冰上作 用30 分鐘後，加入 10μL RNase A(20mg/mL)於 55℃作用 30 分鐘 後，再加入8μL proteinase K(20mg/ml)在 55℃作用 30 分鐘。加入 等倍體積之phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25：24：1）混合 均勻，以13,000 rpm離心 30 分鐘，小心吸取上清液 300μL，並加 入 1/10 倍體積的 3M NaOAc 及 2 倍體積的絕對酒精，於-20℃
overnight。隔天以 13,000 rpm, 4℃離心 30 分鐘，去除上清液以 70%
酒精沖洗，適度乾燥後，溶解於 12μL 0.1X TE buffer(10mM,
pH8.0、Tris-HCl、1mM EDTA, pH 8.0))，利用 1.5% agarose gel(含 0.5μg/mL ethidium bromide)，以電壓 100V進行膠體電泳(agarose gel electrophoresis)分析，最後以凝膠成像系統(Bio-Rad Gel Doc XR Systems, USA)與Quantity One 4.6.2 分析軟體進行觀察拍照。
(七)、細胞凋亡免疫酵素分析法
在96 well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 2 × 104細胞，培養 於5% CO2，37℃ incubator中，待隔夜細胞充份附著，更新培養 基，同時給予Td-F2 (3.125、2.34、1.5625、1.17、0.78g/mL)之供 試藥物，每個劑量三重複。給藥處理24 小時後，依照說明書指示，
移除培養液，加入lysis bu fer 200µL，在室溫下反應 30 分鐘，隨 後離心(200 × g, 5 分鐘)，取上清液 20µL放置有streptavidin coat ed的microtiter plate，加入 80µL的immunoreagent(在 20 mL的imm unoreagent中含有 1 mL的Anti-DNA-POD和 1 mL的Anti-histone-bi otin及 18 mL的incubation buffer)並以 200 rpm的轉速震搖 2 小 時，移除上清液並以incubation buffer清洗三次，加入ABTS solut ion 100µL以 250 rpm的轉速避光震搖 10 分鐘，再以 405nm測定 吸光值(以上lysis buffer, immunoreagent, incubation buffer及ABT S solution均為Cell Death Cell Detection ELISA
f
(八)、細胞週期分析
在24well的細胞培養皿(petri-dish)，種入 3 × 105細胞，培養於 5% C
PLUSkit所附)。
O2，37 incubator℃ 中，待隔夜細胞充份附著，更新培養基，
同時給予Td-F2 (6.25、3.125、1.5625g/mL)與Podophyllotoxin (20
g/mL)之供試藥物。給藥處理 12、24 小時後，將well內細胞液全 部吸至離心管(eppendorf)，若為貼附細胞需先以trypsin-EDTA取 下。首先以4000 rpm離心 5 分鐘後，去除上清液以 1X PBS清洗，
加入1mL之絕對酒精於-20℃作用 2 小時。再利用相同離心條件去 除上清液以1X PBS清洗兩次，加入預先配置之 1mL PBS溶液(內 含0.1mg/mL RNase A、0.5 ％ Tritone X-100)於 37℃作用 1 小時，
再加入1mL 50g/mL PI於 4℃避光 30 分鐘，接著以 1X PBS清洗 二 次 後 ， 加 入 200L1X PBS 以 FACScan 流 氏 細 胞 儀 (Becton Dickinson Immunocytometery Systems USA,San Jose, CA)進行分析 細胞內DNA含量，每個處理組分析 10000 個細胞，最後以Modfit 3.0 分析軟體分析sub-G1 phase(apoptotic cells)與細胞週期百分比。
(九)、蛋白質電泳與西方墨點法
1.蛋白質萃取
培養皿(petri-dish)，種入 5 × 106細胞，培養於 5% C
Resolving gels (5mL) 在10cm的細胞
O2，37 incubator℃ 中，待隔夜細胞充份附著，更新培養基，
同時給予Td-F2 (6.25、3.125、1.5625g/mL)之供試藥物。給藥處 理 24 小時後，首先去除上清液以 1x PBS清洗細胞，再以刮刀取 下細胞收集至離心管內，以4000 rpm離心 5 分鐘取得細胞Pellet，
加入新鮮配置之 800 L Lysis buffer 【每 500L Mammalian Protein Extraction Buffer (MPEB)添加 20L蛋白酶抑制劑( 1 粒 Protease inhibitor cocktail tablets以 2 mL三次水配置並分裝，於 -70℃凍箱存放)】，於冰上作用 30 分鐘，中途每 10 分鐘震盪 30 秒後，以液態氮(5 秒)與 37℃溫水(溶至小冰塊)來回交替 5 次幫助 細胞裂解，最後於4℃ 以 12000 rpm離心 30 分鐘後，取得之上清 液便為細胞總蛋白質(total protein)，經Bio-Rad Protein Assay reaget 測定白質之含量，分裝後於-70℃凍箱存放供日後實驗用。
