細胞凋亡

(一)細胞凋亡簡介

細胞分裂與死亡是每一個細胞必經之路，1972 年 Kerr 等提出 了兩種細胞死亡的形式(Kerr et al., 1972)，一種為大家所熟知的細 胞壞死(necrosis)另一則為程式性細胞死亡(programmed cell death, PCD)，現在稱為細胞凋亡(apoptosis)。細胞凋亡(apoptosis, 源自

希臘文，形容枯葉凋零掉落的現象)，代表生命自然老化死亡的

結束。目前已知這死亡方式是受到嚴密的機制監控，在多細胞生 物體生長及胚胎發育扮演維持正常生理代謝的角色，控制著組織 間的發展與恆定(Schultz, et al., 2003)。

當受到內在生理因素，如人類胚胎發育期手腳趾間的蹼組織 或內層老化皮膚演變為外層角質，其反應與細胞增殖間的平衡關 係(Alenzi et al., 2004)便會自動凋亡結束生命，此外受到外來因子 刺激，而造成細胞、DNA 的損傷與突變，例如 UV 輻射(Lippens et al., 2009) 、抽煙(Massion et al., 2003)或未完成複製病毒之感染 (Fischer et al., 2007)，為了防止危害鄰近細胞和突變遺傳到隔代以 利於其他正常細胞生長，亦會誘導細胞走向細胞凋亡方式死亡。

因此細胞凋亡控制著多細胞生物體，不論是生理或病理環境刺激 下，清除有害、損傷和多餘的細胞來達到自我保護的調節機制 (Voll et al., 1997;Dlamini et al., 2004)。然而細胞壞死一樣走向死 亡，過程卻極為慘烈，當細胞受到強烈理化或生物因素的刺激，

膜 空 泡 化 (membrane blebbing) 以 及 染 色 質 濃 縮 (chromatin condensation)成新月狀，接著細胞核崩裂(nuclear collapse)並持續萎 縮空泡化，以水泡出芽(Budding)方式，逐漸形成凋亡小體(apoptoic body)，而凋亡小體所包覆的內含分解的胞質、胞器或核碎片，整 個過程內容物不四散，最後由巨噬細胞吞噬(Fadeel et al., 2003)，

因此也不會引起發炎反應(圖 III)。此外三種明顯的生化特徵在凋 亡初期細胞內膜磷脂醯絲氨酸(phosphatidyl serine, PS)會翻轉至外 膜、凋亡蛋白酵素的活化(Janicke, et al. ,1998)以及於核酸內切酶作 用下，DNA 會以核小體為單位斷裂(DNA fragmentation)，經洋菜 膠(agarose gel)電泳法會於膠體上呈現 180~200 base pair或其倍數 的階梯狀的片段(Nagata, S et al.,2000; Liu et al., 2006)。

表I、細胞凋亡與細胞壞死特徵. (Fishelson et al., 2001)

圖III、細胞凋亡與細胞壞死示意圖. (Kerr et al., 1995)

(二)細胞凋亡調控

當細胞決定走向細胞凋亡時，會有一連串的對應調控蛋白活 化，其中占據中心地位的為半胱胺酸天冬胺酸特異性蛋白酶 (cysteine aspartate-specsific protease, Caspase)，命名由來為因具有 半胱胺酸(cysteine)活性作用位置，開頭便為C，且特異性(specsific) 辨識天冬胺酸殘基(aspartate residue)後面位置切割，此為aspase，

