討論 - 探討單獨使用新穎化學合成物Yao-ram-2-7或合併使用薑黃素對肝癌細胞的抑制並利用連接網路資料庫比對及證實Yao-ram-2-7之生理功能

本實驗中發現由 1,2,3-triazoles 及 2H-1,4-benzoxazin-3-(4H)-one 兩種化合物經結構修而得的 Yao-ram-2-7 與臨床肝癌標靶用藥

Sorafenib 毒殺人類肝癌細胞 Hep 3B 的效用相當，但對人類正常細胞更具安全性。Yao-ram-2-7 在合併薑黃素處理下，對於毒殺肝癌細胞具有加乘的效用。在比對基因資料庫 CMAP 後發現 Yao-ram-2-7 與 GSK-3 抑制劑 AR-A014418 的基因表現雷同，實驗也進一步證實 AR-A014418 似 Yao-ram-2-7 可誘發 Hep 3B 產生細胞自噬；

Yao-ram-2-7 似 AR-A014418 具抑制 phospho-GSK-3β 及 GSK-3β 蛋白的表現。

癌細胞有 11 項特徵：（1）促進自我的生長、（2）對停止生長的訊息敏感度降低、（3）抵抗細胞死亡程序、（4）使血管增生以供應其生長之營養、（5）持續生長（6）侵犯附近之組織及轉移（7）處在低度發炎的環境、（8）不正常的代謝途徑（9）不受免疫系統控制

（10）促進發炎反應（11）基因異常且不穩定(Colotta, Allavena, Sica, Garlanda, & Mantovani, 2009; Hanahan & Weinberg, 2011)，因此抗癌用藥的研發常以誘發細胞凋亡及使癌細胞的細胞週期停滯為目標(Choi et al., 2011)。先前的研究指出 triazole 的衍生物在乳癌及胰臟癌具有抑制癌細胞增殖與誘發凋亡的潛力(Sim, Lee, Ee, & Go, 2008; S. Wang

et al., 2010)，本研究透過 MTT assay 方式篩檢出具有抑制癌細胞增殖效用的化合物，其中 Yao-ram-2-7 即為 triazole 的衍生物。實驗使用人 類肝癌細胞株 Hep 3B，Hep 3B 細胞特點為無 p53 基因，所以無法誘 發與 p53 蛋白相關的細胞凋亡及細胞週期停滯，且其 Raf-1/ERK 蛋白持續的表現活化，對誘發凋亡的刺激表現出抗性，因此研究認為 Hep 3B 是較為惡性的癌細胞，可代表肝癌末期的情況(Cagnol & Chambard, 2010; Yip-Schneider et al., 2009)。實驗結果發現 Yao-ram-2-7 抑制癌細胞 Hep 3B 生長與劑量及時間呈正相關，與臨床抗癌用藥 Sorafenib 比較結果發現 Yao-ram-2-7 在短時間及低劑量即能發揮效用，反觀 Sorafenib 在高劑量長時間才具有效用。化療藥物常使其它正常細胞一併受到傷害，產生不良副作用，因此實驗也試驗 Yao-ram-2-7 對正常細胞 HUVEC 的安全性，結果發現相較於 Sorafenib，Yao-ram-2-7 抑制 HUVEC 生長的能力較差，顯示安全性較高。臨床 Sorafenib 使用劑量為 400 mg，一天 2 次，換算 Sorafenib 在血漿濃度平均約 10 M。

在細胞週期的結果發現，在同為 10 M 比較各時間點，Yao-ram-2-7 誘發凋亡 Sub-G1 期的比例均較 Sorafenib 明顯增加；但 Sorafenib 則出現 G0/G1 期停滯的現象，此結果也與先前的研究結果一致：

Sorafenib 抑制 Cyclin D1 蛋白表現而產生 G0/G1 期停滯(Manov, Pollak, Broneshter, & Iancu, 2011; Peng et al., 2009; Strumberg et al., 2005)。實

驗也發現 Yao-ram-2-7 可誘發細胞自噬，且比對細胞凋亡與細胞自噬現象產生的先後順序，劑量 10 M 及 20M 的 Yao-ram-2-7 先在 24 小時誘發凋亡（Fig. 4），到時間點 48 小時及 72 小時凋亡與自噬的比例更加明顯（Fig. 5），顯示 Yao-ram-2-7 是先誘發了細胞凋亡的產生，

而後同時使凋亡及自噬現象加劇，但凋亡與自噬的作用是相輔相成或互相抑制還需要進一步探討。

晚期肝癌患者因肝功能代償不佳及癌細胞異常的分裂，使得肝癌細胞對化療藥物的敏感降低，在治療上通常非以單一化學藥物介入，

但在合併其它臨床藥物發現 Sorafenib 與 5-FU 合併使用出現手足皮膚反應加劇，Sorafenib 與 Doxorubicin 合併使用則產生拮抗反應，反而促進癌細胞存活(Manov, et al., 2011; Xie, Wang, & Spechler, 2012)。因此研究轉為以具有抗癌功效的天然物做介入，具抗肝癌功效的天然物有大蒜中的有機硫化物（Diallyl sulfide）、魚油中的二十碳五烯酸

