討論

一、 咖啡，玉蘭花及檄樹萃取物及其水解物對於膠原蛋白酶活性 之影響

諸多文獻指出(Brenneisen et al., 2002; Dong et al., 2008; Uitto, 2008)，照射 UV 會提高膠原蛋白酶的活性，進而降解充填於皮膚真 皮細胞外基質之膠原蛋白，而形成皺紋。因此篩選抑制膠原蛋白酶活 性成分或萃取物，可開發成為抗光老化的化妝品原料。目前這類研究 多以膠原蛋白酶為標的，探討抑制活性的效果。例如：迷迭香水萃物 能透過調節IL-1α與 IL-6 抑制 MMP-1 基因的轉譯，屬專一性抑制 MMP-1 的活性(Martin et al., 2008)。黃酮類化合物(quercetin,

kaempferol, apigenin and wogonin)具有抑制 MMP-1 活性、抑制 MAP Kinase 及 AP-1 活化的效果(Lim and Kim, 2007)。維他命 C 衍生物 disodium isostearyl 2-O-L-ascorbyl phosphate 可降低 MMP-1 活性，並 提高纖維母細胞膠原蛋白生成的量(Shibayama et al., 2008)。卷柏萃取 物分離後乙酸乙酯層所得之sumaflavone 與 amentoflavone 能抑制 UV 所誘導的MMP-1 活性(Lee et al., 2008) 。

而細菌膠原蛋白酶，由轉殖細菌產生，容易大量生產，為一廣效 型的膠原蛋白酶。為能大量及便利地進行初篩，常以細菌膠原蛋白酶 模式進行(Kim et al., 2006b)。大多數植物中所含多酚類成分多以配醣

體的形式存在，但據文獻指出(Kim et al., 2004a)，苷元的活性較配醣 體佳。抗光老化化妝品經由局部塗抹經皮吸收，皮膚為親脂性結構 (Barnhill and L., 2004)，苷元極性較低，較易經皮吸收。雖然有許多 文獻報導指出植物萃取物能夠有效的抑制膠原蛋白酶(Leu et al., 2006;

Lim and Kim, 2007)，對於苷元抑制膠原蛋白酶活性抑制之研究仍 少，故本試驗進行萃取物水解前後，探討抑制膠原蛋白酶的活性。

結果顯示(Fig. 5)，咖啡與玉蘭花萃取物水解前後進行明膠分解實 驗初篩時，抑制率均大於90%。而檄樹無論水解前後抑制率均不佳，

故未再進行其他活性試驗。為更進一步瞭解咖啡與玉蘭花萃取物及其 水解物對膠原蛋白酶之抑制效果，將其稀釋後進行膠原蛋白酶抑制試 驗。如Fig. 2, 3，CAE 經過稀釋後(10 ~ 500 μg/mL)，於低濃度(10 μg/mL) 仍具84%的抑制效果，水解後的抑制率則因水解條件的不同而有所變 化。水解後經序列稀釋效果皆不如水解前佳，比較各種水解條件後發 現，2.4 N HCl 水解時間不宜過久，30 min (CAH3)的效果優於 1 h (CAH4)。在 1.2 N 鹽酸中，增加水解時間抑制效果會提高(CAH2)。

比較 CAH2 與 CAH3 的抑制效果，於高濃度(100，500 μg/mL)時，

兩者抑制效果相當，當濃度再稀釋後(10，50 μg/mL)，CAH2 (59 %) 的抑制率大於CAH3 (49%)。推測其原因為苷元雖可因水解而濃度提 高，但鹽酸濃度過高時可能會對苷元產生破壞，故 CAH3 與 CAH4

的抑制效果較差。於1.2 N HCl 中，需要較長時間方能將苷元水解完 全，因此CAH2 具較佳之抑制膠原蛋白酶活性。

玉蘭花萃取物水解前後抑制率之比較，MAE 於低濃度(10 μg/mL) 抑制率為 92 %，水解物經稀釋後，效果亦無水解前佳。試比較各個 水解條件，於低濃度(10 μg/mL)時，HCl 濃度較高條件者：MAH3 與 MAH4，具有較佳的抑制效果。MAH3 優於 MAH4 推測可能為 MAH4 水解時間過久，致成分破壞。

上述文獻所指抑制膠原蛋白酶活性試驗大部分皆於細胞實驗進 行，前述初篩具抑制細菌膠原蛋白酶活性之咖啡、玉蘭花萃取物及各 該水解物，未來可針對纖維母細胞所分泌之MMPs，探討具酶抑制專 一性之活性。

二、 咖啡、玉蘭花萃取物及其水解物對於彈力蛋白酶活性之影響 真皮層中細胞外基質為支撐整個皮膚架構的主要結構，除了膠原 蛋白外，尚有彈力蛋白賦予皮膚彈性(Labat-Robert and Robert, 1988)。

