探討單獨使用新穎化學合成物Yao-ram-2-7或合併使用薑黃素對肝癌細胞的抑制並利用連接網路資料庫比對及證實Yao-ram-2-7之生理功能

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(1)國立台灣師範大學人類發展與家庭學系營養科學與教育組碩士論文 Department of Human Development and Family Studies National Taiwan Normal University 探討單獨使用新穎化學合成物 Yao-ram-2-7 或合併使用薑黃素對肝癌細胞的抑制並利用連接網路資料庫比對及證實 Yao-ram-2-7 之生理功能. To study anticancer effect of a novel compound Yao-ram-2-7 in the presence or absence of phytochemical curcumin on human hepatocellular carcinoma cells and to identify other biological function of Yao-ram-2-7 using Connectivity Map. 研究生：曾嘉玲 Chia-Ling Tseng 指導教授：蘇純立博士 Advisor：Chun-Li Su, Ph.D.. 中華民國一百零二年一月 January, 2013.

(2) 中文摘要肝癌是世界五大癌症之一，因不易早期發現及預後不佳，使得肝癌在癌症所致之死亡率高居不下。根據行政院衛生署統計，肝癌一直是國人癌症死因的大宗。治療肝癌方式，以手術和化學治療為主。在化學治療方面，藥效常局限於抗藥性的產生使藥效減低，因而促使研發更有效的新穎藥物。在本研究團隊自行合成一系列化合物中經 MTT assay 篩選，發現 Yao-ram-2-7 具有抑制人類肝癌細胞（Hep 3B）生長的效用。在本研究中，Yao-ram-2-7 與臨床肝癌標靶用藥 Sorafenib 在相同的實驗條件下比較，分別處理 Hep 3B 及人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）。發現 Yao-ram-2-7 與 Sorafenib 毒殺 Hep 3B 能力相當，處理 HUVEC 的安全性測試中，Yao-ram-2-7 毒性較 Sorafenib 弱，顯示 Yao-ram-2-7 可能對人體的副作用較小。利用 propidium iodide 染色分析細胞凋亡現象及以 acridine orange 染色分析細胞自噬現象，發現 Yao-ram-2-7 誘發 Hep 3B 產生細胞凋亡及細胞自噬的比例隨時間和劑量增加而增加；利用西方墨點法也確定活化態 caspase 3 蛋白及 LC3-II 蛋白的表現增加，證實 Yao-ram-2-7 可誘發 Hep 3B 產生細胞凋亡及細胞自噬。細胞凋亡實驗結果顯示，相較於 Sorafenib 在高劑量下才具有毒殺癌細胞能力，Yao-ram-2-7 在較低劑量下即有效果；細胞自噬實驗發現，Yao-ram-2-7 比 Sorafenib 在較低劑量下即可引發細胞產 i.

(3) 生自噬現象。因營養素可能具有輔助藥物效用，因此本研究也探討具有抗癌功用的天然植化素—薑黃素（Curcumin）與 Yao-ram-2-7 或 Sorafenib 合併使用下，是否對抑制 Hep 3B 細胞生長有更好的效果。 MTT assay 實驗結果發現 Hep 3B 在 Yao-ram-2-7 與薑黃素同時處理後，抑制細胞生長效果比單獨處理更佳，具有加乘效應；分析細胞週期的變化，發現合併使用薑黃素有使 G2/M 期增加的趨勢，使癌細胞分裂減少。但在肝癌標靶藥物 Sorafenib 與薑黃素合併使用則發現產生拮抗，因此建議臨床使用 Sorafenib 治療的患者不可食用含有薑黃素的食物及膳食補充品。另外，本研究透過「連接網路資料庫（Connectivity Map；CMAP）」比對，發現 Yao-ram-2-7 可能與 GSK-3 抑制劑 AR-A014418 作用相似。實驗結果證實 AR-A014418 如 Yao-ram-2-7 皆可誘發 Hep 3B 產生細胞自噬，Yao-ram-2-7 可抑制 phospho-GSK-3 及總 GSK-3蛋白表現，顯示 Yao-ram-2-7 的生醫上的其它應用性。整體而言，本研究結果發現 Yao-ram-2-7 具有開發為抗癌用藥的潛力，提供肝癌病患治療上不同選擇；與薑黃素合併使用能增加藥物的敏感性，使化療藥物發揮更好的效果。. 關鍵字：Yao-ram-2-7、人類肝癌細胞、細胞凋亡、細胞自噬、薑黃素、 Sorafenib、Connectivity Map. ii.

(4) Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is the ﬁfth most common malignancy worldwide. More than 75% cases of HCC occur in the Asia-Pacific region. High mortality of HCC is due to the difficulty in diagnosis and poor prognosis. Chemotherapy is a traditional choice for inoperable HCC, whereas drug resistant limits the therapeutic effect. Thus, there is an urgent need to develop new potential drugs for HCC. Our research group has synthesized a series of compounds for anti-cancer screening using MTT assay. Yao-ram-2-7 is one of them significantly inhibits the growth of HCC Hep 3B cells. Especially, Yao-ram-2-7 displays less cytotoxicity on normal human umbilical vein endothelial cells than the HCC targeted therapy Sorafenib, suggesting Yao-ram-2-7 is safer than Sorafenib. We further show that Yao-ram-2-7 induces apoptosis of Hep 3B cells in a time- and dose-related manner using propidium iodide staining followed by flow cytometry. Increase of cleavage-caspase 3 expression is observed using Western blotting. Yao-ram-2-7 also induces autophagy of Hep 3B cells characterized by the accumulation of acidic vesicular organelles by flow cytometry after staining the cells with acridine orange. Western blot analysis further observed the conversion of iii.

(5) autophagy marker from LC3-I to LC3-II. Compared with Sorafenib, Yao-ram-2-7 induces apoptosis and autophagy at a relatively lower dosage for a shorter period of time. Recently, anticancer and chemopreventive effects of phytochemicals such as curcumin have been suggested. In the present study, combination of Yao-ram-2-7 with curcumin promotes growth inhibition of Hep 3B cells and produces an additivity effect. Cell cycle analysis suggests that the decrease in tumor cell proliferation is due to an increase of G2/M arrest. In contrast, addition of curcumin to Sorafenib displays an antagonism effect, suggesting that patients treated with Sorafenib should avoid food and supplements containing curcumin. In addition, we discover that a GSK-3 inhibitor AR-A014418 and Yao-ram-2-7 have similar biological functions since AR-A014418 alters gene expression of Hep 3B cells similarly to Yao-ram-2-7 by using a bioinformatics database Connectivity Map (CMAP). Western blot and flow cytometric analysis confirm that Yao-ram-2-7 behaves like AR-A014418, inducing autophagy and decreasing protein expression of phospho-GSK-3and total GSK-3 These data demonstrate that query gene expression profiles using CMAP is a useful shortcut to reveal molecular action of a small chemical iv.

(6) compound. Taken together, our data suggest chemotherapeutic potential of Yao-ram-2-7 on HCC, and addition of curcumin further promots its chemosensitivity.. Key word: Yao-ram-2-7, human hepatocellular carcinoma, apoptosis, autophagy, curcumin, Sorafenib, Connectivity Map. v.

(7) 誌謝兩年半來的碩班生活，到研究論文能夠順利完成，由衷感謝許多人的幫助與支持。首先謝謝我的指導教授蘇純立老師，老師總是很有耐心地用說故事的方式解釋實驗邏輯，訓練我獨立思考及處理事情的能力，適時給予鼓勵及安慰，讓我在衝擊低落時能轉換心情，重新振作。感謝您給我的一切！感謝口試委員黃奇英教授、姚清發教授在百忙之中抽空審閱論文，提供諸多寶貴意見及修正建議，使這本論文內容更加精實與完整。感謝成功大學劉校生教授提供很好的實驗資源及感謝台北醫學大學葉淇臺老師提供實驗儀器，使我能順利完成實驗。研究這條路是艱辛，感謝呈欣學姊的實驗入門指導。在成大待了八個月，感謝 HSL lab 熱情的大家從不讓我覺得孤單。大勳學長、昇輝學長、珊盈學姊及靖棠學姊總是耐心的教我實驗及給我建議，佩珊及瑄耘家的貓總是讓我心靈上得到放鬆以及紓晴跟思含爽朗的笑聲，有你們的陪伴，讓我的通勤實驗生活多了很多樂趣。感謝同在師大的盈堤學姊、葵蓉學姊及幸芷學妹，總是互相幫忙給對方打氣，解決實驗上的困難，很珍惜與你們在一起的緣分。在外宿的日子裡，感謝有台南室友韋如姊及台北 50164 的室友 Han、Scarf、Luna 及 Morning 的陪伴，疲累地回到家時總有人可以說話，讓我即使在外地讀書也有 vi.

(8) 家人相伴的感覺。感謝好友們 Sheena、Morris、Harry、周兒、半獸人、安安、豆子的打氣，跟你們聊天分享生活很開心。感謝同在碩班生活的 Curtis，無論是在實驗上或心靈上總給我很多支持，在我低潮時、懷疑自己想放棄時，謝謝有你提醒我不要陷入谷底，堅持下去。感謝我的家人，無條件的支持我念書，在你們遇到困難時我不能回家一起解決，卻還是勉勵我，要我別擔心繼續完成目標。三年前我想在碩班學到無形經驗，老天爺一定是知道了，給我這樣的安排，無論在人事物都有深刻的體悟，因而成長茁壯。再次感謝大家！. 謹將此論文獻給所有關愛我的人。. 曾嘉玲. 謹誌於. 國立臺灣師範大學人類發展與家庭教育學系碩士班中華民國一○二年一月. vii.

(9) 目錄第一章緒論 .............................................................................................. 1 第一節肝癌 ........................................................................................1 一、肝癌的對人類的威脅...........................................................1 二、肝癌的致病因子 ...................................................................1 三、肝癌的治療 ...........................................................................2 第二節薑黃素....................................................................................7 一、薑黃素的背景 .......................................................................7 二、薑黃素與癌症的關係...........................................................8 第三節計畫性細胞死亡..................................................................10 一、細胞凋亡 .............................................................................10 二、細胞自噬 .............................................................................16 第四節細胞週期的意義..................................................................21 第五節新穎化合物 Yao-ram-2-7 ....................................................23 第六節連結網路資料庫及 L1000 ..................................................25 第二章研究目的 ....................................................................................27 第三章材料與方法 ................................................................................29 第一節儀器與實驗耗材..................................................................29 第二節藥品與試劑..........................................................................32 viii.

