第三章 材料與方法
二、 實驗方法
(一) 咖啡、玉蘭花及檄樹之葉甲醇萃取物之製備 1. 甲醇萃取物之製備
秤取咖啡、玉蘭花及檄樹的乾燥葉各10 g，分別加入甲醇 300 mL，浸潤 60 分鐘後，以超音波震盪器震盪 1 小時，經布氏漏斗抽氣 過濾。同上步驟再萃取一次，合併濾液，減壓濃縮至浸膏狀，置於抽 氣櫃揮去溶媒後，乾固物儲存於乾燥箱備用。
2. 酸水解物之製備
取上述咖啡、玉蘭花及檄樹甲醇萃取物10 mg，分別各加入 1.2 N、2.4 N HCl 2 mL 混勻後，置於 80℃水浴鍋中反應 30 分鐘後，以
等容之乙酸乙酯分配萃取兩次，以6000 rpm 離心 5 分鐘後，分取上 層，合併上層液體，以減壓濃縮設備濃縮至乾，置於- 20℃下備用。
(二) 明膠分解試驗 (gelatin digestion assay)(Kim et al., 2006b)
本研究以細菌膠原蛋白酶進行初篩，即以明膠分解試驗(gelatin digestion assay)評估其活性，進而測定對於細菌膠原蛋白酶的抑制率。
1. 試劑之配製
(1) 2倍緩衝溶液之配製(50 mM Tris–HCl, 10 mM CaCl2, 0.15 M NaCl, pH 7.8)
取1 M Tris–HCl (pH 7.8) 5 mL, 1 M CaCl2 1 mL, 4 M NaCl 3.75 mL，加二次水至100 mL。
(2) 1 % 明膠培養基之製備
秤取 agarose 1 g，加入2倍緩衝溶液45 mL，二次水45 mL以及以2 倍緩衝溶液配製的1.5 % 明膠溶液10 mL，置於微波爐中加熱至起泡 溶解。趁熱倒入13 mL於製膠容器(8 cm × 6 cm)中，靜置凝固，冷藏 備用。
(3) 細菌膠原蛋白酶之配製
取膠原蛋白酶100 mg 以緩衝溶液(50 mM Tris-HCl pH7.8，3.6 mM CaCl2)少量溶解的，待完全溶解後定容至 10 mL。並分裝至微量離心 管中，儲存於-20℃備用。
(4) Doxycycline溶液之配製
秤取doxycycline 0.05 g，加1 mL 水溶解；置於-20℃備用。
(5) 檢品溶液之配製
咖啡、玉蘭花及檄樹萃取物及其水解物以50 %丙二醇溶解，使成 檢品濃度為10 mg/mL。
(6) 染色液之配製
取 Coomassie blue R-250 1.25 g，amido black 0.5 g，加入甲醇 227 mL及冰醋酸 46 mL，溶解後加水至500 mL。
(7) 退染液之配製
取甲醇 50 mL、冰醋酸 75 mL混合後，加水至1000 mL。
2. 實驗操作步驟
於微量離心管中加入2倍緩衝溶液50 μL、水 30 μL、膠原蛋白酶 (0.1 mg/mL) 10 μL、檢品溶液或 doxycycline 溶液(做為正對照) 10 μL 混合均勻，於室溫下反應60分鐘。將反應產物以微量移液管吸取40 μL 滴於明膠培養基上的濾紙片，置於37℃，溫孵18小時後，移除濾紙片，
以染色液染色。再以退染液退染至適當顏色對比。拍照後，影像以 TINA軟體分析，計算其抑制率。
3. 抑制率之計算
抑制率(%) = × 100%
( C-B)
A : 無酶，無檢品 B : 無檢品
C : 有檢品
進行三次獨立試驗後，計算平均值及標準偏差 (standard deviation, S.D.)。
(三) 膠原蛋白酶抑制試驗(Kim et al., 2006b)
細菌膠原蛋白酶，以不同濃度檢品處理後，再以螢光受質偵測其 抑制酵素活性及其是否具濃度依存性。
1. 試劑之製備 (1) 10倍緩衝溶液
1 M Tris (pH 7.8) 5 mL 1 M CaCl2 1 mL 4 M NaCl 3.75 mL H2O 0.25 mL (2) Fluorogenic Peptide Substrate I 溶液之製備
