第三章 實驗材料與方法
第二節 實驗方法
一、被動迴避學習反應（Passive Avoidance Learning）
將大鼠置入明室，同時開啟閘門，待大鼠進入暗室後，關閉閘門，
同時於底板通以電流（1 mA,2 sec），待電刺激後 5 秒，自暗室取出大 鼠，歸回飼養籠；如老鼠一直沒進入暗室，待 90 秒後將老鼠推至暗室 後，關閉閘門，同時於底板通以電流，再歸回飼養籠。測定期：於訓 練後 24 小時，再將大鼠置入明室，同時並開啟閘門，記錄大鼠在明室 之滯留時間（Step-Through Latency，STL）。當於明室之滯留時間大於 5 分鐘（300 秒）時，則稱大鼠之學習記憶能力正常(112)。
二、主動迴避試驗
本實驗使用「雙向主動迴避學習反應測定裝置」，此裝置分成兩 部份：實驗箱(shuttle box) 係為一經中間閘門分隔為相同大小二室的 鋁箱；其中央有一小閘門中隔可相通，箱底設有間隔平行排列的金 屬桿，並接上電流器，整個實驗過程全由電腦程式設計控制其時間、
聲光及電擊等動作，並進行記錄大鼠之迴避反應(avoidance response) 次數、逃避反應(escape response)次數及穿梭(inter-trial crossing)次 數。測試訓練共進行五天;第一天將大鼠置於其中一室，待探索30秒 後(exploration) ，電腦隨即出現10秒鐘的光及聲音刺激(conditional stimulus ;CS) ，此時大鼠將有兩種反應結果產生:若大鼠在光及聲音 刺激(CS系統下)之10秒鐘後仍停留在同一邊，無任何動作反應，則隨 即 給 予 持 續 電 流 (0.8mA,5sec) 電 擊 一 次 (unconditional stimulus ;UCS)，此時，大鼠在UCS系統下所表現來回穿梭的行為，
稱之為逃脫反應(escape response);若大鼠在 CS系 統 下 以 進 入 另 一 室，則電腦不會給予任何電擊，此時，大鼠於CS系統期間所表現來
回穿梭的行為，稱之為迴避反應(avoidance response)，實驗中CS或 UCS刺激會隨著大鼠之穿梭反應而予以終止，在經過20秒inter-trial interval 後 則 進 行 下 一 次CS-UCS 訓 練 。 每 隻 大 鼠 每 天 接 受 30 次的 CS-UCS測試訓練，之後將大鼠歸回飼養籠;第二天後至第五天及第八 天進行測試訓練時，則不再有30秒之探索期(exploration)，而直接進 入10秒鐘的光及聲音刺激(conditional stimulus ;CS)以進行測試訓練。
在整個實驗過程中，大鼠接受CS系統刺激下仍留於同一邊，表示 其尚未學會，則會給予電擊，此為學習訓練的歷程;若大鼠受CS刺激後 移動至另一邊，表示已經學會(稱：條件反射已經建立)，則不會受到電 擊，此行為反應是記憶能力的表現。電腦會依大鼠的反應情況，自動 出現CS及UCS的狀態，並自動記錄大鼠反應的次數，實驗根據大鼠在 CS系統下的迴避反應次數及UCS系統下之逃脫反應次數，以評估大鼠 之學習記憶能力。若逃脫反應次數越多，表示學習能力較差;若迴避反 應次數越少，表示記憶能力越不好(113)。
三、大鼠雙側頸動脈結紮腦缺血實驗
實驗大鼠以pentobarbital麻醉，將麻醉大鼠仰臥，由腹頸部中線切 開，並避開迷走神經游離出頸動脈，以縫合線將兩側頸動脈作永久結 紮，實驗期間以恆溫板及40W檯燈光照控制實驗動物肛溫在攝氏36-37 度，手術後動物置於飼養籠，並給予光照至其翻正反射產生為止(114)， 動物於頸動脈阻塞後10天開始進行學習行為評估，其中於手術後11-12 天，進行被動迴避學習反應；手術後12-14天進行水迷宮空間學習操 作；手術後15天進行非空間操作；於手術後16天進行水迷宮之記憶能 力評估。
四、大鼠amyloid ß peptide-(1-40)側腦室輸注實驗
製 備 好 之 amyloid ß-peptide 1-40 solution 灌 入 Alzet osmotic pump，接上brain infusion kit，並使 amyloid ß-peptide 1-40 solution充滿 連接Pump及Kit之PE管。其次，以sodium pentobarbital（45 mg/kg）進 行大鼠麻醉，麻醉後，置於立體定位儀上，進行側腦室之定位；待側 腦室定位後，將Brain infusion kit置上，並將Alzet osmotic pump置於頸 後皮下區。最後進行縫合，並歸回飼養籠中照顧。對照組（Sham）則 於 Alzet osmotic pump 填充35% Acetonitrile/0.1% Trifluoacetic Acid。
治療組於埋置好後之次日，持續於每天固定時刻給予，直至實驗完成
(10)。
五、Morris水迷宮實驗（Morris Water Maze）
實驗於手術完後第十日開始進行，泳池由電腦分成四個象限，逃 記憶（Reference memory）」(116)。
水迷宮第四天（實驗第13天）再將逃逸平臺置入第四象限並使其 露出於水面1 cm，訓練4次，此謂之 「非空間性記憶 （Non-spatial memory）」(115)。
水迷宮第五天（實驗第14天）將逃逸平臺置於第二象限，加水使 其沈入水面下1 cm，大鼠先置入第一象限，連續測定120秒鐘或至大鼠 找到逃逸平臺，此謂之「再學習（Reacquisition）」(117)。
水迷宮第五天（實驗第14天）於第一次實驗完成後休息4小時，再 將大鼠先置入第三象限，亦連續測定120秒鐘或至大鼠找到逃逸平臺。
所有大鼠游泳之軌跡及實驗資料均由電腦自動記錄。第5天稱為「工作 記憶（Working memory）」(117)。
Fig 3.雙側頸動脈結紮大鼠實驗流程