(10) 第三節實驗方法..............................................................................35 一、細胞培養 .............................................................................35 二、化合物的配製 .....................................................................38 三、細胞毒殺試驗 .....................................................................39 四、細胞週期分析 .....................................................................40 五、檢測細胞自噬比例 .............................................................42 六、西方墨點法 .........................................................................43 第四章結果 ............................................................................................50 第一節 Yao-ram-2-7 可抑制癌細胞 Hep 3B 的生長，但對人類正常臍靜脈內皮細胞 HUVEC 傷害較低 ..............................50 第二節 Yao-ram-2-7 能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞凋亡 .............55 第三節 Yao-ram-2-7 能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬...............61 第四節薑黃素與 Yao-ram-2-7 合併使用對肝癌細胞的影響....... 64 第五節薑黃素與 Sorafenib 合併使用對肝癌細胞的影響 ............73 第六節驗證連接網路資料庫比對結果 .........................................81 第五章討論 ............................................................................................92 第六章結論..........................................................................................100 第七章參考文獻 ........................................................... ......................101 附錄 .......................................................................................................118 ix.

(11) 圖次 Fig. 1 Yao-ram-2-7 is the one of 136 compounds exhibiting anticancer ability. ..........................................................................................24 Fig. 2 Effect of Yao-ram-2-7 or Sorafenib on Hep 3B cell viability determined by MTT assay. ..........................................................52 Fig. 3 Effect of Yao-ram-2-7 or Sorafenib on HUVEC cell viability determined by MTT assay. ..........................................................53 Fig. 4 Yao-ram-2-7 induced apoptosis of Hep 3B cells in a dose- and time-related manner. ....................................................................57 Fig. 5 Sorafenib induced apoptosis on Hep 3B cells in a dose- and time-related manner. ....................................................................59 Fig. 6 Effect of Yao-ram-2-7 on autophagy of Hep 3B cells. ................62 Fig. 7 Effect of Sorafenib on autophagy of HCC Hep 3B cells. ...........63 Fig. 8 Effect of Yao-ram-2-7 with or without curcumin on Hep 3B cell viability determined by MTT assay and the interaction of Yao-ram-2-7 and curcumin determined by the value of q. .........68 Fig. 9 The effect of curcumin on Yao-ram-2-7-induced apoptosis........69 Fig. 10 The change of caspase 3 protein expression in Yao-ram-2-7-treated Hep 3B cells in the presence and absence of x.

(12) curcumin. .....................................................................................71 Fig. 11 The change of LC3 protein expression in Yao-ram-2-7-treated Hep 3B cells in the presence or absence of curcumin. ...............72 Fig. 12 Effect of Sorafenib with or without curcumin on Hep 3B cell viability determined by MTT assay and the interaction of Sorafenib and curcumin determined by the value of q. ..............76 Fig. 13 The effect of curcumin on Sorafenib-induced apoptosis. ...........77 Fig. 14 The change of caspase 3 protein expression in Sorafenib-treated Hep 3B cells in the presence and absence of curcumin. .............79 Fig. 15 The change of LC3 protein expression in Sorafenib-treated Hep 3B cells in the presence and absence of curcumin. ....................80 Fig. 16 Effect of Yao-ram-2-7 or AR-A014418 on Hep 3B cell viability determined by MTT assay. ..........................................................84 Fig. 17 Effect of AR-A014418 on apoptosis of Hep 3B cells. ................85 Fig. 18 The change of caspase 3 protein expression in AR-A014418-treated Hep 3B cell. .............................................87 Fig. 19 Effect of AR-A014418 on autophagy of Hep 3B cells. ..............88 Fig. 20 The change of LC3 protein expression in AR-A014418-treated Hep 3B cell..................................................................................89 xi.

(13) Fig. 21 The change of phospho-GSK-3α/β protein expression in Yao-ram-2-7-treared Hep 3B cell. ..............................................90 Fig. 22 The change of total GSK-3β protein expression in Yao-ram-2-7-treated Hep 3B cell................................................91. xii.

(14) 表次 Table 1 The IC50 of Yao-ram-2-7 and anticancer drug Sorafenib. .........54 Table 2 The percentage of cells at different phases of cell cycle in Fig.4 ...................................................................................................58 Table 3 The percentage of cells at different phases of cell cycle in Fig.5 ...................................................................................................60 Table 4 The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig. 9 and the value of q ...................................................................70 Table 5 The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig. 13 and the value of q .................................................................78 Table 6 The percentage of cells at different phases of cell cycle in Fig. 17 ...............................................................................................86. xiii.

(15) 附錄 Appendix Fig. 1 Chemical structure of Sorafenib. .............................118 Appendix Fig. 2 Molecular mechanisms of Sorafenib. ......................119 Appendix Fig. 3 Curcuma longa Plant and chemical structure of curcumin, an active ingredient of rhizome termeric. ..................................................................120 Appendix Fig. 4 Curcumin significantly inhibited protein expression of Aurora-A. ................................................................121 Appendix Fig. 5 Curcumin enhanced chemosensitivity of human breast cancer cells to Ixabepilone (FDA approved drug for patients with breast cancer). ....................................122 Appendix Fig. 6 The apoptosis pathway. ...........................................123 Appendix Fig. 7 The process of autophagy. .......................................124 Appendix Fig. 8 The mammalian cell cycle. ......................................125 Appendix Fig. 9 The chemical structure of AR-A014418. .................126. xiv.

(16) 第一章緒論. 第一節肝癌. 一、肝癌的對人類的威脅. 肝癌（Hepatocellular carcinoma；HCC）在全球癌症好發率中排名第五位，其中以非洲及亞洲地區發生率較高；由於肝癌在早期階段通常沒有症狀，因此不易即早發現且預後不佳，在癌症致死率排名中居於第三位(Block, Mehta, Fimmel, & Jordan, 2003)。根據台灣行政院衛生署資料統計，癌症所致的死亡一直是造成國人死亡原因的第一位。民國九十八年到民國一百年的國人因癌症死亡的統計資料顯示，肝癌一直是僅次於肺癌排名第二的癌症，在死亡人數中肝癌的佔率：98 年為 19.4%（7757 人），99 年為 18.9%（7744 人），100 年為 18.8% （8022 人）。以上資料均指出肝癌對國人的健康極具威脅性。. 二、肝癌的致病因子. 肝癌可分為兩類：繼發性肝癌與原發性肝癌。繼發性肝癌又稱為轉移性肝癌，是由其他部位的癌細胞轉移至肝臟的癌症。原發性肝癌是始發於肝臟的癌症。肝實質的惡性腫瘤佔 75-90%，另外 10-25%為肝內膽管膽道癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma；ICC）。肝癌發生 1.

(17) 機制至今未明確，遺傳、感染、飲食中的致癌因子，都可能使肝臟受損，增加罹患肝癌的風險。根據世界衛生組織（WHO）指出，每年約有 50 萬人死於肝癌，其中 B 型肝炎病毒感染（Chronic HBV infection）與 C 型肝炎病毒感染（Chronic HCV infection）為造成肝癌的首要危險因子。台灣臨床發現肝癌患者約有 70%為 B 型肝炎帶原者，20% 為慢性 C 型肝炎感染者。慢性肝炎演變成肝硬化，最後變成肝癌(Benn, Su, Doria, & Schneider, 1996; D.-S. Chen et al., 1990)。除此之外，任何會引起肝硬化的疾病也可能造成肝癌，如遺傳性疾病鐵質沉積症（鐵質超載）（Hemosiderosis；iron overload）、藥物的濫用、酒精性肝硬化與非酒精性脂肪肝疾病。特別在開發中國家如非洲及亞洲地區，飲食中黃麴毒素（Aflatoxin）、亞硝胺（Nitrosamines）的暴露，也會使肝臟受損，肝癌的發生也隨之提高(Center & Jemal, 2011; L.-Y. Wang et al., 1996)。. 三、肝癌的治療. 進行肝癌治療需考量患者肝腫瘤階段、評估剩餘肝功能及身體功能。治療方式主要可分為手術與化學藥物治療，療法眾多但都有一定的顧慮存在。. （一）外科手術 2.

(18) 肝癌的外科手術治療常見有手術切除腫瘤（Resection）、肝臟移植（Liver transplantation）、肝動脈血管栓塞術（Transcatheter arterial embolization；TAE）、經皮酒精注射法（Percutaneous ethanol injection； PEI）、經皮穿刺腫瘤內醋酸注射（Percutaneous acetic acid intratumor injection；PAI）、經皮微波熱凝治療（Percutaneous microwave coagulation therapy）、射頻燒灼治療（Percutaneous radiofrequency ablation）(Mulcahy, 2005)。手術切除腫瘤是有效根治肝癌的方法，但僅限於無肝硬化的患者、本身肝功能代償良好的肝硬化患者或單一腫瘤大小不得大於 5 公分者。所以，僅有少數早期發現罹患肝癌的患者適用此治療方式。但研究發現手術切除腫瘤仍有復發的可能(Arii et al., 2000; J. M. Llovet, Bruix, & Gores, 2000)。肝臟移植適用於肝腫瘤較小的患者，預後 5 年存活率最好(Yoo, Patt, Geschwind, & Thuluvath, 2003)。但肝臟移植需等待適合的捐贈者；若合適移植的肝臟短缺，等待時間加長致病情惡化就無法接受肝臟移植。另外，器官移植容易產生免疫抑制的情形，因此也僅有少數患者適用(Sala, Varela, & Bruix, 2004)。肝動脈血管栓塞術是利用導管將栓塞物質或是抗癌物質注入供應肝腫瘤血流的動脈使之閉塞，肝癌細胞會因缺少養份及藥物作用下而壞死，而正常的肝細胞因 70-75%的血液是由腸道及脾臟回流的門靜脈所供應，僅 25-30%則由肝動脈來提供，故仍可在血管栓塞術 3.