螢光受質粉末 1 mg加入水1 mL溶解，置於-20 ℃備用。使用前再 以水稀釋至適當濃度。
2. 實驗操作步驟
取水 480 μL注入微量離心管中，再加入10倍緩衝溶液 80 μL、檢 品 80 μL、膠原蛋白酶 80 μL (0.01 mg/mL)、螢光受質 80 μL (10
uM)，混合均勻後，放入37℃培養箱中溫孵20小時。分別於328 nm測 激發光，393 nm測放射光。
3. 抑制率之計算
抑制率(%) = × 100%
A : 有酶，無檢品 B : 無酶，無檢品 C : 有酶，有檢品 D : 無酶，有檢品
進行三次獨立試驗後，計算平均值及標準偏差 (standard deviation, S.D.)。
(四) 彈力蛋白酶抑制試驗(Kim et al., 2007; Tsukahara et al., 2006) 本試驗以猪胰臟的彈力蛋白酶進行初篩。
1. 試劑之製備
(1) 彈力蛋白酶之製備
取500 U彈力蛋白酶以10 mM Tris pH 6.0緩衝溶液 5 mL溶解，分 裝至微量離心管中，置於-20 ℃備用。
(2) 彈力蛋白酶受質 IV 溶液之製備
取彈力蛋白酶受質IV粉末5 mg，以100 mM Tris pH 8.0緩衝溶液 5 mL溶解，分裝至微量離心管中，置於-20 ℃備用。
( A-B) (A-B)-(C-D)
2. 實驗操作步驟
取100 mM Tris pH 8.0緩衝溶液100 μL加入96孔盤中，再依序加入 彈力受質IV溶液(2.5 mg/mL) 25 μL、檢品50 μL、彈力蛋白酶(1 U/mL) 25 μL。混合均勻，靜置於室溫20分鐘，以ELISA reader於波長405 nm 讀取OD值。
3. 抑制率之計算
抑制率(%) = 1 － × 100%
A : 有酶，無檢品 B : 無酶，無檢品 C : 有酶，有檢品 D : 無酶，有檢品
進行三次獨立試驗後，計算平均值及標準偏差 (standard deviation, S.D.)。
(五) 細胞培養
(1) Hs 68細胞培養條件 BCRC編號 60038
組織來源 Human foreskin fibroblast 細胞來源 食品工業發展研究所
( A-B) ( C-D)
培養基
90% Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose + 10% fetal bovine serum
培養條件 37℃, 5% CO2
冷凍培養基 93% culture medium + 7% DMSO
細胞型態
(六) 纖維母細胞之UVB照射實驗
先確立UVB照射纖維母細胞誘發基質金屬蛋白酶試驗模式之 UVB照射劑量，再據以UVB光源照射經不同濃度檢品處理之纖維母 細胞，供後續活性抑制試驗探討。
1. 檢品製備
取檢品100 mg，以1 mL DMSO復溶。於無菌操作台內以0.2 μm無 菌濾膜過濾。再以培養液稀釋至所需濃度。
2. 實驗操作步驟
(1) 纖維母細胞之檢品處理與UVB照射
待纖維母細胞長至緻密度80%後，將培養液換成不同濃度檢品培 養液。15分鐘後，將培養液吸除後，加入PBS溶液潤洗2次，再加入 PBS溶液。將細胞置於UV燈源下，以UV照射後，吸除PBS溶液再加 入無血清培養液繼續培養24小時。
(七) 分離細胞內細胞質之蛋白質
本試驗以破碎緩衝溶液破碎細胞再以離心的方式，取得位於細胞 質之蛋白質，以備蛋白質分析用。
1. 緩衝液之製備 (1) RIPA 緩衝液
取1 M Tris-HCl （pH 7.4）25 mL，NaCl 4.38 g，DL-dithiothreitol 0.0771 g，Sodium deoxycholate 2.5 g，0.5 M EDTA 1 mL，IgepalTM CA-630 5 mL及10 % SDS 5 mL，置於血清瓶中，加二次水至500 mL，