故取名為Caspase (Alnemri, E et al.,1996)。Caspase是一個龐大的半 胱胺酸蛋白酶家族，之所以如此重要，因為是許多凋亡信號的共 同路徑，也是決大部分細胞凋亡最終路徑。Caspase通常以無活性 之酶原形式(Procaspase)存在於細胞內，結構為25-53 kDa，由 Prodomain(3-24 kDa) 、 Large subunit(17-21 kDa) 、 Samll subunit(10-13 kDa)組成(Nicholson et al., 1999)，當Caspase需要活化 便會特異性的切割Prodomain與Large subunit間；Large subunit和 Samll subunit間的aspartate residue後位置，一旦切割分離Prodomain 後，Large subunit和Samll subunit會組成二聚體(heterodimer)然後再 結合成四聚體(tetramer)，這時Caspase是具有活性的，當Caspase 活化後會產生級聯反應(caspase cascade)，也就是活化的Caspase會 互相催化並往下游放大效應。目前共有十四種Caspase被發現(Shi, Y et al.,2007)，但與細胞凋亡有關的目前發現有七種(Riedl and Shi, 2004)，依功能分為兩類，(一)起動caspases (initiator caspases)：有 caspases-8、Caspase-10、Caspase-9、Caspase-2，此種Caspase位居 上游與對應凋亡路徑之承接蛋白(adaptor protein)有相同結合區 域，caspases-8、Caspase-10有死亡效應區域(death effector domain, DED)，而Caspase-9、Caspase-2則有凋亡蛋白酶募集區域(caspase recruitment domain, CARD)，當接受凋亡信號並與承接蛋白結合 後，便開始被活化與啟動級聯反應，而且也繼續催化下游的 caspase ； ( 二 ) 執 行 caspase (effector caspase) 又 稱 劊 子 手 (Executioner)：有caspases-3、Caspase-6、Caspase-7，此類caspase

為執行細胞凋亡之動作，經上游caspase活化後，除了會產生更大 級聯反應外，也會進一步切割下游目標蛋白底物(caspase substrates) 使細胞結構解體邁向死亡，依常見細胞凋亡現象大致有下列幾項 底物：1.切割核酸內切酶抑制物 (inhibitor of caspase-activated DNase, ICAD) ， CAD/ICAD 因 而 分 離 造 成 核 酸 內 切 酶 (Caspase-activated DNase, CAD)活化，使DNA遭受降解，DNA斷 裂(DNA fragmentation)現象也因此出現。2.DNA修復因子失活，

如切割多聚ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase, PARP) 與DNA依賴性激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)使細 胞 失 去 修 補DNA 功 能 。 3. 核 纖 層 蛋 白 (Lamins) 和 凝 溶 膠 蛋 白 (Gelsolin)與肌動蛋白(Actin)等遭切割後會細胞結構改變，產生染 色質濃縮(chromatin condensation)、胞器萎縮(cell shrinkage)、膜空 泡化(membrane blebbing)逐漸形成凋亡小體(Apoptotic dodis)。4.

此外還有很多目標底物，如影響細胞訊息傳導Protein kinase C或 MEKK-1 ， 而 細 胞 週 期 阻 滯 的 為 視 網 膜 母 細 胞 瘤 蛋 白 (Retinoblastoma protein, RB)和(mouse double minute-2, MDM2) (Stroh and Schulze-Osthoff, 1998; Nancy, A et al.,1998)。

目前研究較為透澈的細胞凋亡路徑分為（一） 內在路徑 (intrinsic pathway)，又稱為粒線體凋亡路徑(mitochondria apoptosis pathway)(圖IV)。當細胞遭DNA損傷、活性氧化物、死亡受體家族 蛋 白 活 化 導 致 粒 線 體 接 收 到 凋 亡 訊 息 時 ， 首 先 受 到(B cell lmphoma/leukemia-2; Bcl-2)家族蛋白的調控，從文獻得知Bcl-2家 族 依 功 能 分 為 抗 凋 亡 蛋 白(Antiapoptotic protein) ： 有 Bcl-2 、 Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-w、A1/Bfl1等以及促凋亡蛋白(Proapoptotic protein)：有Bax、Bak、Bid、Bad等(Leibowitz and Yu, 2010)，一 般 情 況 下 會 互 相 以 同 源 二 聚 體(homodimers) 的 型 式 結 合 ( 如 Bcl-2/Bcl-xL、Bcl-2/Bcl-2、Bax/Bax)，抗凋亡蛋白會停留於粒線 體外膜上穩定膜通透性，具阻止細胞凋亡功能(Kluck et al.,1997)，