(19) 執行下保持正常機能。接受肝動脈血管栓塞術的病患會因癌細胞的壞死或抗癌藥物的作用而引起栓塞後症候群，包括上腹疼痛、發燒、噁心及嘔吐，甚至併發消化道出血、膽囊壞死、脾臟梗塞、肝膿腫等(Ong et al., 2004)。肝動脈血管栓塞術對於肝功能代償良好的患者療效較佳，但仍可能造成非肝癌部分的細胞壞死，所以對肝功能已失去代償的患者，肝動脈血管栓塞術有可能引發肝衰竭的危險性則會相對提高。單一腫瘤不大於 5 公分或只有兩到三顆腫瘤且最大者小於 3 公分的狀況下，可利用局部消除腫瘤來治療，如：經皮酒精注射法。經皮酒精注射法是在腹部超音波指引下，將細長的針插入腫瘤內，再將高濃度的酒精直接注射到腫瘤內，造成癌細胞脫水、變質壞死，隨後產生纖維化、小血管阻塞而使癌細胞壞死。酒精擴散後濃度變低，對身體幾乎無傷害，僅對注射點產生作用是此法的優點。但腫瘤越大，酒精的滲透力越差，治療效果也相對不好。在合併症方面，患者使用經皮酒精注射法治療，大部分的患者會產生局部疼痛、發冷或發燒現象，極少數病例可能併發腹腔出血等問題。經皮穿刺腫瘤內醋酸注射，則是以醋酸來替代酒精，治療肝臟內的惡性腫瘤，機轉與經皮酒精注射法類似。經皮微波熱凝治療及射頻燒灼治療則是利用加熱的方式，破壞腫瘤組織使之壞死，比起使用經皮酒精注射法，殺死癌細胞的效果更好；. 4.

(20) 缺點在於需使用較粗的穿刺針，過程中可能會有出血問題，且此法僅適合小型腫瘤的患者(Buscarini et al., 2001; Lencioni et al., 1997)。. （二）化學藥物. 當肝癌患者的腫瘤過大無法以手術方式治療、肝癌末期患者或合併癌細胞轉移的患者可使用化學藥物治療。因肝癌細胞高度表現多重藥物抗藥性（multidrug resistance；MDR），容易對大多數的化學藥物產生抗藥性(Gottesman, Fojo, & Bates, 2002)。所以在治療肝癌時，幾乎不單獨使用任何一種藥物，大多為合併使用多種藥物。常用於治療肝癌的藥物有：Fluorouracil（5-FU）、Doxorubicin、Cisplatin 及甲型干擾素（Interferon-）。另一方面，因患者大多合併肝硬化，使肝臟代謝藥物能力變差，導致抗癌藥物帶來的副作用極大，更添治療困難度。例如 5-FU 易引起手足症候群、肝昏迷、意識不清甚至致死、 Doxorubicin 易對心臟產生累積性傷害而致命、Cisplatin 則有無法預測的腎毒性，Interferon-的副作用會有類似流行性感冒的病症，如肌肉關節痛、頭痛、失眠、憂鬱、眩暈、集中障礙甚至是呼吸困難(Josep M. Llovet et al., 2000; Patt et al., 1994)。目前最新的肝癌標靶藥物為 Sorafenib，Sorafenib 在 2005 年通過美國食品藥物管理（Food and Drug Administration；FDA）核准（Appendix Fig. 1），為腎臟癌晚期用藥 5.

(21) 同時也是治療肝癌的唯一標靶藥物。Sorafenib 為口服的多激酶抑制劑（Appendix Fig. 2），透過抑制 Raf 激酶而阻斷與癌細胞分化存活相關的 Raf/MEK/ERK 路徑，同時 Sorafenib 也會抑制癌細胞表面的酪蛋白激酶（Tyrosine kinase）接受器，具有減少癌細胞增生和抑制血管新生的作用(Wu, Chen, Kudelka, Lu, & Zhu, 2008)。目前 Sorafenib 在臨床試驗的第四期，據臨床試驗第三期結果的整合分析，服用 Sorafenib 的患者會產生許多副作用，如：疲勞、腹瀉、手足皮膚反應，增加罹患高血壓、出血、動脈血管栓塞的風險(Choueiri, Schutz, Je, Rosenberg, & Bellmunt, 2010; Je, Schutz, & Choueiri, 2009; Wu, et al., 2008)。在統計上，服用 Sorafenib 治療的患者，其壽命平均比服用安慰劑組患者延長 1 至 3 個月，雖有統計上的差異，但實際對改善患者的整體狀況並不佳(Josep M. Llovet et al., 2008)。以上治療肝癌化學藥物對延長患者的存活率及改善生活品質的助益不大，有鑑於此，開發有效引起肝癌細胞死亡且對人體副作用低的藥物成為目前醫界、學界共同努力的目標。. 6.

(22) 第二節薑黃素. 一、薑黃素的背景薑黃素（Curcumin）是從薑黃科植物（Curcuma longa）中薑黃（Curcuma longa Linn）的根部所分離出來的多酚類化合物，外觀為橘黃色，分子量為 368.5，化學名稱為 bis(4-hydrioxy-3-methoxy-pheny 1)-1, 6-diene-3, 5 dionea（Appendix Fig. 3）。在印度及亞洲地區，使用薑黃素已超過 2 千年的歷史。當地人把薑黃素當作是辛香調味料，如：咖哩、芥末，提供獨特的色澤與風味；除此之外，傳統的印度醫學認為薑黃素具有療效，用來治療呼吸系統和肝臟方面的疾病、鼻炎、腹痛、厭食、風濕症及促進傷口復原。過去十年，研究已證實薑黃素具有預防或治療的價值，如：抗氧化、抗發炎、護肝、抑制血栓形成、保護心臟、抗癌(Brouet & Ohshima, 1995; J. Chen et al., 2006; Kiso, Suzuki, Watanabe, Oshima, & Hikino, 1983; Sreejayan & Rao, 1997; Srivastava, Bordia, & Verma, 1995; Venkatesan, 1998)。研究指出，薑黃素可應用於預防慢性病、阿茲海默症、酒精性肝損傷、減少心血管疾病的發生及做為抗癌的輔助品(Annelyse Duvoix et al., 2005; Nanji et al., 2003; Thomas et al., 2009; F. Yang et al., 2005)。. 7.

(23) 二、薑黃素與癌症的關係薑黃素能誘發多種癌細胞死亡，包括血癌、淋巴癌、大腸直腸癌、乳癌及肝癌等(A. Duvoix et al., 2003; D. W. Scott & Loo, 2004; Syng-Ai, Kumari, & Khar, 2004; Uddin et al., 2005)。薑黃素誘發癌細胞的死亡可透過抑制癌細胞增生、誘發癌細胞產生細胞凋亡、細胞自噬作用和抑制抗凋亡蛋白質的表現等多方路徑(Piwocka, Jaruga, Skierski, Gradzka, & Sikora, 2001; Shinojima, Yokoyama, Kondo, & Kondo, 2007; Thayyullathil, Chathoth, Hago, Patel, & Galadari, 2008; Zheng, Ekmekcioglu, Walch, Tang, & Grimm, 2004)。在肝癌方面的研究，薑黃素可引起 G2/M phase arrest 進而減少癌細胞分裂、活化促進凋亡相關蛋白質、誘發粒線體膜電位失衡以促進細胞凋亡產生及引起與內質網壓力（ER stress）相關的凋亡機制(Cao et al., 2007; Cheng, Lin, & Su, 2010; W. Z. Wang, J. Cheng, J. Luo, & S. M. Zhuang, 2008)。薑黃素除了造成癌細胞死亡，對於化學療法和放射線療法所造成的傷害，也可以扮演化學保護並增加療效的角色。化學保護（Chemoprevention）是利用化學物質或天然物—植化素（Phytochemicals）介入以預防或減少疾病的傷害。目前臨床抗癌藥物，因無法選擇性的殺死癌細胞而不傷害正常細胞，所以在治療上產生不可預期的副作用，對癌症患造. 8.

(24) 成莫大的不適感及其它器官損傷，造成生活品質降低甚至放棄持續治療。實驗證實薑黃素可增加 Doxorubicin 及 5-FU 對前列腺癌細胞的毒殺效果、增加 Doxorubicin 引起肝癌細胞凋亡的效果。動物實驗也證明薑黃素的抗氧化功能可減少 Doxorubicin 造成心臟及腎臟毒性。這都指出薑黃素成為治療癌症輔助療法的可能(Hour et al., 2002; Monica Notarbartolo et al., 2005; Qian, Yang, & Wang, 2011; Venkatesan, 1998; Venkatesan, Punithavathi, & Arumugam, 2000)。我們研究團隊也發現，在膀胱癌細胞中，薑黃素可以明顯抑制細胞分裂相關的蛋白質 Aurora-A 的表現（Appendix Fig. 4），使癌細胞分裂減少(H. S. Liu, Ke, Cheng, Huang, & Su, 2011)。使用 MTT assay 進一步發現薑黃素能增強人類乳癌細胞對臨床藥物 Ixabepilone （FDA 核准之乳癌用藥）的敏感性，利用 Jin’s method 公式計算單一藥物處理及合併處理對抑制細胞存活的影響（q 值），判定薑黃素與 Ixabepilone 對於人類乳癌細胞 MCF-7 細胞的毒殺能力具有加成關係（Appendix Fig. 5）。值得注意的是，比起許多化療標靶藥物產生的毒性與抗藥性，薑黃素是沒有毒性且不會產生抗藥性(Ajay Goel & Bharat B. Aggarwal, 2010)。. 9.

(25) 第三節計畫性細胞死亡計畫性細胞死亡（Programmed cell death）是維持細胞動態平衡的重要步驟，可控制正常細胞數量、組織和器官的形成並消滅受損的細胞。計畫性細胞死亡又分為兩類：細胞凋亡（Apoptosis）與細胞自噬（Autophagy）。非計畫性的細胞死亡則為細胞壞死（Necrosis）。這兩種死亡形式的不同在於：計畫性細胞死亡是細胞內部主動執行生理性死亡，經過嚴密計畫不傷害本體；而細胞壞死則屬於不受控制的病理性死亡，細胞因滲透壓改變而腫脹破裂，細胞膜失去完整性，胞內之胞器遭受破壞釋放到細胞外，導致鄰近組織產生發炎反應，造成周圍正常組織連帶傷害(J. F. R. Kerr, 1972; Kuan N, 1998; Majno & Joris, 1995)。一、細胞凋亡細胞凋亡是正常的生理性細胞死亡，參與調節發育分化及維持細胞數目動態平衡，過程中由特定的酵素及蛋白質調控，是一種具有程序性的死亡方式，歸類為計畫性細胞死亡第一類（Programmed cell death type-I）。當細胞接收到不利其正常生長的訊息時，就會引發細胞凋亡。若細胞無法正常進行細胞凋亡，會造成病理上的傷害，包括退化性神經疾病、心臟疾病、愛滋病、及癌症，其中癌症就是細胞不 10.