混溶滅菌備用。
(2) 破碎緩衝溶液
將 1 mL RIPA緩衝溶液新鮮加入10 mM Na3VO410 μL，Leupeptin 2 μL (10 mg/mL)及10 μL PMSF(10 mg/mL)即得。
2. 實驗操作步驟 (1) 萃取蛋白質
將培養液吸除，以預冰之PBS溶液清洗。後續的步驟皆於冰上操 作。加入破碎緩衝溶液適量，以刮棒將細胞全數刮下，移至微量離心 管。以12100×g 於4℃離心10分鐘後，吸取上清液，上清液進行蛋白 質定量。
(2) 蛋白質定量
以不同濃度之Albumin from bovine serum (2、4、6、8、10 mg/mL) 與檢品加入Bradford’s reagent (使用前以預冰之二次水稀釋5倍) 200 μL，反應10分鐘後 (不可超過1小時)，於波長595 nm測定吸光值。
(八) 西方墨點法
以從細胞質分離出之蛋白質，以電泳法分離後，再測定特定蛋白 質量。
1. 緩衝液與試劑之製備
(1) Upper gel buffer-stacking buffer (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8)
稱取Tris 30.3 g 置於燒杯中，加入水約300 mL，以磁石攪拌機混 勻後，以12 N HCl 調整 pH值 至 6.8，再倒入量筒中，加水至500 mL，倒入血清瓶中，高壓滅菌後備用。
(2) Lower gel buffer-running buffer (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8)
稱取Tris 90.6 g置於燒杯中，加入水約300 mL，以磁石攪拌機混 勻後，以12 N HCl 調整 pH 至 8.8，再倒入量筒中，加水至500 mL，
倒入血清瓶中，高壓滅菌後備用。
(3) 10倍 Laemmli tank buffer
稱取 Tris 15.1 g及 glycine 93.8 g置於燒杯中，倒入量筒中，加水 至500 mL，倒入血清瓶中，高壓滅菌後備用。此貯備溶液使用前需稀 釋成1倍，稀釋方式如下：取Laemmli tank buffer (10倍)50 mL及10%
SDS 5 mL，加水至 500 mL即得。
(4) 8倍 Transfer buffer
稱取 Tris 24.2 g及 glycine 115.4 g置於燒杯中，倒入量筒中，加 水至1 L (pH 8.3)，倒入血清瓶中，高壓滅菌後備用。使用前需稀釋成 1倍，稀釋方式如下：取貯備溶液 250 mL，甲醇 400 mL，加水至2 L，
貯於4℃中備用。
(5) 5倍 TBST
a. 1 M Tris-HCl (pH 7.5)：稱取Tris 60.6 g，加入約300 mL水，以 磁石攪拌機混勻，以 12 N HCl 調整 pH 至 7.5，加水至500 mL，經 高壓滅菌後備用。
b. 4 M NaCl：稱取NaCl 233.8 g，加水至500 mL，經高壓滅菌後 備用。
c. 取 4 M NaCl 溶液312.5 mL、1 M Tris-HCl 50 mL、Tween 20 2.5 mL及135 mL H2O混合均勻，即成5倍TBST，冰存於4℃冰箱，使用前 以水稀釋成1倍即得。
(6) 4倍檢品緩衝液
取 glycerol 4 mL、bromophenol blue 40 mg、upper stacking buffer 5 mL、SDS 400 mg 混合均勻後，分裝至微量離心管中，每管0.9 mL，
貯存於 -20℃，使用前加 2-mercaptoethanol 100 μL，須保存於4℃冰 箱。