（Eicosapentaenoic acid；EPA）、葡萄及李子外皮的白藜蘆醇

（Resveratrol）及薑黃中萃取出的薑黃素(Okano, Fujise, Abe, Imamoto,

& Murawaki, 2011)。其中薑黃素引起的抗癌機轉繁多，且可作用於多種癌細胞，舉凡於細胞凋亡路徑上游之活化死亡接受器，至下游活化 caspase 蛋白、造成與粒線體相關的凋亡及誘發促凋亡蛋白的活性，

透過抑制 PI3K-AKT -mTOR 及以誘發細胞自噬產生，抑制 NF-B 活

性以抑制癌細胞存活、抑制生長因子和其接受器以抑制癌細胞生長及調控細胞週期相關蛋白以抑制癌細胞分裂(Lev-Ari et al., 2006; Siwak, Shishodia, Aggarwal, & Kurzrock, 2005; Thayyullathil, et al., 2008; W.-Z.

Wang, J. Cheng, J. Luo, & S.-M. Zhuang, 2008; Yu, Shen, Khor, Kim, &

Kong, 2008)。在化學保護性方面，薑黃素具有抗發炎、活化抗氧化相關因子及清除自由基的特性，與化療藥物 Doxorubicin 合併使用增加肝癌細胞（Hep G2）死亡，且對正常細胞不會造成傷害(McNally, Harrison, Ross, Garden, & Wigmore, 2007; Qian, et al., 2011; Syng-Ai, et al., 2004)。在薑黃素與臨床用藥合併使用的實驗發現，薑黃素與 Doxorubicin 合併使用可使實驗動物體內的腫瘤變小，並減少藥物造成的脂質過氧化傷害(Sadzuka, et al., 2012)。本實驗使用的 Sorafenib 同時也為末期腎臟癌的標靶用藥，但臨床效果不佳且對患者產生不良反應(Escudier et al., 2007)。研究分析細胞表遺傳的變化（Epigenetic changes），指出正常細胞可正常執行組蛋白乙醯化（Histone

acetylation），有利於基因表現；反觀癌細胞內因組蛋白去乙醯化酶

（Histone deacetylases；HDACs）表現過度，使參與抑制腫瘤生長分裂的基因表現受到抑制(Bolden, Peart, & Johnstone, 2006)。在組蛋白去乙醯化酶抑制劑（Histone deacetylase inhibitors；HDACIs）介入癌細胞後，發現 HDACIs 可抑制癌細胞生長，因此 HDACIs 被認為是一種

抗癌用藥(T. Liu, Kuljaca, Tee, & Marshall, 2006)。文獻指出腎臟癌細胞也為 HDACs 表現過度的癌細胞，在 Sorafenib 與 HDACIs 合併使用下對抑制癌細胞的生長具有協同作用(M. J. Kim et al., 2012)；在另一研究則指出薑黃素具有誘發癌細胞內組蛋白乙醯化表現低下的作用 (Kang, Chen, Shi, Jia, & Zhang, 2005)。因此臨床藥物與薑黃素合併使用可能具有相輔相成的效用。本實驗則測試薑黃素與新穎化合物 Yao-ram-2-7 或 sorafenib 於 Hep 3B 細胞合併使用的可能效用，在先前的研究發現不同種類之肝癌細胞株（Huh 7、Hep G2、SK-Hep-1、Hep 3B）對薑黃素的敏感度不盡相同，Huh 7 產生細胞凋亡現象隨薑黃素作用的劑量及時間有正相關，而 Hep 3B 對薑黃素的抗性最強，即使在高劑量（50 M）及長時間作用下（48 小時）產生細胞凋亡的比例最不明顯；觀察細胞週期的變化， Hep 3B 明顯累積於 G2/M 期(W. Z.

Wang, et al., 2008)。本實驗使用 Yao-ram-2-7（10 M）與薑黃素（30 M）

合併使用處理癌細胞 48 小時（Fig. 8）具有加乘效用，可提高抑制肝癌細胞生長的比例。分析細胞週期變化（Table 4），雖然在合併使用 造成的凋亡比例較單獨使用 Yao-ram-2-7 少（p < 0.05），但較單獨使 用薑黃素多（p < 0.05）；但 G2/M 期在合併使用與單獨使用薑黃素結 果相似且合併使用的 S 期較單獨薑黃素組顯著降低（p < 0.05），猜測在合併 Yao-ram-2-7 與薑黃素下，Yao-ram-2-7 貢獻增加凋亡的部分而

薑黃素貢獻 G2/M 期停滯的特性，以減少癌細胞分裂，本研究以薑黃素處理 Hep 3B 的結果與先前研究相似(W. Z. Wang, et al., 2008)。在 Yao-ram-2-7 與薑黃素合併使用誘發細胞自噬（Fig. 11）中 LC3-II 蛋 白表現量比單獨處理更為顯著增加（p < 0.05），顯示合併使用可增強彼此誘發的細胞自噬效用。