(26) 正常的過度分裂但又不執行細胞凋亡(J. F. Kerr, Winterford, & Harmon, 1994)。細胞凋亡的特徵包括細胞型態改變（Cellular morphology change）、細胞萎縮（Shrinkage）、DNA 斷裂（Oligonucleosomal DNA cleavage）、染色質凝集（Chromatin condensation）及細胞核皺縮（Nuclear shrinkage），進而整個細胞膜內陷使細胞分割成數個有膜包覆的凋亡小體（Apoptotic body）再被鄰近的吞噬細胞（Phagocyte）吞噬，最後被溶酶體（Lysosome）降解消化(J. F. Kerr, Wyllie, & Currie, 1972)。在凋亡過程中，細胞膜保持完整，所以不會產生發炎反應，因此誘發癌細胞進行細胞凋亡是癌症治療較好的方式。（一）細胞凋亡相關路徑（1）外在路徑（Extrinsic pathway）外在路徑又稱死亡受體路徑（Death receptor pathway），是經由細胞膜上的死亡訊息受體（Death receptor）與細胞外的死亡配體（Death ligand）結合所引發。死亡配體有其相對應的死亡受體，常見有纖維母細胞相關表面抗原（Fibroblast associated surface antigen；Fas）配體與 Fas 受體（FasL/FasR），腫瘤壞死因子- （Tumor necrosis factor alpha； TNF-）配體與 TNF 受體-1（TNF-/TNFR1）。死亡配體與死亡受體結合而活化暴露出受體的死亡區域 (Death domain)，death domain 會 11.

(27) 吸引與其同源的 adaptor protein 結合，FasL/FasR 與 TNF-/TNFR1 的 adaptor protein 分別為 Fas-associated death domain（FADD）與 TNF receptor-associated death domain（TRADD）；當 adaptor protein 結合後會再吸引誘發死亡訊息的 caspase（Initiator caspase，如：procaspase-8），此時形成一個巨大的複合物，稱誘導死亡訊息複合體（Death inducing signaling complex；DISC）。DISC 會促使 procaspase-8 裂解形成活化態的 caspase-8，引發下游一連串的 caspase 蛋白活化，稱 caspase cascade。然而，路徑中也有負調控因子，FADD 與 cellular FLICE-inhibitory protein（c-FLIP）結合在 FADD 上會使得 FADD 無法與 procaspase-8 結合而抑制凋亡路徑(Kataoka et al., 1998)。（2）內在路徑（Intrinsic pathway）內在路徑與粒線體有關，又稱為粒線體路徑（Mitochondria pathway）。啟動內在路徑可經由生長因子、荷爾蒙及細胞激素的缺乏導致抑制凋亡的程序失調或其它刺激如輻射、毒素、過熱及自由基，以上這些刺激使凋亡啟動，造成粒線體外膜的通透性改變，Bcl-2 家族中促進凋亡的蛋白 Bax 及 Bak 附著在粒線體上，形成孔洞，粒線體內促凋亡的蛋白質 cytochrome c 及第二粒線體 caspases 活化子/低等電點直接結合抑制凋亡蛋白（Second mitochondrial activator of caspases/direct IAP binding protein with low PI；Smac/DIABLO）釋放 12.

(28) 到細胞質中。Cytochrome c 與凋亡蛋白活化因子（Apoptosis protease-activating factor 1；Apaf-1）及 procaspase 9 形成凋亡體 apoptosome，使 caspase 9 活化，促進凋亡發生；Smac/DIABLO 會使抑制凋亡蛋白（Inhibitor of apoptosis proteins；IAP）的活性減弱，進而促進凋亡(Hill, Adrain, Duriez, Creagh, & Martin, 2004; van Loo et al., 2002)。然而在內在路徑中，也具有抑制凋亡的機制存在，Bcl-2 家族中的抗凋亡的蛋白如 Bcl-2 及 Bcl-XL 具有補救孔洞的作用，防止 cytochrome c 的釋放及抑制 Bax 及 Bak 的活性進而抑制凋亡；Bcl-XL 與 Apaf-1 結合後可避免 procaspase-9 的活化(Newmeyer et al., 2000)。（3）外在路徑與內在路徑之間的串聯外在及內在路徑並非獨立進行（Appendix Fig. 6），外在路徑中的 caspase-8 也可活化 Bcl-2 家族成員中促進凋亡蛋白 Bid 活化成 tBid， tBid 轉移至粒線體上，使粒線體膜的通透性失衡，cytochrome c 釋放，活化其它 caspase 蛋白，進而引起細胞凋亡(Kischkel et al., 1995)。（4）參與凋亡相關蛋白質凋亡過程中會活化蛋白酶來執行凋亡，即 Caspase 蛋白，單字中 ‘C’指具有專一性的 cysteine protease 而‘aspase’指此蛋白酶具有切割 aspartic acid residue 的能力。Caspases 家族蛋白均具有相似的胺基酸序列，在細胞中是以非活化態的 procaspase 形式存在，不具有參 13.

(29) 與凋亡路徑的能力，經裂解後成活化態 caspase。Caspases 又可以分為兩類：起始者（Initiator caspase），包括有 caspase 2、8、9、10；及執行者（Executioner caspase），有 caspase 3、6、7(Cohen, 1997)。外在路徑中 DISC 活化 caspase 8 及在內在路徑中 cytochrome c 與 Apaf-1 結合活化 caspase 9，進而活化下游 caspase 3、6、7，造成細胞核膜分解。活化態的 caspase 3 會把具有修復受損 DNA 的聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（Poly(ADP-ribose)polymerase；PARP）分解，而使之失去修復功能，並使 caspase 活化去氧核醣核酸抑制子（Inhibitor of caspase-activated DNase；ICAD）活化，放出 caspase-activated DNase （CAD），而造成 DNA 斷裂（DNA fragmentation），進而導致細胞凋亡，所以 caspase 3 是執行細胞凋亡的核心蛋白(Wolf, Schuler, Echeverri, & Green, 1999)。在粒線體相關路徑中，影響粒線體膜電位常見為 Bcl-2 家族蛋白（Bcl-2-family proteins）。Bcl-2 家族蛋白可分為兩類：促進凋亡蛋白（Pro-apoptotic protein）如 Bax、Bak、Bid、Bim，及抑制凋亡蛋白（Anti-apoptotic protein）如 Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1。這兩類蛋白彼此以 heterodimers 或 homodimers 的形式結合，以調控細胞凋亡。促進凋亡的蛋白在無凋亡訊息刺激時，都存在於細胞質中，當接收到上游凋亡訊息時才會轉移到粒線體膜上，改變了粒線體膜電位的平衡，造 14.

(30) 成孔洞（Pore）形成及膜的通透性改變，使原先在粒線體內膜的 cytochrome c 及 Smac/DIABLO 外流到細胞質。抑制凋亡蛋白 Bcl-XL 與 Apaf-1 結合，抑制 Apaf-1 的活性進而減少 procaspase-9 的活化 (Budihardjo, Oliver, Lutter, Luo, & Wang, 1999; Chau, Cheng, Kerr, & Hardwick, 2000; Kuwana & Newmeyer, 2003)。. 15.

(31) 二、細胞自噬細胞自噬是細胞處於壓力環境下產生的適應性反應，普遍存在真核細胞且具調節生理平衡的功能。細胞在面臨營養缺乏、DNA 損壞或缺氧狀態下，為維持生存會啟動細胞自噬，形成的雙層膜狀將胞吞進來的物質進行蛋白質降解。早期普遍認為細胞自噬是一種自救行為；但隨後研究發現當自噬作用無法再修復劣勢時，則會引發細胞死亡，所以細胞自噬歸類為計畫性細胞死亡第二類（Programmed cell death type-II）(Coates, Galante, & Bold, 2010)。（一）自噬體（Autophagosome）的形成細胞自噬的過程起始於細胞質內形成雙層膜的結構，稱為自噬體（Autophagosome），過程包含有五個步驟：誘發（Induction）、擴張（Expansion）、完成（Completion）、靠近與融合（Docking and fusion）、降解（Degradation），是由一系列 autophagy-related gene（Atg）的基因所控制。Atg1 複合體（Atg1 complex）包含 Atg1、Atg13、Atg17、 Atg29、Atg31，位於上游，調節細胞自噬的發生。Atg12-Atg5-Atg16 蛋白促使雙層膜的模板形成吞噬泡（Phagophore）。新月形狀的吞噬泡擴張，原先存在細胞質的 microtubule-associated protein light chain 3 蛋白（Pro-LC3），也經 Atg4 作用裂解為暴露 C 端的 LC3（LC3-I），. 16.

(32) LC3-I 再經 Atg7 及 Atg3 接和上磷脂醯乙醇胺（Phosphatidylethanolamine；PE），此時的 LC3-PE 稱為 LC3-II。 Atg12-Atg5-Atg16 和 LC3-II 蛋白聚集使雙層膜擴大並將周遭的物質非選擇性及選擇性地包裹起來，形成圓形囊泡狀後，雙層膜表面上的 Atg12-Atg5-Atg16 蛋白聚合物便會脫離，留下 LC3-II 在雙層膜的內外層，此時自噬體完成，LC3-II 也成為偵測細胞自噬的指標。當自噬體與溶酶體靠近時，兩者會融合形成自噬溶酶體（Autolysosome），呈酸性，又稱為酸性囊狀胞器（Acidic vesicular organelles, AVOs）。雙層膜內包裹的物質在酶的作用下進行降解並釋放，使細胞重新獲得養份（Appendix Fig. 7）(Mizushima, Levine, Cuervo, & Klionsky, 2008; Xiao, 2007)。（二）細胞自噬相關路徑細胞自噬的產生主要有三條訊息傳導路徑，分別為（1）第一型 Phosphoinositide 3-kinase-Akt-mammalian target of rapamycin signaling pathway（Type I PI3K-Akt-mTOR）、（2）liver kinase B1-AMP-activated protein kinase（LKB1-AMPK-mTOR）及（3）第三型 PI3K/Beclin 1 signaling pathway（Type III PI3K-Beclin）。第一、二條路徑主要與 mTOR 有關，第三條與 Beclin 1 有關。(Kroemer & Jaattela, 2005; Pattingre, Espert, Biard-Piechaczyk, & Codogno, 2008)。 17.