照射紫外線亦會促進彈力蛋白酶分泌，而降解彈力蛋白(Getie et al., 2005; Seite et al., 2006)，使皮膚彈性喪失，外觀上會變得鬆弛。因此 抑制彈力蛋白酶也是發展延緩皺紋產生的另一標的。文獻指出，檳 榔、肉桂、肉豆蔻、薑黃、台灣蘋果、杜松精油、檸檬精油與葡萄柚 精油等天然萃取物皆有抑制彈力蛋白酶之活性(Getie et al., 2005; Kim

et al., 2007; Lee and Choi, 1999; Lee et al., 1999; Leu et al., 2006;

Tsukahara et al., 2006)。因此亦進行前述三種植物萃取物及水解物之這 項試驗。結果如Fig. 4 所示，玉蘭花萃取物與其水解物具抑制彈力蛋 白酶的效果，但效果略低 (<30%)，而咖啡與檄樹則無顯現抑制效果。

推測咖啡與檄樹萃取物及其水解物中無抑制彈力蛋白酶之活性成 分，而玉蘭花萃取物及其水解物中之活性成分含量極低，至於為何種 成分具抑制彈力蛋白酶之作用，有待日後進一步分離及純化。

三、 咖啡與玉蘭花對纖維母細胞經 UVB 照射後基質金屬蛋白酶 (MMP)表現之影響

文獻指出，照射UV 後會誘導基質金屬蛋白酶：MMP-1，MMP-3 與MMP-9 的表現增加(Dong et al., 2008; Pillai et al., 2005)。抑制 MMPs 的表現也是延緩皺紋產生的另一標的。諸多文獻便是針對抑制 MMPs 的表現量尋找對抗光老化的活性成分。杜仲甲醇萃取物分離出 的化合物Aucubin 能抑制 MMP-1 蛋白質的表現，亦能減少 MMP-1 mRNA 的表現(Ho et al., 2005)。Berberine 可預防 UVB 造成的 MMP-1 的表現及膠原蛋白降解(Kim and Chung, 2007)。褐藻萃取物 eckol 和 dieckol 能抑制真皮纖維母細胞 MMP-1 表現(Joe et al., 2006) 。由蒲瓜 乙醇萃取物分離出之化合物，具抗氧化活性，並能抑制UVA 所誘導 產生的MMP-1 蛋白質表現與 MMP-1 活性(Cho et al., 2006) 。

2',4',7-trihydroxyisoflavone 能顯著減少原代培養之老化皮膚纖維母細

胞經UVB 所誘導產生的 MMP-1 mRNA 與蛋白質的表現(Moon et al., 2005) 。從白蠟樹萃取物中分離出的 esculetin，具有優越的抗氧化能 力，並能抑制UV 所誘導的 MMP-1 mRNA 及蛋白質表現(Lee et al., 2007)。

纖維母細胞於照射 UVB 前預先處理萃取物，照射完 UVB 後 24 小時再觀察其MMPs 的表現。如 Fig. 10 所示，處理咖啡萃取物 5 μg/mL 的纖維母細胞MMP-1 與 MMP-9 的表現量即顯著降低，而 MMP-3 的 表現量於10 μg/mL 有明顯下降。一般文獻報導之有效劑量皆大於 10 μg/mL(Kim et al., 2006b; Kim et al., 2007; Lee and Choi, 1999; Tanaka et al., 2007)，而咖啡萃取物於 10 μg/mL 即有不錯的效果，顯示咖啡 萃取物中具有抑制MMP 活性極佳的化合物。

選取咖啡的兩種主要成分咖啡酸與綠原酸進行試驗，試圖找出咖 啡抑制 MMPs 表現的活性成分。結果如 Fig. 12 所示，咖啡酸對於 MMP-1 具抑制作用，但未顯現劑量依存性，而其並無法抑制 MMP-3 與MMP-9 的表現。綠原酸於 50 μg/mL 時，始對 MMP-3 的表現產生 抑制效果。但對抑制MMP-1 與 MMP-9 表現之活性未顯出抑制作用。

曾有研究指出，綠原酸能夠抑制MMP-9 的活性(Jin et al., 2005)，因 此未來可對纖維母細胞處理綠原酸後所產生之MMP-9 活性做探討。

玉蘭花萃取物對於纖維母細胞MMPs 表現之影響如 Fig. 13 所 示，萃取物於10 μg/mL 表現出良好抑制 MMP-1 的效果，對於 MMP-3 於高濃度( 25 μg/mL )才顯現出較佳的抑制效果，MMP-9 於 5 μg/mL 即顯現出抑制效果。實驗結果顯示玉蘭花萃取物亦具抗UVB 誘導產 生之MMPs 效果佳的萃取物，而其中的主要活性成分更值得深入探 討，具發展成對抗光老化產品之潛力。

上述文獻中，抑制 MMPs 的蛋白表現量，皆同時影響到 mRNA 的產生，因此未來能針對咖啡及玉蘭花萃取物影響纖維母細胞mRNA 的部分進行探討，使其作用機轉更加明確。

