薑黃素與 Yao-ram-2-7 合併使用對肝癌細胞的影響

第四章結果

第四節薑黃素與 Yao-ram-2-7 合併使用對肝癌細胞的影響

薑黃素已被證實可透過多種路徑誘發肝癌細胞死亡，包括活化凋亡相關蛋白、促進細胞週期在 G2/M 期停滯使癌細胞分裂減少、誘發與細胞自噬相關的細胞死亡(Cheng, et al., 2010; M. Notarbartolo et al., 2005)。為探討薑黃素與癌症臨床用藥合併使用是否能提高藥物敏感性，我們過去實驗以乳癌臨床用藥 Ixabepilone 與薑黃素合併使用處理 MCF-7 乳癌細胞，發現對癌細胞存活在合併使用下比單一使用更為敏感，減少癌細胞存活；而文獻也指出薑黃素與臨床肝癌用藥 Doxorubicin 合併使用具有增加化療藥物敏感性及減少藥物副作用的傷害(Sadzuka, Nagamine, Toyooka, Ibuki, & Sonobe, 2012)。以上研究說明薑黃素可能具有輔助化學療法及有化學保護劑的潛力(A. Goel &

B. B. Aggarwal, 2010)。因 Yao-ram-2-7 具有毒殺細胞的效用，未來具有發開為臨床用藥的可能，所以測試 Yao-ram-2-7 與薑黃素合併使用對細胞的影響。

以 MTT assay 測試 Yao-ram-2-7、薑黃素及兩者合併使用下對肝癌細胞 Hep 3B 生長抑制比率，並利用 Jin’s method 公式計算單一藥 物處理及合併處理細胞對細胞存活的影響，計算公式為 q = D1+2/

（D₁+D2－D₁×D₂），D₁為第一種藥物對細胞生長的抑制數，D₂為第二

種藥物對細胞生長的抑制數，D₁₊₂則為兩種藥物合併使用，當 q 值大 於 1.15 為兩者協同（Synergism），小於 0.85 時兩者為拮抗（Antagonism），

介於 0.85 到 1.15 之間則為加乘（Additivity）(Zhou, Wang, Tang, & Ma, 1984)。Yao-ram-2-7 使用劑量為 0-10 M，薑黃素為 30 M，藥物處理時間為 48 小時，以 MTT assay 檢測，計算出細胞生長抑制的比例 並計算 q 值。實驗結果發現（Fig. 8）單獨處理情況下，薑黃素比 Yao-ram-2-7 各濃度效果好，有顯著差異（p < 0.05）。薑黃素與

Yao-ram-2-7 合併使用，效果比單獨使用 Yao-ram-2-7 佳（p < 0.05）， 但沒有比單獨使用薑黃素好，不具顯著差異（p > 0.05）。以 q 值計算，

無論 Yao-ram-2-7 的濃度為何，與薑黃素合併使用對毒殺細胞的效用均為加乘。為進一步了解合併使用是否影響細胞凋亡或細胞週期改變，

選用 Yao-ram-2-7 劑量 10 M 及薑黃素 30 M，處理 Hep 3B 細胞 48 小時，利用 PI 染劑經流式細胞儀分析，並利用 Jin’s method 公式計算 細胞週期各分期的 q 值。實驗結果（Fig. 9）發現 Sub-G1 期百分比，

在單獨使用下，Yao-ram-2-7 比薑黃素產生 Sub-G1 的百分比多（p <

0.05）；Yao-ram-2-7 與薑黃素合併使用，Sub-G1 的百分比多於單獨使 用薑黃素（p < 0.05）但少於單獨使用 Yao-ram-2-7（p < 0.05）。分析 細胞週期及計算 q 值（Table 4），在 G0/G1 期的百分比發現單獨使用 Yao-ram-2-7 最低（p < 0.05）。S 期除控制組外，其餘組別沒有統計上

的差異。在 G2/M 期發現 Yao-ram-2-7 與控制組比較無統計差異（p >

0.05），但在經薑黃素處理後都具有 G2/M 期停滯的特徵。雖然細胞週 期各期在 q 值結果均為拮抗，但細胞毒殺試驗抑制效用為加乘，所以 薑黃素對 Yao-ram-2-7 毒殺癌細胞具有輔助作用，可能是藉由 G2/M 期停滯的影響。

當細胞接受到死亡訊息時，會啟動細胞凋亡，凋亡訊息傳導會活化許多下游的 initiation protein，其中 caspases 系列蛋白的活化，是引發細胞凋亡的共同的特徵。在執行凋亡時，caspase 3 是凋亡訊息傳導中最下游的蛋白。caspase 3 被活化後會裂解，稱為 cleavage-caspase 3，