(33) mTOR 相關路徑：mTOR 為一種參與調節細胞生長及抑制細胞自噬的激酶，具有兩種形式 mammalian target of rapamycin complex 1 （mTORC1）及 mTORC2，其中只有 mTORC1 對 rapamycin 敏感，因此 mTORC1 參與調控細胞自噬。mTOR 也與調節細胞的營養狀態有關(D.-H. Kim et al., 2002)。當細胞處於養份充足時，mTOR 被活化，抑制細胞自噬產生並促進細胞分化；反之，當養份不足或壓力刺激下， mTOR 被抑制，細胞分化受抑制並啟動細胞自噬產生(Noda & Ohsumi, 1998; R. C. Scott, Schuldiner, & Neufeld, 2004; Yousefi & Simon, 2009)。在 Type I PI3K-Akt-mTOR 路徑，細胞膜表面上的生長因子接受器接受訊息，第一型 PI3K 被磷酸化後將下游的 Akt 磷酸化，進而活化下游 mTORC1 而抑制細胞自噬產生。在 LKB1-AMPK-mTOR 路徑中， AMPK 是細胞維持代謝的重要元素，而 AMPK 的上游為 LKB1。當細胞處於能量不足的壓力下，LKB1 會活化 AMPK，阻止細胞在低能量下生長，AMPK 進而抑制 mTORC1 而產生細胞自噬(Green et al., 2011; Shackelford & Shaw, 2009)。 Beclin 1 相關路徑：Beclin 1 屬 Bcl-2 家族蛋白的一員，其包含 BH-3 domain，與抑凋亡蛋白 Bcl-2 結合具有輔助 Bcl-2 的作用。當細胞處於養份不足或其它外來壓力時，第三型 PI3K 會接收到壓力訊息， Beclin 1 與 Bcl-2 分離並與第三型 PI3K 結合，促使自噬體形成，走向 18.

(34) 細胞自噬。Type III PI3K-Beclin 1 形成複合體後，會再吸引其它可增強自噬作用的蛋白，如：ultraviolet radiation resistance-associated gene （UVRAG）蛋白、Bif-1 與 Ambra1。因此 Type III PI3K/Beclin 1 路徑可促進細胞自噬的發生(He & Levine, 2010; Sinha & Levine, 2008)。（三）細胞自噬在癌症治療的應用由於壓力會誘發細胞啟動細胞自噬或細胞凋亡，有部分的蛋白可同時參與凋亡及自噬兩者路徑；且自噬現象扮演著存活或誘導死亡兩種不同角色，所以近年來細胞自噬在癌症治療上也有許多不同的發現。在抗癌藥物施加的初期，對細胞產生代謝壓力，導致大多數的癌細胞死亡，但少數繼續存活的癌細胞因細胞自噬扮演保護的角色而有抗藥性，使得藥物效用打折(Jie Li et al., 2009; Liang & Jung, 2010)。因此配合使用細胞自噬抑制劑可促進癌細胞死亡，提高化療敏感性，例如在 2009 年發現細胞自噬抑制劑 3-methyladenine（3-MA）可提高抗癌藥物 5-FU 毒殺大腸直腸癌細胞的效用(J. Li et al., 2009)。但是，細胞自噬的產生也可以是促進癌細胞走向凋亡， 2007 年的實驗發現，刀茄素 A（Concanavalin A）抑制肝癌細胞生長是透過引發細胞自噬 (Chang, Yang, Liu, Lin, & Lei, 2007)。自噬與凋亡可能扮演相互抑制或. 19.

(35) 相輔相成的關係，因此調控細胞自噬促使癌細胞走向死亡是癌症治療的新策略(Kondo, Kanzawa, Sawaya, & Kondo, 2005)。. 20.

(36) 第四節細胞週期的意義細胞週期（Cell cycle）又稱細胞分裂週期，是指細胞由一個細胞分裂成兩個細胞的過程。細胞週期是一連串有規律的步驟，可分為間期（Interphase）與有絲分裂期（Mitotic phase；M phase），其中間期占整個細胞週期時間最長，約 90%。間期中又可區分成三個階段： DNA 合成前期 G0 及 G1（GAP 1）、DNA 合成期（Synthesis；S）及 DNA 合成後期 G2（GAP 2）。過程以 G0-G1、S、G2、M 順序進行。細胞一般處在 G0 期，當接收到指令時，進行細胞生長及準備染色體複製，此時為 G1 期，S 期進行染色體的複製使 DNA 形成相同的兩份，G2 期為合成蛋白質與酵素並準備分裂，到了進入 M 期，細胞才由一分裂為二(Kamb et al., 1994)。然而，決定細胞週期的運轉是由兩種蛋白質的調控：細胞週期蛋白（Cyclin）與細胞週期蛋白依賴性酶（Cyclin-dependent kinase；CDK），透過不同的 Cyclin 與 CDK 蛋白磷酸化作用，促使細胞週期依序進行。Cyclin D（D1、D2、D3）與 CDK4 及 CDK6 結合形成複合物活化下游分子使細胞週期進入 G1 期， Cyclin E/CDK2 複合物調控 G1 晚期進入到 S 期，Cyclin A/CDK2 複合物調控 S 期運行，Cyclin A/CDK1 複合物調控 G2 運行並進入到 M 期（Appendix Fig. 8）(Nurse, Masui, & Hartwell, 1998)。因癌細胞不正. 21.

(37) 常的分裂增生，細胞週期的調控失去正常控制如 Cyclin D1 過度表現，所以抗癌藥物的作用除誘發癌細胞產生凋亡之外，讓癌細胞的細胞週期停滯以減少癌細胞分裂也是目標之一(Hartwell & Kastan, 1994; Weinstein, 1996)。. 22.

(38) 第五節新穎化合物 Yao-ram-2-7 為解決及改善目前癌症用藥的困境，本實驗室與師大化學系合作，化學系合成一系列的化合物，交給本實驗室做抗癌化合物篩選，期望從中篩選出具有抑制癌細胞生長的化合物。實驗將 136 個化合物作用於肝癌細胞株 Hep 3B 經 6 天培養，以細胞毒殺試驗 MTT assay 測試並計算出半數致死劑量（Median inhibitory concentration；IC50），挑選出 IC50 小於 10 M 的化合物做為日後實驗選擇（Fig. 1）。Yao-ram-2-7 在這 136 個化合物中，毒殺 Hep 3B 的效果最好（半數致死劑量 IC50 = 0.5 M）。Yao-ram-2-7 的結構主要由兩種主體構成：1,2,3-triazoles 及 2H-1,4-benzoxazin-3-(4H)-one。在生理意義上，1,2,3-triazoles 具有抗細菌、抗過敏、抗癲癇及抗-HIV 活性(Buckle, Rockell, Smith, & Spicer, 1986; Genin et al., 2000)；2H-1,4-benzoxazin-3-(4H)-one 及其衍生物具有解熱、抗發炎、抗高血壓、抗潰瘍、鉀通道調節劑及抗風濕藥，對植物也具有抗微生物感染及昆蟲的傷害的作用(Anderluh et al., 2005; Macchiarulo et al., 2002)。. 23.

(39) Fig. 1 Yao-ram-2-7 is the one of 136 compounds exhibiting anticancer ability. The IC50 of Yao-ram-2-7 was determined to be 0.5 M by MTT assay.. 24.

(40) 第六節連結網路資料庫及 L1000 試驗新穎化合物在臨床運用性是一項浩大的工程，成本高且研發時程長。為了簡化困難，現今可透過生物醫學資訊比對的方式，發現老藥新用或瞭解未知化合物在生物醫學上的其它可能性。 Connectivity Map（連結網路資料庫；CMAP）即為虛擬藥物篩選的資料庫，由作者 Justin Lamb 提出。CMAP 利用 1309 個小分子藥物分別處理四株細胞（乳癌細胞 MCF-7、前列腺癌上皮細胞 PC3、血癌細胞 HL60、黑色素瘤癌細胞 SKMEL5），經微矩陣晶片（Microarray）分析得到上萬個以上的基因。透過比對資料庫中基因表現的變化，串聯藥物、基因與疾病之間的關係(Lamb et al., 2006)。L1000 assay 是基於傳統 Microarray 的方式發展出來的新穎基因表現分析平台，由 Luminex 公司提供的 Beads 偵測基因的表現。L1000 根據 microarray 中兩萬多筆基因中選出較具代表性的基因，共 978 個，稱 landmark genes。此種分析方法只需比對 978 個基因，且每次的輸出量也較傳統 microarray 多，在時間與金錢上，都較為有效率。本實驗將 Yao-ram-2-7 處理細胞，以 L1000 分析基因表現，透過與 CMAP 比對基因表現差異，得知 Yao-ram-2-7 可能與藥物 AR-A014418 具有相似的功能。. 25.

(41) AR-A014418，為肝醣合成酶激酶 3（Glycogen synthase kinase-3； GSK-3）的抑制劑（Appendix Fig. 9），化學名稱為 N-(4-Methoxybenzyl)-N′-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea。GSK-3 是一個絲胺酸/酥胺酸蛋白激酶，文獻指出 GSK 蛋白有及兩種亞型，這兩種亞型的激酶部位有 98%相同的但彼此之間功用不同且不具互補作用，其中 GSK-3參與調節多種路徑，包括代謝反應、胰島素反應及細胞分化存活與凋亡。近年來研究發現當 GSK-3功能失調或控制 GSK-3的路徑失調，會造成疾病，如：糖尿病（Diabetes）、神經退化性疾病-阿茲海默症（Alzheimer’s disease；AD）、癌症有關。因此，許多研究使用 GSK-3 的抑制劑介入實驗，發現 GSK-3 的抑制劑可以抑制 GSK-3磷酸化微管結合蛋白質 Tau（microtubule associated protein tau），進而減少 Tau 蛋白糾結沉積在腦部造成阿茲海默症；在癌症方面，因癌細胞的細胞核轉錄因子（Nuclear Factor - Kappa B； NF- B）高度表現而抑制細胞凋亡， GSK-3可促進 NF- B 的轉錄，所以發現使用 GSK-3 的抑制劑可減少 NF- B 與目標基因的結合，進而增加癌細胞死亡(Bhat et al., 2003; Hoeflich et al., 2000; Ougolkov, Bone, Fernandez-Zapico, Kay, & Billadeau, 2007)。. 26.