(7) 10％ SDS溶液
取SDS1 g溶於10 mL 水中。
(8) 10％ APS溶液
取APS 0.1 g 溶於1 mL水中。
(9) MTBST (Tris-Buffered Saline Tween-20 contain 5% non-fat milk) 取TBST 50 mL 加入2.5 g脫脂奶粉。
2. 實驗操作步驟
取各細胞檢品相當於30 μg之蛋白質與4倍檢品緩衝液以3：1比例 混合後，以二次水調整體積，置沸水中水浴鍋5分鐘
。
以10% 之 SDS-PAGE，電壓70伏特，進行電泳30分鐘，再以電壓140伏特，進 行電泳2小時。以400毫安培通電100分鐘將其轉印至 PVDF 轉印膜 上。將MTBST加於轉印膜，搖盪2小時後，以1倍TBST清洗數次，再 加入一級抗體 (以含5 % Albumin from bovine serum之TBST稀釋，β-actin 稀釋 1000 倍；MMP-1、MMP-3、MMP-9、type I procollagen、
ERK、JNK、p38、p-ERK、p-JNK、p-p38 稀釋 500 倍)，置於 4℃ 冰 箱中搖盪至隔夜（至少16小時），回收一級抗體，再以TBST清洗數次 後，加入二級抗體 (以含5%BSA之TBST稀釋 5000 倍)，置於室溫搖 盪 2 小時，回收二級抗體，再以1倍TBST清洗數次。最後移去1倍 TBST 加入ECL試劑，以LAS-4000顯影，multi Gauge V2.2定量分析。
(九) 細胞毒性試驗（MTT assay）
本實驗以不同濃度之檢品處理纖維母細胞，以了解其細胞毒性。
1. 試劑之製備
(1) MTT 溶液 (5 mg/mL) 之配製
稱取MTT 100 mg溶解於PBS溶液 20 mL中，使成5 mg/mL，以褐 色微量離心管分裝，置於-20℃備用。
(2) SDS 溶液 (10 % SDS in HCl)之配製
稱取SDS 100 g 溶於0.01 N HCl 1 L中即得，避光存放。
2. 實驗操作步驟
將細胞接種於96孔盤中，每孔接種 104 cells/well 待24小時後，加 入待測檢品50 μL，經24小時培養後，加入 MTT 溶液15 μL，置37℃
培養箱中3小時，加入 SDS溶液75 μL，隔夜於波長570 nm下測定吸 光值。
3. 抑制率之計算
% 100
(%) = ×
控制組吸光值 實驗組吸光值 細胞存活率
(十) 皮膚一次刺激性試驗(日本化粧品工業連合会, 2001) 1. 檢品之製備
秤取咖啡、玉蘭花萃取物0. 1 g（低劑量）， 0.5 g（高劑量）檢品，
以1 mL生理食鹽水復溶備用。
2. 實驗操作步驟
將紐西蘭大白兔固定於兔架上，剃除背毛，以色筆畫出塗抹範圍 每格2.5 cm × 2.5 cm，共6格。於格內以無菌針頭於皮膚上輕劃4條平 行線，破壞角質層，不可見血。將檢品均勻塗佈於格內。24小時後，
以生理食鹽水輕拭，除去檢品，於24與72 小時兩個時間點觀察、評 分(如Table 13)，若有刺激性產生則需延長觀察時間。
(十一) 眼球刺激性試驗(Wilhelmus, 2001; 日本化粧品工業連合会, 2001)
1. 檢品之製備
取咖啡、玉蘭花萃取物300 μg溶於1 mL生理食鹽水，以6000 rpm 離心5分鐘，取其上清液供作檢品。
2. 實驗操作步驟
取檢品100 μL，滴入白兔結膜囊，將白兔眼睛輕輕闔上。於1、5、
15、30分鐘，1、2、24、48、72小時等時間點觀察記錄、評分(如附 錄Table 14)，若具刺激性須延長觀察時間。
(十二) 統計方法
以ANOVA及Student’s t test進行數據分析，p＜0.05表示於統計上 有顯著差異，且每個實驗進行三次以上獨立實驗，實驗結果以 mean
± S.D. 表示。