四、 咖啡與玉蘭花萃取物對纖維母細胞照射UVB 後第 I 型膠原蛋 白原表現之影響

膠原蛋白為支撐皮膚的主要成分，於真皮層中細胞外基質膠原蛋 白第I 型膠原蛋白占了 70%。皮膚照射 UV 會使膠原蛋白的生成減少 (Bae et al., 2008; Chung, 2003; Ichihashi et al., 2003; Rabe et al., 2006;

Scharffetter-Kochanek et al., 2000)；MMPs 生成與活性也會增加，致使 其生成與降解失去平衡，老化現象因此產生。於老鼠皮膚局部塗抹大 豆中異黃酮成分 equol，能顯著降低光老化造成的表皮細胞增生與真 皮層的肥大細胞數量。改善皮膚局部彈性鬆弛的現象，減少真皮層膠 原蛋白的降解，並具良好的抗氧化效果，能夠預防老鼠皮膚因急性 UVA 照射所誘導的脂質過氧化(Reeve et al., 2005)。維他命 A 及其衍

生物與維他命 C 也有報導指出其能促進膠原蛋白生成(Burke, 2007;

Chaqour et al., 1997; Dumas et al., 1996)。和厚朴中 magnolol 與 obvatol，黃連之 berberine，綠茶中的 EGCG，大豆異黃酮與異黃酮 equol 等成分皆能使 UVB 誘導的膠原蛋白生成減少的現象改善。(Bae et al., 2008; Choi et al., 2007; Kim and Chung, 2007; Kim et al., 2004b;

Reeve et al., 2005; Tanaka et al., 2007)。實驗結果顯示(Fig. 10)，咖啡萃 取物(10 μg/mL)能提高纖維維母細胞照射 UVB 後第 I 型膠原蛋白原 的生成。玉蘭花、咖啡酸與綠原酸處理細胞，對 UVB 造成的第 I 型 膠原蛋白原生成下降無改善效果。推測此結果可能因為咖啡萃取物能 夠促進細胞生長因素，其活性成分可能促進 TGF-β 產生，活化膠原 蛋白生成訊號傳遞路徑，與 UVB 所誘導的 AP-1 活化產生抗衡。故 可對咖啡萃取物影響 TGF-β 路徑做更深入的探討。另亦可進行動物 實驗，針對膠原蛋白生成後的形態、質與量做評估。

五、 咖啡與玉蘭花萃取物對纖維母細胞照射UVB 後 MAP kinase 活化之影響

而文獻中指出，咖啡酸具抑制UVB 所誘導之 IL-10 mRNA 表現 及MAP kinase 活化(Staniforth et al., 2006)。而 MAP kinase 活化是光 老化產生的路徑之一，更是MMPs 產生增加主要因素，若咖啡酸能 抑制MAP Kinase 活化應能抑制 MMPs 的表現。

咖啡對於JNK、ERK 與 p38 皆有抑制其活化的作用。玉蘭花萃取 物抑制MAP kinase 活化的效果尚不及咖啡，且對於 p38 的磷酸化不 具抑制效果。推測抑制MAP kinase 磷酸化原因為抗氧化的緣故，因 UVB 對纖維母細胞產生最直接的傷害為活性氧，而抗氧化的步驟從 訊號傳遞的最上游先行阻斷，可使下游訊號傳遞減弱。許多具抗氧化 活性的化合物，對於抗老化及抑制MAP kinase 皆有效果。黃酮類化 合物抗氧化與抑制膠原蛋白酶的能力與其化合物上OH 基數目相 關，數目越多抵禦UV、預防皮膚光老化效果越好(Sim et al., 2007) 。 Sesamol 於動物實驗中證實能預防長期 UV 暴露所造成的皮膚光損害 (Sharma and Kaur, 2006) 。塗抹杏仁油於動物實驗證實能預防皮膚因 照射UV 所產生結構上的損傷(Sultana et al., 2007)。Lutein 具光保護效 果，當細胞照射UV 後，能提高細胞存活率、細胞膜完整性。未照射

咖啡對於JNK、ERK 與 p38 皆有抑制其活化的作用。玉蘭花萃取 物抑制MAP kinase 活化的效果尚不及咖啡，且對於 p38 的磷酸化不 具抑制效果。推測抑制MAP kinase 磷酸化原因為抗氧化的緣故，因 UVB 對纖維母細胞產生最直接的傷害為活性氧，而抗氧化的步驟從 訊號傳遞的最上游先行阻斷，可使下游訊號傳遞減弱。許多具抗氧化 活性的化合物，對於抗老化及抑制MAP kinase 皆有效果。黃酮類化 合物抗氧化與抑制膠原蛋白酶的能力與其化合物上OH 基數目相 關，數目越多抵禦UV、預防皮膚光老化效果越好(Sim et al., 2007) 。 Sesamol 於動物實驗中證實能預防長期 UV 暴露所造成的皮膚光損害 (Sharma and Kaur, 2006) 。塗抹杏仁油於動物實驗證實能預防皮膚因 照射UV 所產生結構上的損傷(Sultana et al., 2007)。Lutein 具光保護效 果，當細胞照射UV 後，能提高細胞存活率、細胞膜完整性。未照射