Fig 4. .大鼠amyloid ß peptide-(1-40)側腦室輸注實驗流程
六、梓醇改善學習記憶障礙與中樞神經系統之關係
1.雙側腦部 dorsal rape 區投與 serotonergic neurotoxin 5,7-DHT 對梓醇 改善學習記憶之影響
腦部 dorsal raphe 區(座標：bregma 往後 7.8 mm，往兩側 0.3 mm，
深度 6.4 mm)給予 5,7-DHT (25
µg/brain)破壞兩側 dorsal raphe 區
serotonin 神經元，7 天後；於訓練前側腦室 (座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，深度 3.6 mm) (118)給予梓醇 (10 µg/brain)，病理對照組 給予 5,7-DHT。而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以比對 之。
2.雙側腦部 locus coeruleus 區投與 noradrenergic neurotoxin 6-OHDA 對 梓醇改善學習記憶之影響
腦部 locus coeruleus 區(座標：bregma 往後 9.8 mm，往兩側 1.3 mm，深度 7.2 mm) 給予 6-OHDA(6
µ
g/brain)破壞兩側 locus coeruleus 區 noradrenaline 神經元，7 天後；於訓練後於於訓練前側腦室 (座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，深度 3.6 mm) (118)給予梓醇 (10
µ
g/brain)。病理對照組給予 6-OHDA 。而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以比對之。
3.雙側腦部海馬迴區投與 cholinergic neurotoxin AF64A 對梓醇改善學 習記憶之影響
海馬迴區(座標：bregma 往後 5.6 mm，往兩側 4.8 mm，深度 3.6 mm) 給予 AF64A (3 nmol/brain)破壞 hippocampus 區 acetylcholine 神經，7 天後；於訓練前側腦室 (座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，
深度 3.6 mm) (118)給予梓醇 (10 µg/brain)。病理對照組給予 AF64A。而 空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以比對之。
4.雙側腦部海馬迴投與乙醯膽鹼拮抗劑 scopolamine、腎上腺素 ß 拮抗 劑 PROP、腎上腺素 a2 拮抗劑 YOH、a1拮抗劑 PHEN 改善學習記憶 之影響之影響
海馬迴區(座標：bregma 往後 5.6 mm，往兩側 4.8 mm，深度 3.6 mm) 給予 SCOP (3.2 ng/brain)、PROP (80 ng/brain)、YOH (80 ng/brain)、
PHEN (80 ng/brain)，7 天後；於訓練前側腦室 (座標：bregma 往後 0.9 mm，往兩側 1.4 mm，深度 3.6 mm) (118)給予梓醇 (10 µg/brain)。病理 對照組給予 SCOP (3.2ng/brain)、PROP (80 ng/brain)、YOH (80 ng/brain)
、PHEN (80 ng/brain)而空白對照組則給予 vehicle，並進行假手術組以 比對之。
七、單胺濃度測定 1.腦組織之處理
實驗完成後，將老鼠斷頭取腦，按Glowinski方法(119)分成cortex、
hippocampus區域，分別加入25 mM phosphate buffer solution（pH=7.4）
（4 ℃）均質。cortex分兩次，每次加入750 µl buffer後，均質離心（14000 rpm ，30 min,4℃）；再合併兩次之上清液，以25 mM phosphate buffer solution（pH＝7.4）定量至1.5 ml。hippocampus加入1 ml buffer後，均 質、離心（14000 rpm ,30 min）（4℃），以25 mM phosphate buffer solution
（pH＝7.4）定量至1 ml。保存於-80℃的冰箱中，待需要時解凍離心
（10000 rpm,5 min,4℃），取上清液使用。使用high performance liquid chromatography（ HPLC PM80,BAS）、 檢出器（ electrochemical Detectors LC-4C,BAS）、分離管柱為Bioanalytic system MF-6026測定之。
2.測定方法
酵素免疫分析儀：使用 microplate spectrophotometer（power wave X 340,Bio-Tek instruments INC.）。
採 Lowery 之方法(120)，以 bovine serum albumin 為標準品，將 protein standard 以 50 mM phosphate buffer 稀釋 3 到 5 個濃度，取 5 µl sample 和 standard 分別置入 microplate 中，每一小格中先後加入 25 µl 試劑 A 及 200 µl 試劑 B（試劑購自 Bio-RAD）混合均勻，靜置 15 分 鐘後於波長 750 nm 下測其吸光值。爾後以吸光度求出標準檢量線及公 式，再將 Sample 的 Slope 帶入反推 protein 含量。