而促凋亡蛋白則游離於細胞質內，當受到凋亡訊號活化便會轉位 (Translocation)至粒腺體外膜上與抗凋亡蛋白結合形成異源二聚體

(heterodimers)(如：Bcl-2/Bax、Bcl-xL/Bax)抑制抗凋亡蛋白活性，

細 胞 的 死 亡 與 否 決 定 於 兩 者 競 爭 結 合 比 例 決 定(Oltval, Z et al.,1997)，若走向細胞凋亡路徑，促凋亡蛋白會促使粒線體外膜形 成孔洞(permeability transition pore, PT pore)，使膜通透性改變，粒 線體穿膜電位(mitochondria membrane potential, ΔΨm)下降，大量 氧化物(reactive oxygen species, ROS)生成並累積加大細胞傷害 (Huang, J et al.,2009)，此外細胞色素C(cytochrome C, cyt.c)會釋放 到細胞質中與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1) 、 (deoxy-Adenosine Triphosphate, dATP) 以 及 Procaspase-9形成凋亡體(Apoptosome) ，同時Caspase-9活化進一步 活化effector caspase (Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)，細胞最終 引發細胞凋亡走向死亡(Adams and Cory, 2002; Alenzi et al., 2010)。

（二）外在路徑(extrinsic pathway)，又稱為死亡受體凋亡路徑 (Death receptor pathway)(圖 V)。細胞除了內部能引發細胞凋亡 外，也可藉由外部細胞膜上的死亡受體(

I

Death receptors, DR)來引 起細胞凋亡訊號，目前在細胞膜上發現屬於腫瘤壞死因子受體家 族(Tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFR superfamily)且 能調控細胞凋亡的受體，共四種有(Tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1 又稱DR1, CD120a, p55 and p60)、(CD95/Fas, 又稱 DR2、

APO-1 ) 、 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1, TRAILR1, 又稱DR4、APO-2)、(TRAILR2, 又稱DR5、KILLER 、 TRICK2) ， 這 些 受 體 N 端 皆 有 富 含 半 胱 胺 酸 區 域 (cysteine-rich domains, CRDs)具穩定蛋白分子作用，而C端於細胞質內含有死亡 區域(Death domain, DD)，首先當接收到死亡訊號時，其對應的配 體 腫 瘤 壞 死 因 子 家 族(Tumor necrosis factor superfamily, TNF superfamily)，有(Fas/CD95 ligand, FasL/CD95L)、(Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)、(Tumour necrosis factor, TNF)會與對應受體配對形成聚合體(oligomerization)並活 化，如(FasL/CD95L- CD95/Fas)、(TRAIL- TRAILR1 與TRAIL-

TRAILR2)、(TNF-TNFR1)，同時吸引承接蛋白與其(Death domain, DD)結合位結合，除了(TNF-TNFR1)先與(TNF-R1 associated death domain protein, TRADD)結合外，接著分別會與(Fas associated protein with death domain, FADD)結合，FADD除了含有(Death domain, DD)也具有(death effector domain, DED)結合位，因此也吸 引(Procaspase-8 或Procaspase-10)與其DED結合，此時形成了死亡 誘導訊息複合體(death inducing signalling complex, DISC)，一旦 caspases-8、Caspase-10 活化後，會繼續活化Caspase-3 引發細胞凋 亡，另外caspases-8、Caspase-10 活化也可能會活化Bcl-2 family中 促凋亡蛋白的Bid，將其切割成具有活性(truncated ,tBid)後，進一 步於粒線體外膜上與抗凋亡蛋白結合抑制其活性並促進促凋亡蛋 白活化(Lovell et al.,2008)，最後導致粒線體釋放cytochrome C引發 粒線體凋亡路徑(Bhardwaj and Aggarwal, 2003; Lavrik et al., 2005;

Kantari and Walczak, 2011)。

圖IV、Pathways of Apoptosis Signal Transduction.。

(Alenzi et al., 2010)