2.蛋白質電泳
膠體濃度 8％ 10％ 12％
H2O 2.3 1.9 1.6
30％ acrylamide mix 1.3 1.7 2.0
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 1.3 1.3 1.3 10％ SDS 0.05 0.05 0.05 10％ ammonium persulfate 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.003 0.002 0.002
Stacking gels (4mL)
膠體濃度 5％
H2O 2.7
30％ acrylamide mix 0.67 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8) 0.5
10％ SDS 0.04
10％ ammonium persulfate 0.04
TEMED 0.004
取等量的蛋白質(30、50g)與 2X sam ffer 混勻(V:V)，
以10
泡在Trans buffer(Glycine 39 mM、Tris 48 mM、
在 Blocking solution【2g non-fat dry milk 溶於 ple bu
0℃加熱 5 分鐘於室溫冷卻後，每 well 中注入 20L 樣品，便 可進行電泳分析，一開始電壓調至 60V，直到樣品通過 Stacking gel，再將電壓調至 120V，以 Prestained Protein Marker 分子量為標 準，當樣品跑到底部即可結束並進行轉印。
3.西方墨點法 首先把gel取出浸
SDS 0.0375％ w/v、Methanol 20％ ) 30 分鐘，接著將 8 張 3MM filter paper以Trans buffer浸泡沾濕，PVDF膜以Methanol濕 潤，依序由下到上放置 4 張 3MM filter paper、PVDF膜、gel、4 張3MM filter paper於Bio-Rad semi dry上(正負電極板需先以濕潤 Trans buffer之Kimwipes擦拭轉印位置)，並注意是否有有氣泡，再 依PVDF膜面積換算電流(7 cm×8 cm×5.5=310 mA/cm2)，電壓不超 過25V，時間 15~30 分鐘，轉印結束後以二次水清洗PVDF膜，若 需看轉印效果可用Ponceau S red預染PVDF膜觀察，再以二次水清 洗即可。
將PVDF 膜浸泡
18 m
呈
(十)、統計分析
實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean
L TBST buffer(Tris 50mM pH7.5、NaCl 150mM、Tween-20 0.2
％)】中，並封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘後，以 TBST 清洗 PVDF 膜 5 次，每次 10 分鐘，接著再浸泡於配置適當比例之一級 抗體，並封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘後，以 TBST 清洗 PVDF 膜5 次，每次 10 分鐘， 最後配置適當比例之二級抗體(horse-radish peroxidase)，同樣封口固定於摩天輪上旋轉 90 分鐘，以 TBST 清 洗 PVDF 膜 5 次，每次 10 分鐘，即可加入 1 mL ECL 呈色劑 (solution A: solution B,40:1) 色反應 1 分鐘，最後以化學發光成 像系統(Bio-Rad ChemiDoc XRs Systems, USA)與 Quantity One 4.6.2 分析軟體進行觀察拍照。
)來表示。數據分析以Student’s t-test 來比較組別間的差 異，當統計結果p＜0.05 時，則認為有統計意義。
第肆章 結果
(一)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物與不同分劃對人類
肝癌細胞株HepG2 細胞毒性之作用
將五爪金英乾燥葉片磨粉後以乙酸乙酯萃取，得到五爪金英 葉部之乙酸乙酯萃取物Td-L-EA，接著再利用矽膠管柱層析法，自 五 爪 金 英 葉 部 之 乙 酸 乙 酯 萃 取 物 Td-L-EA 離 出 6 個 fraction(Td-F1、Td-F2、Td-F3、Td-F4、Td-F5、Td-F6)，將萃取 物配置於DMSO中，添加於medium之DMSO最終濃度為 0.25%，
實 驗 中 藥 物 作 用 濃 度 為(100 、 50 、 25 、 12.5 、 6.25 、 3.125 、 (Td-F2)1.5625 g/mL)。經細胞毒性試驗MTT assay，由圖二顯示 隨著五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物Td-L-EA隨濃度增加，對細胞 存活率顯著下降， IC
分
50為 13.4g/mL。而圖三為經分離取得 6 個 fraction 之 IC50 分 別 70.54g/mL 、 3g/mL 、 7.97g/mL 、 34.11g/mL、61.19g/mL、77.14g/mL。上述實驗結果可知五爪 金 英 葉 部 之 乙 酸 乙 酯 萃 取 物 第 二 分 劃Td-F2 對人類肝癌細胞 HepG2 的抑制作用最好，也因此決定以五爪金英葉部之乙酸乙酯 萃取物第二分劃Td-F2 作後續的活性試驗。此外也再以人類正常肝 細胞Chang liver cell測試其是否對正常細胞具有細胞毒性，從圖四 實驗結果得知IC50為 12g/mL。以上不同濃度處理於兩細胞之細胞 存活率數據呈現於表一中。