薑黃素與臨床用藥 Sorafenib 合併使用在抑制 Hep 3B 生長的比例雖然較單獨使用 Sorafenib 多，但合併使用下的抑制率沒有較單獨使 用薑黃素多且有些微的減少，因此 q 值為拮抗（Fig. 12）。檢視細胞 凋亡（Fig. 13）與細胞週期變化（Table 5），凋亡 Sub-G1 期除控制組外皆無顯著差異且合併使用有減少趨勢，在 G0/G1 期單獨 Sorafenib 較有薑黃素介入組高且伴隨 S 期也較低，G2/M 期則顯示相較於單獨 Sorafenib，有薑黃素介入下會產生 G2/M 累積趨勢，但沒有顯著差異

（p > 0.05）。西方墨點法觀察蛋白表現量（Fig. 14），cleavage-caspase 3 表現量均無顯著差異，與 Sub-G1 期結果相同（Fig. 13）。特別的是，

在 Sorafenib 與薑黃素合併使用誘發細胞自噬（Fig. 15）中 LC3-II 蛋 白表現量比單獨處理顯著減少（p < 0.05），顯示合併使用對彼此誘發的細胞自噬產生拮抗。薑黃素與 Sorafenib 合併使用產生拮抗的因素可能為兩者在抗癌路徑上互相牴觸，針對肝癌細胞株 Hep 3B 過去文獻指出，Sorafenib 可抑制 cyclin D1 的蛋白表現造成細胞週期停滯在

G0/G1 期，薑黃素則會造成 G2 期 checkpoint 相關蛋白 p-CDK1 表現量增加，造成細胞週期停滯在 G2/M 期，兩者影響細胞週期的目標不同可能造成拮抗結果；此外 Sorafenib 及薑黃素都具有抑制 p-ERK 蛋白表現以降低癌細胞存活分化，透過引起內質網壓力誘發細胞自噬及凋亡的產生，作用路徑相似可能因競爭關係造成合併使用的效用為拮抗(Lev-Ari, et al., 2006; Ou et al., 2009; Shi et al., 2011; W. Z. Wang, et al., 2008)。

本次實驗也探討新穎化合物在生物利用上的其它可能，利用 Yao-ram-2-7 處理細胞所得的基因表現圖譜與 CMAP 比對，得知 Yao-ram-2-7 可能與資料庫中藥物 AR-A014418 有類似的作用。實驗結果發現，在凋亡部分 AR-A014418 不如 Yao-ram-2-7 可誘發細胞凋亡產生（Fig. 17）。AR-A014418 抑制細胞生長效用是藉由 G2/M 期停滯所造成細胞分裂減少，此結果也與先前研究呼應：GSK-3的活性與細胞存活有關，當 GSK-3 的抑制劑介入時，不會引起細胞死亡，

但會造成 GSK-3的活性減低及細胞週期相關蛋白表現量降低使細胞分裂減少(Ban et al., 2010; Bhat, et al., 2003)。先前的文獻指出 GSK-3

會透過活化 mTOR 抑制細胞自噬產生，且研究發現在無血清條件下細胞經 GSK-3 的抑制劑介入後會引起更劇烈的細胞自噬(Inoki et al., 2006; J. Yang et al., 2010)。本次實驗 AR-A014418 在長時間（72 小時）

及高劑量（20-40 M）下似 Yao-ram-2-7 可誘發細胞自噬產生，與先前結果相同(J. Yang, et al., 2010)。研究指出 phospho-GSK-3（Ser-9）

可減弱 GSK-3的活性(Jacobs et al., 2012)，為驗證 Yao-ram-2-7 是否具有 GSK-3 抑制劑的特性，實驗觀察 phospho-GSK-3/及 GSK-3

蛋白的表現變化發現 Yao-ram-2-7 會抑制 phospho-GSK-3蛋白表現而 GSK-3蛋白表現雖有減弱趨勢但則與控制組沒有顯著差異（p

>），結果指出 Yao-ram-2-7 具有類似 AR-A014418 的效用。研究指出 AR-A014418 透過抑制 GSK-3的表現以增強 Sorafenib 誘發黑色素瘤細胞的凋亡(Panka, Cho, Atkins, & Mier, 2008)；AR-A014418 與藥物 Docetaxel 合併使用在抑制腎臟癌細胞生長發揮協同效應(Bilim et al., 2009)，因此 Yao-ram-2-7 可能也具有以上類似的應用，但還需要更進一步實驗證實。

100 第六章結論

新穎化學合成物 Yao-ram-2-7 抑制人類肝癌細胞 Hep 3B 生長效用與臨床肝癌標靶用藥 Sorafenib 相當，但對於人類正常期靜脈內皮細胞 HUVEC 毒性較 Sorafenib 低，顯示 Yao-ram-2-7 的安全性較好。

檢視細胞凋亡，發現 Yao-ram-2-7 在較低的劑量及較短作用時即可誘

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