(42) 第二章研究目的. 本論文的研究目的為檢測 Yao-ram-2-7 是否可誘發人類肝癌細胞株 Hep 3B 產生細胞死亡，並與臨床肝癌標靶用藥 Sorafenib 比較。檢測 Yao-ram-2-7 對正常細胞的安全性，也探討 Yao-ram-2-7 或 Sorafenib 與天然物薑黃素的合併使用，期望在天然抗癌薑黃素的輔助下能提升化學藥物對癌細胞的敏感性。另外，實驗也透過生物資訊平台比對 Yao-ram-2-7 對影響基因表現的影響，藉此發現 Yao-ram-2-7 在生物利用上的其它可能性。實驗設計如下：一、確認 Yao-ram-2-7 的有效性及安全性。利用細胞毒殺試驗觀察 Yao-ram-2-7 或臨床藥物處理癌細胞及正常細胞後，對細胞生長的抑制情形。二、確認 Yao-ram-2-7 及 Sorafenib 誘發細胞死亡的模式。利用 Propidium iodide（PI）染 DNA 檢測細胞凋亡比例及細胞週期的變化；利用 Acridine orange（AO）染酸性囊狀胞器檢測細胞自噬的情況。以上實驗均利用流式細胞儀分析。三、探討 Yao-ram-2-7 或 Sorafenib 與天然物薑黃素合併使用對肝癌細胞的影響。利用細胞毒殺試驗初步觀察生長抑制率的變化，以公式計算 q 值判別效用為加乘、協同或抑制。使用流式細胞儀檢測 27.

(43) 凋亡比例及細胞週期變化，再利用西方墨點法觀察與細胞凋亡及自噬相關的蛋白表現量。四、利用連接網路資料庫 CMAP 與 L1000，比對 Yao-ram-2-7 與資料庫中藥物的相似性，並透過實驗確認 Yao-ram-2-7 與藥物 AR-A014418 的相似程度。. 28.

(44) 第三章材料與方法. 第一節儀器與實驗耗材器材名稱. 廠商. 產品型號. 二氧化碳細胞培養箱. Astec Co., Ltd, Fukuoka, Japan. SCA-165DS. HI TEN, Taiwan, ROC. 4BH-24. 恆溫水槽. Firstek Scientific, Taipei, ROC. B205-T2. 超純水數位整合系統. Millipore, Billerica, MA, USA. ZR0Q00800. 相位差顯微鏡. Olympus, Tokyo, Japan. CK-2. 電子微量天平. Denver, Bohemia, NY, USA Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA. CO2 incubator 垂直循環負壓式操作台 Laminar Flow. Milli-Q Direct 8. 高速離心機加熱攪拌器. TB-215D Allegra X-22R 392187. Corning, NY, NY, USA. Q259-1085. Hanna Instruments, Taipei, Taiwan. pH211. Scientific Industries, Bohemia, NY, USA. GENIE® VORTEX-2. Molecular Devices, San Francisco, CA, USA. 3111302-28. Stirrer 酸鹼測量器 pH meter 調速震盪器 Vortex ELISA 讀值器. 29.

(45) 多功能微孔盤光譜分析儀 Multi-Mode Microplate Reader 流式細胞儀垂直電泳槽電泳電源供應器高速半乾式蛋白質轉漬器. BioTek, Winooski, VT, USA Becton Dickinson, Lexington, KY, USA Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Synergy HT FACS can FACS Calibur BP165-8007 164-5050. Owl Scientific Inc., Woburn, MA, USA. 18712. 冰箱（-4℃, -20℃）. Whirlpool. 8ED2FHKXV T. 低溫冷凍櫃. Frigidaire. FFU2124DW. 超低溫冷凍櫃. Revco. Revco ULT 1386-3-V12. Dancing Roller The Belly Dancer. Stovall Life Science, Inc., USA. 4.702.610. 烘箱. Memmert, Germany. UNB 400. 可調式微量分注器. Gilson, Middleton, USA. U52843A. Pipetteman. Nichiryo, Tojyo, Japan. A20608. 吸管輔助器. Drummond, Broomall, PA, USA. 18-068. 玻璃吸管. Sibata, Tokyo, Japan. NC-0710. 50 ml 離心管. Greiner Bio-One, Munich, Germary Greiner Bio-One, Munich, Germary. Semi-dry Electroblotter HEP-1. Pipette-aid. 15 ml 離心管. 30. 227261 188271.

(46) 6 well 細胞培養盤 96 well 細胞培養盤 10 cm 細胞培養盤細胞培養瓶（25T）細胞培養瓶（75T）細胞冷凍管 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube （Flow 樣品管） Microtube. 拭鏡紙微量過濾器 0.22 m PVDF membrane 轉漬用濾紙. Nunc, Roskilde, Denmark Nunc, Roskilde, Denmark Nunc, Roskilde, Denmark Nunc, Roskilde, Denmark Nunc, Roskilde, Denmark Nunc, Roskilde, Denmark Becton Dickinson, Lexington, KY, USA Axygen Inc., Central Avenue Union City, CA, USA Kimberly-Clark professional, Roswell, GA, USA Millipore Corp., Billerica, MA, USA Perkin Elmer, CA, USA GenePure, USA. 140675 167008 172958 156340 156472 363401. 352052. MCT-150-C. 34155 SCGPT05RE NEF1002 GFP001. Filter Paper 細胞刮勺 Cell lifter X-ray film. Costar Corp., Cambridge, 3008 MA, USA Fujifilm, Tokyo, Japan. 31. Super RX 47410 08399.

(47) 第二節藥品與試劑 Yao-ram-2-7 由臺灣師範大學化學系姚清發教授提供 Sorafenib 由陽明大學生藥所黃奇英教授提供製造商. 藥品/ 試劑名. Sigma, St. Louis, MO, Curcumin USA AR-A014418. 產品標號 C1386 A3230. Dimethyl sulfoxide (DMSO). D2650. HEPES. H4034. Methyl alcohol. 494437. 3-4,5-Dimethyl-2-thiazolyl (MTT). M5655. NaCl. S5886. Glycerol. G5516. Penicillin. P3032. Streptomycin. S9137. Protein inhibitor cocktail. P9599. Phosphatase inhibitor cocktail. P2850. Propidium iodide (PI). P4170. Acridine orange solution hydrochloride (AO). A6014. Ribonuclease A (RNase A). R6513. Bio-Rad Laboratories, Ammonium persulfate (APS) Hercules, CA, USA Acylamide 32. 161-0700 161-0156.

(48) Merck, Darmstadt, Germany. GIBCO-BRL, NY, USA Wako, Osaka, Japan. Showa Chemical, Tokyo, Japan Applichem, Boca Raton, FL, USA Kodak, Rochester, NY, USA. Glycine. 161-0724. Protein assay dye reagent. 500-0006. N,N,N, N-tetra-methylethylenediamine (TEMED). 161-0800. EDTA. K10721018. KH2PO4. 104873. Sodium dodecyl sulfate (SDS). 113760. Trypsin-EDTA. 15400-054. Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM). 11995-040. NaHCO3. 191-0130. NaOH. 197-02125. Na2HPO4. 199-0282. Sucrose. 1900-2150. Tween 20. 2055-3250. Tris ultrapure. A1086,1000. Developer. 900943. Fixer. 1901875. Hi Media Laboratories, Bombay, Skim milk India. M530. Biological Industries Ltd., Kibbutz Beit Haemek, Israel. 04-001-1A. Fetal bovine serum (FBS). 33.

(49) Pierce, Rockford, IL, USA Fermentas, Glen Burnie, MD, USA New England Biolabs Inc., Ipswich, Australia Clonetics, Lonza Walkersville, MD, USA. Millipore Corp. Billerica, MA, USA. M-PER mammalian protein extraction reagent. 78501. Prestained protein ladder. #SM0671. Bovine serum albumin (BSA). B9001S. EGM-2 Single Quots. CC-4176. FBS. CC-4101A. Heparin. CC-4396A. GA-10000. CC-4381A. hFGF-B. CC-4113A. R3-IGF-1. CC-4115A. VEGF. CC-4114A. Hydrocortisone. CC-4112A. Ascorbic acid. CC-4116A. Chemiluminescent HRP substrate. WBKLS0100. 34.

(50) 第三節實驗方法. 一、細胞培養（一）細胞株細胞株 Hep 3B. Human hepatocellular carcinoma cell line. HUVEC. Human umbilical vein endothelial cells. （二）試劑配方溶液名稱. DMEM medium + 10% FBS. 藥品. 劑量. DMEM. 450 ml. Penicillin. 0.059 g. Streptomycin. 0.05 g. FBS. 50 ml. 保存於 4℃冰箱 EGM-2 Single Quots 培養液添加 2% FBS、0.1% heparin、0.1% GA-10000、0.4% EGM-2. hFGF-B、0.1% R3-IGF-1、0.1% VEGF、. (HUVEC 專用細胞培養液) 0.04% hydrocortisone 及 0.1% ascorbic acid 保存於 4℃冰箱，瓶外包裹鋁箔紙避光 Phosphate buffer saline (PBS) 10X. NaCl. 80 g. KCl. 2g 35.

(51) KH2PO4. 2g. Na2HPO4. 11.5 g. 加 M. Q water 至 1L、pH 7.4，經 0.22 M 過濾膜過濾，使用時稀釋成 1 倍 Trypsin. 以 PBS 1：1 稀釋，保存於-20℃冰箱. （三）細胞培養人類肝癌細胞（Hep 3B）以含有 10% FBS 的 DMEM 細胞培養液進行培養，生長環境為含有 5% CO2 氣體、37℃細胞培養箱，大約 2-3 天更換一次培養液。人類臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells；HUVEC）培養液為 EGM-2 Single Quots 添加 2% FBS、 0.1% heparin、0.1% GA-10000、0.4% hFGF-B、0.1% R3-IGF-1、 0.1% VEGF、0.04% hydrocortisone 及 0.1% ascorbic acid，生長環境同樣為含有 5% CO2 氣體、37℃細胞培養箱。（四）細胞繼代與分盤細胞在生長空間不足時容易死亡，為維持細胞良好狀態，細胞於培養盒中生長到約七、八分滿時，需繼代分盤。繼代與分盤的過程大略相同，將細胞培養盒中的培養液抽出，以 PBS 輕輕沖洗後，加入 0.25% Trypsin（2-3 ml）到培養盒中，靜置 1 至 2 分鐘後輕晃培養盒，使貼附的細胞懸浮，加入 5 ml 的細胞培養液終止 Trypsin 反應，並稍加打散細胞，此時將部分多餘的細胞懸浮液丟棄，加入細胞培養液繼 36.