由於決定以五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2
作後續的活性試驗，依實驗設計藥物處理時間最長不超過 24 小
時，便必須挑選在藥物處理時間 24 小時內對人類正常肝細胞
Chang liver cell低毒性且對人類肝癌細胞HepG2 有一定抑制作用 濃度之劑量作實驗，而圖五為所挑選之五爪金英葉部之乙酸乙酯 萃取物第二分劃Td-F2 濃度劑量(1.5625、3.125、6.25 g/mL)，處
理 24 小 時 對 人 類 肝 癌 細 胞 HepG2 之 細 胞 存 活 率 百 分 比 為 97.69±1.60%、67.33±3.31%、50.70±0.95%, IC50為6.7g/mL；而人 類 正 常 肝 細 胞 Chang liver cell 分 比 為 112.98±6.25% 、 107.69±7.35%、102.55±2.49%。另外不含藥物之DMSO於實驗結果 顯 示 皆 未 影 響 兩 細 胞 生 長 ， 其 百 分 比 區 間 為 94.40±1.48%~102.65±2.51%。
百
0 20 40 60 80 100 120
Td-L-EA
50 100 25
12.5 6.25
3.125
Concentration(g/mL)
*
Cell Viability (% of Control)
*
*
*
Control DMSO
圖二、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物 Td-L-EA 對人類肝癌細胞 HepG2 細胞毒性之作用。
不同濃度的Td-L-EA 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。
0 20 40 60 80 100
120 Control
DMSO Td-F1 Td-F2 Td-F3 Td-F4 Td-F5 Td-F6
Cell Viability (% of Control)
100 25 50
6.25 12.5 3.125 1.5625 Control DMSO
Concentration (g/mL)
圖三、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物不同分劃 Td-F1~Td-F6 對 人類肝癌細胞 HepG2 細胞毒性之作用。
不同濃度的Td-F1~Td-F2 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞 存活率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean)來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義
（p<0.05）。
0 20 40 60 80 100 120
Td-F2
50 100 12.5 25
3.125 6.25 1.5625
*
*
* *
*
Concentration (g/mL)
Control DMSO
*
Cell Viability (% of Control)
圖四、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 對人類正 常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作用。
不同濃度的 Td-F2 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。
表一、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物與不同分劃對人類肝癌細 胞 HepG2 與人類正常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作用表。
不同濃度的 Td-F2 處理 48 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。
HepG2
g/mL Td-L-EA Td-F1 Td-F2 Td-F3
1.5625 78.45±5.90%
3.125 103.42±3.99% 101.44±2.30% 39.43±3.59% 94.69±2.04%
6.25 82.13±8.69% 104.31±0.70% 25.52±2.84% 61.90±4.17%
12.5 52.11±0.77% 102.82±0.86% 19.78±0.54% 22.98±0.50%
25 23.73±0.74% 96.63±2.54% 14.41±1.66% 18.15±0.28%
50 19.11±2.11% 77.30±1.71% 2.72±0.34% 17.74±0.61%
100 7.22±0.28% 23.27±2.02% 1.71±0.36% 2.28±0.31%
DMSO 101.76±1.97% 97.52±3.71% 97.52±3.71% 97.52±3.71%
HepG2 Chang liver cell
g/mL Td-F4 Td-F5 Td-F6 Td-F2