會直接影響凋亡或再進一步活化其它 caspase 蛋白或促凋亡蛋白，因此 caspase 3 在凋亡中扮演關鍵角色(Cohen, 1997)。實驗使用

Yao-ram-2-7、薑黃素及兩者合併使用處理細胞，如同前述實驗條件，

收取 whole cell lysates，以 western blotting 方式觀察細胞內 caspase 3 的表現。結果如（Fig. 10）所示，細胞經 Yao-ram-2-7 處理，引起 cleavage-caspase 3 的表現量多於控制組，具有顯著差異（p < 0.05），此結果也可證實 PI 染色實驗（Fig. 4），Yao-ram-2-7 藉由活化 caspase 3 蛋白以誘發細胞凋亡。但在薑黃素及合併使用這兩組，其

cleavage-caspase 3 的表現量有增多趨勢但與控制組相比並無統計差 異（p > 0.05），結果可能因薑黃素及合併使用這兩組的 Sub-G1 百分

比較低有關（Fig. 9）。細胞自噬的產生可能左右癌細胞的生存或死亡，

而在執行自噬作用時所形成的自噬體膜上會有 LC3-II 存在，因此 LC3-II 可作為細胞自噬的指標(Tanida, Minematsu-Ikeguchi, Ueno, &

Kominami, 2005)。前節實驗已利用 AO 染劑確認 Yao-ram-2-7 處理 Hep 3B 細胞會產生酸性囊狀胞器。為確認自噬體上的 LC3-II 的表現量及 Yao-ram-2-7 合併使用薑黃素後是否對細胞自噬現象產生影響，實驗利用 western blotting 觀察 LC3-II 蛋白的表現量。結果發現（Fig. 11），

與控制組相比，單獨 Yao-ram-2-7 處理後使 LC3-II 蛋白表現有變多趨 勢（p > 0.05），薑黃素可引起 LC3-II 表現明顯增加（p < 0.05）。在 Yao-ram-2-7 與薑黃素合併處理後，LC3-II 蛋白表現量比單一處理 Yao-ram-2-7 或薑黃素產生更多，具有顯著差異（p < 0.05）。指出 Yao-ram-2-7 合併處理薑黃素可誘發 Hep 3B 產生更劇烈的細胞自噬現象。

Fig. 8 Effect of Yao-ram-2-7 with or without curcumin on Hep 3B cell viability determined by MTT assay and the interaction of

Yao-ram-2-7 and curcumin determined by the value of q. Hep 3B cells

(8 ×10³ cells/well) were treated with various concentrations (0, 2.5, 5, 10

M) of Yao-ram-2-7 with or without 30 M curcumin for 48 h.

Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay.

The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and 1.15. Data are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05. Results are representative of three independent experiments.

Fig. 9 The effect of curcumin on Yao-ram-2-7-induced apoptosis.

Hep 3B cells (1×10⁵ cells/well) were treated with 10 M Yao-ram-2-7 in the presence and absence of 30 M cucumin for 48h. After treatment, Hep 3B cells were stained with PI (2g/ml) for 30 min, and 10000 cells were examined by flow cytometry. The percentages indicate the

proportion of apoptotic cells. Data are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05. Results are representative of three independent experiments.

Table 4 The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig. 9 and the value of q

Time (h) 48

Yao-ram-2-7 (10 M)

－－＋＋

Curcumin (30 M)

－＋－＋

% q

Sub-G1 3.7 ± 0.4

14.2 ± 2.4

37.4 ± 0.5

21.6 ± 1.1

0.47 ± 0.01

G0/G1 35.9 ± 1.5

21.6 ± 0.3

11.6 ± 0.9

25.3 ± 2.4

0.71 ± 0.08

S 23.8 ± 1.9

15.4 ± 0.8

13.9 ± 1.3

^bc

9.3 ± 1.5

0.35 ± 0.08

G2/M 36.6 ± 2.9

45.6 ± 1.3

37.1 ± 0.8

45.3 ± 0.9

0.69 ± 0.02

The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig. 9 were quantified by WinMDI 2.8 software. The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and 1.15. Data are presented as means ± SEM. Means in the same cell cycle without a common letter differ, p < 0.05.

Results are representative of three independent experiments.

Fig. 10 The change of caspase 3 protein expression in

Yao-ram-2-7-treated Hep 3B cells in the presence and absence of curcumin. Hep 3B cells (1×10

⁶ cells/dish) were treated with 10 M of Yao-ram-2-7 with or without 30 M curcumin for 48 h. Whole cell

lysates were resolved in SDS-PAGE gel and the proteins were transferred to PVDF membrane. Anti-caspase 3 antibody was served as a probe.

-actin was used as a loading control. Quantification of cleavage-caspase

3 protein expression from independent experiments are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05. Results are representative of three independent experiments.

Fig. 11 The change of LC3 protein expression in

Yao-ram-2-7-treated Hep 3B cells in the presence or absence of curcumin. Hep 3B cells (1×10