(52) 續培養，此時完成繼代；若將細胞懸浮液加到新的培養皿，再加入約 10 ml 的細胞培養液即為分盤。Hep 3B 使用代數約為 15-20 代需要更新細胞，HUVEC 則不超過 5 代為優。（五）、解凍細胞為維持細胞良好狀態，當使用到一定的代數時，需更換成解凍的新細胞。準備一隻 15 ml 的離心管，管內加入 10 ml 的細胞培養液。查看細胞紀錄簿確認欲取細胞的編號，將冷凍於液態氮桶內的細胞拿出，帶回細胞操作台內，以手心來回搓細胞凍管管壁的方式，讓凍管內之細胞液稍微解凍，接著加入 1 ml 細胞培養液使細胞液解凍並將細胞液吸取排放到含有 10 ml 的細胞培養液的離心管中，以速度 1000 rpm 離心 5 分鐘。離心完倒掉上清液後，pippetman 吸取 1 ml 細胞培養液輕輕打散細胞，吸取細胞液至 25T 細胞培養盒中，加入 4 ml 細胞培養液於盒內，即完成解凍細胞。隔天再予以更換一次細胞培養液，以培養細胞方式進行培養即可。（六）、冷凍細胞為保持細胞品質與數量，當新解凍後的細胞培養到第 3 代時，狀態良好即可進行冷凍步驟。如同繼代細胞，先將細胞打下後置於 15 ml 離心管內以 1000 rpm 離心 5 分鐘，此時準備細胞冷凍小管，標記細胞名稱、冷凍日期、冷凍者與細胞代數。離心完倒掉上清液，依欲冷 37.

(53) 凍的管數，以每管 900 l 細胞培養液計算培養液的取量。舉例：以一個八分滿 75T，約可冷凍成 5 支冷凍小管，細胞培養液的取量就為 900 l × 5＝4500 l。均勻混合，每支細胞凍小管中加入 900 l 的細胞混合液，最後再加入 100 l DMSO 做為抗凍劑，以防止快速結凍造成細胞破裂。冷凍過程為-20℃冰箱，30 分鐘，再放入-80℃低溫冷凍櫃隔夜，最後放入液態氮桶中保存。. 二、化合物的配製（一）Yao-ram-2-7 化合物配製 Yao-ram-2-7 的分子量（molecular weight；M.W.）為 330.1327。粉末狀的 Yao-ram-2-7 先分裝於 microtube 中，秤取克數落在 0.00059~0.00099 克不等，保存於-20℃並保持乾燥狀態。溶媒為 DMSO，取 10 l 的 DMSO 溶解 Yao-ram-2-7 後再加入 990 l 細胞培養液。依分裝 Yao-ram-2-7 克數計算出當次實驗 Yao-ram-2-7 的濃度，從中取出實驗所需的濃度。（二）薑黃素的配製薑黃素的分子量為 368.5。溶媒為 DMSO，先配製成濃度為 30 mM 的庫存液（stock solution）1 ml 置於-20℃，一個月重新配置一次。實驗時再將庫存液以 DMEM 稀釋成 30 M。 38.

(54) （三）Sorafenib 的配製 Sorafenib 由陽明大學黃奇英老師提供，庫存液濃度為 10 mM，保存於-20℃冰箱。實驗時再將庫存液以 DMEM 稀釋成 1 mM 後，再依實驗所需濃度調配。（四）AR-A014418 的配製 AR-A014418 的分子量為 308.31。溶媒為 DMSO，粉末態的 AR-A014418（5 mg）溶於 1 ml DMSO 配製成庫存液，濃度為 16.217443 mM，保存於 4℃冰箱中。依實驗所需濃度再做稀釋。. 三、細胞毒殺試驗配製 MTT 溶液名稱. 藥品. 劑量. MTT. MTT. 5g. 以 100 ml PBS 稀釋成 5 mg/ml，使用避光的 microtube 分裝，保存於-20℃ MTT 為黃色的化合物，可與活細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase）作用，使黃色的 MTT 轉變成藍紫色的 formazan 結晶，但死細胞因其琥珀酸脫氫酶消失，不會生成藍紫色結晶。因此可藉由呈色的差異判斷細胞存活比率。 39.

(55) Hep 3B 細胞先以含有 1%FBS 的 DMEM 培養液培養在 96 well 培養盤中，細胞密度為 8×103/well；HUVEC 細胞使用該專用培養液，細胞密度同為 8×103/well。待 12 小時細胞貼附，依實驗目地，置換成 10%FBS 的 DMEM 培養液配製不同濃度的藥物，將培養盤放入細胞培養箱中培養。培養至實驗目地時間點，將培養液抽起去除，每個孔洞加入 30 l 濃度為 5 mg/ml 的 MTT，置於 37℃避光 4 小時。最後加入 DMSO 100 l/well 反應 5 分鐘使藍紫色的 formazan 結晶溶出，利用多功能微孔盤光譜分析儀檢測其 590 nm 的吸光值。數值的差異可代表細胞的存活比率及抑制生長比率，經公式推算後可得知藥物造成半數致死劑量（IC50）。. 四、細胞週期分析配製 PI 染劑溶液名稱. PI 染劑. 藥品. 劑量. PI. 2 μg/ml. RNase A. 100 g/ml. 染色前混合 2 者，PI 與 RNase A 比例為 20：5 (單位：l). PI 為核酸嵌合物，能與細胞內的 DNA 或 RNA 結合，實驗為排除雙股 RNA 的干擾，染劑中配合加入 RNase A。正常細胞內染色體 40.

(56) 在細胞週期 G0/G1 期有 2 套染色體（2N），G2/M 期有 4 套染色體（4N）， S 期則介於以上 2 期之間。當細胞進行凋亡時，細胞內之 DNA 會斷裂成許多小片段，使得染色體數目少於 2N，在 G0/G1 期之前出現波峰，即為 Sub-G1。因此，實驗利用流式細胞儀偵測，觀察細胞凋亡的比率及細胞週期改變。 Hep 3B 細胞以密度 1×105/well 培養於 6 well 培養盤，用含有 1%FBS 的細胞培養液使細胞貼附。細胞貼附後，置換成以 10%FBS 的 DMEM 培養液配製不同濃度藥物的溶液，於不同時間點收取細胞。控制組細胞之培養液丟棄，以 PBS 輕輕沖洗；經藥物作用的組別則將細胞培養液依組別收集到 15 ml 離心管中。加入 trypsin 使細胞脫落，收集至同一離心管。細胞液以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液，加入冰的 PBS 1 ml 沖洗，再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液，最後加入 70%酒精 1 ml 在 4℃冰箱隔夜固定。上機前，將細胞以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除酒精，加入 1 ml 的 PBS 打散細胞再次以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液，加入 800 l 的 PBS 打散細胞。最後在避光環境下，將每個樣品加入 PI 與 RNase A 混和均勻。靜置 30 分鐘，上機前以 35 um 尼龍篩網過濾樣本至 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube，以流式細胞儀（FACS can, Becton Dickinson）讀取細胞，數據以 WinMDI 2.8 軟體（Windows Multiple Document 41.

(57) Interface Flow Cytometry Application）分析細胞凋亡比例及細胞週期變化。. 五、檢測細胞自噬比例配製 AO 染劑溶液名稱. 藥品. 劑量. AO 染劑. AO. 1.5 g/ml. 弱鹼性的 AO 染劑能與酸性囊狀胞器結合，散發出紅色螢光，以流式細胞儀分析得知細胞自噬比例。 Hep 3B 細胞以密度 1×105/well 培養於 6 well 培養盤，使用含 1%FBS 的 DMEM 使細胞貼附。待 12 小時細胞貼附後，置換成以 10%FBS 的 DMEM 培養液配製之不同濃度的藥物處理。培養至所需時間後將培養液吸起排除，在避光環境下加入含有 acridine orange 的培養液將細胞染色，每一孔洞加入 1 ml，靜置 15 分鐘後將染劑回收到 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube，細胞以 trypsin 作用使之脫落，收集至同一 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube。經流式細胞儀（FACS Calibur, Becton Dickinson）讀取細胞，數據以 WinMDI 2.8 軟體分析. 自噬小體產生比例。若需要樣品帶去其它實驗室分析，則是將培養液. 42.

(58) 吸起排除後，用 trypsin 作用使細胞脫落收取至 15 ml 離心管中，室溫離心 1000 rpm，3 分鐘。倒掉上清液，每個樣品加入 1 ml 之含有 10%FBS 的 DMEM 培養液，將細胞輕輕沖打起來，細胞液吸取置換到 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube，即可帶到其它實驗室分析。 10%FBS 的 DMEM 培養液目的為讓細胞保持活著的狀態。達目的實驗室後，AO 染劑取 1.8 l 加入 12 ml DMEM 中並混勻稀釋，再取 200 l 加入每樣品中混和，避光染色 15 分鐘即可上機分析。. 六、西方墨點法 (一)、收取細胞蛋白（whole cell lysates）溶液配方溶液名稱. 藥品. 劑量. Lysis buffer. M-PER@ mammalian protein extraction reagent Protein inhibitor cocktail Phosphatase inhibitor cocktail. 250 l 1 l 1 l. 依細胞盤數配製 Lysis buffer 所需之量，以上藥物比例依序為 250：1：1 (單位： l) Hep 3B 細胞以 10 cm 培養盤培養（1×106/dish）。待細胞貼附於培養盤，置換含有不同濃度藥物的培養液。培養至實驗所需時間，將培 43.

(59) 養盤從細胞培養箱拿出放在冰上收取細胞。未經處理藥物的控制組，直接將培養液吸起丟棄，加入適量 PBS；經藥物處理組別則要保留培養液。使用細胞刮勺將貼附於培養盤上的細胞仔細刮起並分別收至離心管中，在 4℃及 3000 rmp 下離心 5 分鐘後倒掉上清液。下層沉澱物以 500 l PBS 沖打吸取收至標記好之 microtube 中，重複 3 次，樣品以轉速 3000 rmp 離心 10 分鐘後去除上清液並加入 lysis buffer。Lysis buffer 為依照細胞盤數取量，一盤以 40 l 計量。加入 lysis buffer 後每隔 5 分鐘 vortex 震盪數秒，共計 6 次後在 4℃下以轉速 12000 rpm 離心 5 分鐘。離心完成後，吸取之上清液為 total protein。Total protein 樣品保存於-80℃冰箱。（二）、測定蛋白質濃度（Lowry assay）標準品 BSA 溶液稀釋比例標準品 BSA 溶液. BSA 取量(l). PBS 取量(l). 0. 150. 2.5 mg/ml. 3.8. 146.2. 5 mg/ml. 7.5. 142.5. 7.5 mg/ml. 11. 139. 1 mg/ml. 15. 135. 1.25 mg/ml. 19. 131. 0 mg/ml. 溶液配方溶液名稱. 藥品. 劑量 44.