1.5625 94.50±3.52%
3.125 95.76±2.43% 95.03±1.83% 98.19±3.13% 83.81±1.05%
6.25 99.45±0.76% 96.18±1.19% 98.55±1.32% 60.51±3.26%
12.5 86.97±7.83% 91.63±1.59% 96.05±2.82% 51.03±2.43%
25 65.53±4.71% 90.81±2.55% 99.63±1.50% 17.66±8.47%
50 31.96±1.51% 94.47±3.03% 93.89±6.01% 2.68±0.36%
100 5.34±1.27% 11.15±1.00% 16.97±3.48% 2.29±0.17%
DMSO 97.52±3.71% 97.52±3.71% 97.52±3.71% 102.56±6.46%
0 20 40 60 80 100 120
140 HepG2
Chang live cell
6.25 3.125
1.5625
*
*
Concentration (g/mL)
Control DMSO
Cell Viability (% of Control)
圖五、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 對人類肝 癌細胞 HepG2 與人類正常肝細胞 Chang liver cell 細胞毒性之作 用。
不同濃度的 Td-F2 處理 24 小時後，以 MTT assay 測定細胞存活 率。實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean±Standard error of mean) 來表示（n = 3）。*代表與 control 組比較起來有統計意義（p<0.05）。
(二)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處
理人類肝癌細胞HepG2 之細胞型態影響
人類肝癌細胞HepG2 是一種貼壁型細胞(adherent cell)，以顯 微鏡觀察，於正常生長情況下可看到圖六-A，其貼壁展開生長後，
細胞結構完整且呈多邊菱形，為細胞最健康之狀態。
由細胞毒性試驗MTT assay 實驗結果篩選出五爪金英葉部之
乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 為最有效抑制人類肝癌細胞
HepG2 生長，接著便以顯微鏡觀察給藥處理後之細胞型態變化。
當處理五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 24 小時 後，從圖六-C 可觀察到處理於濃度 1.5625g/mL 時，貼附細胞變 形 產 生 觸 角 ， 細 胞 逐 漸 萎 縮 ， 且 隨 著 處 理 濃 度 增 加(3.125 、 6.25g/mL) 圖六-D, -E，細胞逐漸萎縮死亡，且有空泡化現象，
並產生皺縮(如箭頭所指)。另外處理不含藥物之 DMSO 圖六-B 細 胞型態，於顯微鏡觀察下與未處理藥物之細胞圖六-A 外觀型態相 同，表示0.25% DMSO 並不影響細胞生長。
(A) Control (D) 3.125g/mL
(B) DMSO (E) 6.25g/mL
(C) 1.5625g/mL
圖六、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理人類 肝癌細胞 HepG2 之細胞型態影響。
不同濃度的Td-F2 處理 24 小時後，以倒立式相位差顯微鏡觀察。
(A) Control(B) DMSO(C) 1.5625g/mL(D) 3.125g/mL(E) 6.25g/mL.
(四)、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃Td-F2 處
理人類肝癌細胞HepG2 DNA片段化之作用
從前面實驗已知五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 能抑制人類肝癌細胞 HepG2 生長，外觀型態上與細胞凋亡 現象相似，接下來要更進一步鑑定細胞經五爪金英葉部之乙酸乙 酯萃取物第二分劃Td-F2 處理後，是以何種現象造成死亡。
當細胞以細胞凋亡方式死亡時，其最經典的現象為於核酸內 切酶作用下，DNA 會以核小體為單位斷裂(DNA fragmentation)，
經洋菜膠(agarose gel)電泳法會於膠體上呈現長度約為 180~200 base pair 或其倍數的階梯狀的片段。由圖七很明顯看到，五爪金
英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理於人類肝癌細胞
Hep-G2 24 小時後，隨著藥物濃度增加(12.5、6.25、3.125、1.5625
g/mL)，DNA 片段化現象越高劑量越明顯。
M 1 2 3 4 5 6
圖七、五爪金英葉部之乙酸乙酯萃取物第二分劃 Td-F2 處理人類 肝癌細胞 HepG2 DNA 片段化之作用。
不同濃度的 Td-F2 處理 24 小時後，收集細胞進行 DNA 萃取，最 後以洋菜膠電泳法分析。 (M) 100bp Marker；lane(1) Control；lane(2) DMSO；lane(3)12.5g/mL； lane (4)6.25g/mL；lane (5)3.125g/mL；lane (6)1.5625g/mL.