(60) 1M Tris. 3.5 ml. Bromophenol blue. 6 mg. SDS. 1.2 g. 100% Glycerol. 3 ml. M.Q water. 7 ml. 2-mercaptoethanol. 50 l. 6X SDS loading dye 前 4 項藥品與 M.Q water 混合溶解後保存於室溫。需要時取出 950 l 再加入 2-mercaptoethanol 50 l，以棕色 microtube 盛裝保存於 4℃。. 1X SDS loading buffer. Tris (1M). 2.5 ml. 10% SDS. 10 ml. 10% Glycerol. 5 ml. M.Q water. 32.5 ml. 蛋白質樣品（total protein）放冰上解凍，進行 10 倍稀釋蛋白質樣品（sample：PBS＝3 l：27 l），混合均勻後取 10 l 與 490 l Protein assay dye 混合，在避光環境下取 100 l 加至 96 孔盤中四重覆。標準品為 BSA，濃度為 0，0.25，0.5，0.75，1，1.25 mg/ml。取 10 l 之標準品與 490 l Protein assay dye 混合後，同樣取 100 l 加至 96 孔盤中，做四重覆。利用多功能微孔盤光譜分析儀檢測其 590 nm 的吸光值，計算標準品的方程式以回推樣品之蛋白質濃度。計算出樣品蛋白質濃度，將樣品與 6 倍 Loading dye 及 Loading buffer 混合後置於 100. 45.

(61) ℃水中加熱煮沸 10 分鐘，經離心即可加入電泳膠的樣品槽中。若無立即使用，則保存於-20℃冰箱中隔天使用。（三）、聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE eletrophoresis）溶液名稱. 藥品. 劑量. Tris (1.5 M，pH 8.8). Tris. 18.7 g. 加入 M.Q water 至 100 ml，pH 8.8 Tris (1.5 M，pH 6.8). Tris. 12.11 g. 加入 M.Q water 至 100 ml，pH 6.8 10% APS. APS. 0.1 g. M.Q water. 1 ml. M.Q water. 2.3 ml. Tris（1.5M，pH 8.8）. 2.5 ml. 30% acrylamide mix. 5 ml. 10% SDS. 0.1 ml. 10% APS. 0.1 ml. TEMED. 0.004 ml. M.Q water. 2.1 ml. Tris（1.5 M，pH 6.8）. 0.38 ml. 30% acrylamide mix. 0.5 ml. 10% SDS. 0.03 ml. 10% APS. 0.03 ml. TEMED. 0.003 ml. Tris. 15.1 g. Glycine. 72 g. SDS. 5g. Resolving gel (15%，10 ml/one piece). Stacking gel (5%，3 ml/one piece). 5X SDS-page running buffer. 46.

(62) 加入 M.Q water 至 1 liter，調整 pH 值至 8.3 使用時再以 M.Q water 稀釋到 1 倍 Tris. 30.3 g. Glycine. 144 g. 加入 M.Q water 至 1 liter，調整 pH 值至 8.3 10X transfer buffer. 使用時稀釋 1X 配法為： 10X transfer buffer：100 ml M.Q water：700 ml Methanol：200 ml. Blocking buffer. TBST. Skim milk. 0.5 g. TBST. 10 ml. Tris. 12.114 g. NaCl. 43.875 g. Tween 20. 5 ml. 加入 M.Q water 至 5 liter，調整 pH 值至. Chemiluminescent HRP substrate（感光劑）. 7.4 HRP Substrate Peroxide Solution HRP Substrate Luminol Reagent. 1 ml 1 ml. 兩者以 1：1 混合 Developer Developer（顯影劑）. 加入 M.Q water 200 ml 稀釋 47. 50 ml.

(63) Fixer Fixer（定影劑）. 50 ml. 加入 M.Q water 200 ml 稀釋. 一級抗體廠商. 抗體名稱. 編號. Abcam, Cambridge Science Park, UK. Rabbit anti-LC3B. Ab48394. Rabbit anti-Caspase-3. #9662. Cell Signaling Technology, Inc., Rabbit anti-GSK-3β #9315 Danvers, MA, USA Rabbit #9331 anti-Phospho-GSK-3α/β 二級抗體廠商. 抗體名稱. 編號. Millipore Corp., Billerica, MA, USA. Goat anti-rabbit (H+L) AP307P HRP conjugate. 電泳設備先將兩片玻璃架好，把配製好的 Resolving gel solution 倒入兩片玻璃間，上方以 methanol 壓平膠片，待 Resolving gel 凝固之後移除 methanol 加入配製好的 Stacking gel solution，並於上方插入分離梳，待 Stacking gel 凝固後將膠片以保鮮膜包裹起來，泡在 M.Q water 中靜置於 4℃冰箱隔夜讓膠片更為穩定。隔天操作時將膠片安裝到電泳槽內，在電泳槽裡倒入 Running buffer，拿掉分離梳。將煮沸加熱後的樣品加入電泳膠的樣品槽中，以電壓 100 V 跑 1.5-2 小時確認蛋白質位置。. 48.

(64) （四）、蛋白質的轉漬、作用抗體與顯影電泳結束，將膠片取出，將 filter paper 浸泡於 1X transfer buffer， PVDF membrane 浸泡於 methanol，以三明治夾層的方式擺放，順序由下往上為：filter paper、膠片、PVDF membrane、filter paper，以半乾式（Semi-dry）轉漬將膠片上的蛋白質從膠片（負極）轉漬到 PVDF membrane（正極），轉漬條件為電流 400 mA、1.5 小時。轉漬完成後 PVDF membrane 置於含有 5% skim milk 的 TBST buffer（20 ml/membrane）室溫一小時或 4℃隔夜進行 blocking。經 blocking 的 membrane 以 TBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘。使用稀釋好的一級抗體於 4℃下作用 16-20 小時。待一級抗體作用完畢後，抗體回收， membrane 以 TBST 清洗 3-5 次，每次 10 分鐘，再與特定的二級抗體於室溫下作用一小時，以 TBST 清洗 3-5 次，每次 10 分鐘，最後在 PVDF membrane 上加感光劑，使 PVDF membrane 上的樣本發出螢光，利用顯影劑、定影劑與底片進行感光成像。底片經掃描以軟體 Image J 影像軟體（USA National Institutes of Health；NIH）定量分析。. 49.

(65) 第四章結果. 第一節 Yao-ram-2-7 可抑制癌細胞 Hep 3B 的生長，但對人類正常臍靜脈內皮細胞 HUVEC 傷害較低 Yao-ram-2-7 及臨床肝癌標靶用藥 Sorafenib 以 DMSO 為溶媒，再以細胞培養液稀釋成不同濃度 0-20 M 處理 Hep 3B；人類正常臍靜脈內皮細胞 HUVEC 則將 Yao-ram-2-7 及 Sorafenib 的劑量提高到 50 M（0-50 M）。藥物處理時間為 24 及 48 小時，以 MTT 分析檢測，計算出細胞生長抑制的百分比及 IC50。結果顯示，在最高劑量及最長時間點（20 M、48 小時），Yao-ram-2-7 抑制 Hep 3B 生長的效果不及 Sorafenib 強，但 Yao-ram-2-7 在短時間及較低劑量下就能發揮抑制細胞生長的效用，反觀 Sorafenib 僅在實驗最高劑量 20M 或長時間（48 小時）才有明顯藥效（Fig. 2）。對於 HUVEC 細胞，無論時間長短或劑量高低，Sorafenib 抑制正常細胞的生長的能力均較 Yao-ram-2-7 強烈，顯示 Yao-ram-2-7 的安全性優於 Sorafenib（Fig. 3）。 IC50 結果統計發現（Table 1），以 Yao-ram-2-7 或 Sorafenib 處理 Hep 3B 細胞之 IC50 沒有顯著差異；兩種藥物分別處理 HUVEC 細胞之 IC50 則是 Sorafenib 對 HUVEC 的 IC50 較低，有顯著差異（p < 0.05），指出 Sorafenib 對正常細胞的傷害較大。以單一藥物處理不同細胞之統 50.

(66) 計比較，Sorafenib 處理 Hep 3B 或 HUVEC 細胞之 IC50 沒有顯著差異，而 Yao-ram-2-7 處理 Hep 3B 或 HUVEC 則有顯著差異（p < 0.05）。以上足見 Yao-ram-2-7 與 Sorafenib 毒殺 Hep 3B 細胞的能力相當，但對正常細胞傷害較小。. 51.

(67) Fig. 2 Effect of Yao-ram-2-7 or Sorafenib on Hep 3B cell viability determined by MTT assay. Hep 3B cells (8×103 cells/well) were treated with 0-20 M Yao-ram-2-7 or Sorafenib for 24 and 48 h. Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay. Data are presented as means ± SEM. Results are representative of three independent experiments.. 52.

(68) Fig. 3 Effect of Yao-ram-2-7 or Sorafenib on HUVEC cell viability determined by MTT assay. HUVEC cells (8×103 cells/well) were treated with 0-50 M Yao-ram-2-7 or Sorafenib for 24 and 48 h. Percentage of inhibition on HUVEC cells was measured by MTT assay. Data are presented as means ± SEM. Results are representative of three independent experiments.. 53.

(69) Table 1 The IC50 of Yao-ram-2-7 and anticancer drug Sorafenib. Hep 3B. HUVEC IC50 (M). Yao-ram-2-7. 16.8 ± 0.9b. 115.0 ± 16.9a. Sorafenib. 11.2 ± 0.6b. 40.6 ± 13.0b. Hep 3B cells (8×103 cells/well) were treated with 0-20 M Yao-ram-2-7 or Sorafenib. HUVEC cells (8×103 cells/well) were treated with 0-50 M Yao-ram-2-7 or Sorafenib. After 48 h of incubation, growth inhibition was evaluated by MTT assay. The data are expressed as means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05. Results are representative of three independent experiments.. 54.