第四章 結果
四、 抑制基質金屬蛋白酶(MMP-1, -3, -9)表現
欲探討UVB射線對於細胞生理之影響，先以不同UVB劑量照射纖 維母細胞，再以MTT assay確認UVB劑量對纖維母細胞之影響。如Fig.
8所示，UVB 20~80 mJ/cm2時細胞存活率皆大於95%。於高劑量100 mJ/cm2時，細胞存活率僅有85%，顯示此劑量以對細胞造成較大的損 傷。故進行照射UVB實驗時，選擇80 mJ/cm2之劑量。
(二) 誘導纖維母細胞基質金屬蛋白酶-1，-3，-9表現及第I型膠原蛋白
原之UVB劑量
欲知擬探討的蛋白質MMP-1，MMP-3和MMP-9是否將會隨著 UVB照射劑量之上升而產生變化。將細胞進行不同劑量之UVB (40~80 mJ/cm2)照射後，破碎細胞，萃取細胞質內之蛋白質，經西方 墨點法分析及觀察，其結果如Fig. 9(a)所示，MMP-1蛋白表現量隨著 UVB劑量之上升而表現增加，於80 mJ/cm2時達到最大，與控制組相 較，表現量約提高2.6倍。MMP-3蛋白表現量也隨著UVB劑量增加而 增加，於40 mJ/cm2表現量達到最高，約為控制組之1.4倍。MMP-9蛋 白表現量與UVB照射劑量亦呈正比，於40 mJ/cm2表現量達到最高，
約為控制組之2.7倍。
纖維母細胞之MMP-1，MMP-3和MMP-9蛋白表現量皆因UVB而 有所增加，但不同蛋白質間受UVB劑量之影響也略有不同。當細胞照 射UVB後，如Fig. 9(a)所示，當UVB劑量逐漸提高時，第I型膠原蛋白 原的表現量會降低，於40 mJ/cm2時表現量接近零。於後續實驗皆選 擇80 mJ/cm2為誘導劑量。
(三) 抑制基質金屬蛋白酶-1, -3, -9(MMP-1, -3, -9)之表現
以不同濃度咖啡、玉蘭花萃取物( 5~25 μg/mL)及咖啡酸與玉蘭花 預先處理纖維母細胞15分鐘，再照射UVB，並繼續以萃取物處理24 小時後，觀察MMPs的表現。如Fig. 10所示，MMP-1因照射UVB而表
現量增加，經CAE處理後蛋白質表現量從2倍降至1倍(5 μg/mL)，恢復 至未照射UVB之量。於較高濃度(10, 25 μg/mL)也同樣有抑制蛋白質 表現的效果。CAE 5 μg/mL即可降低MMP-3由UVB所誘導的表現，從 1.6倍降至1.3倍，而隨著濃度的增加(10, 25 μg/mL)抑制效果也具濃度 依存性。CAE對於MMP-9蛋白的表現現象與MMP-1與MMP-3 相同，
5 μg/mL時降至1.1倍。
以咖啡酸與綠原酸預先處理纖維母細胞，再照射UVB細胞，並繼 續以咖啡酸及綠原酸處理24小時，觀察MMP的表現。如Fig. 12所示，
咖啡酸於5 μM時，即可降低MMP-1的表現量至1倍，與未處理UVB的 表現量相同。於較高濃度(10, 50 μM )也具有抑制的效果。MMP-3表 現量照射UVB後增加至2倍，但咖啡酸處理細胞後無論濃度高低(5~50 μM )皆無抑制其表現的效果。MMP-9因UVB的誘導提高至1.2倍，經 咖啡酸處理後(5~50 μM )其表現量皆恢復至1倍。以綠原酸處理細胞 (5~50 μM )，MMP-1會因此而表現降低至1倍左右。MMP-3於高濃度 (50 μM )才有抑制效果，將蛋白表現量從2倍抑制至1.7倍。對MMP-9 無抑制表現的效果。
以MAE(5~50 μM ) 預先處理纖維母細胞15分鐘，再照射UVB細 胞，並繼續以MAE處理24小時，觀察MMPs的表現。如Fig. 13所示，
於10 μg/mL可使MMP-1之表現量由UVB誘導的2倍降至未照射的表
現量。MMP-3表現量於10 μg/mL時具有顯著效果，當濃度增加至25 μg/mL時表現量為1.4倍。當濃度為5 μg/mL時，MMP-9可從UVB誘導 的4.5倍降至2.7倍。
(四) 對於第I型膠原蛋白原之影響
以CAE(5~25 μg/mL ) 預先處理纖維母細胞15分鐘，再照射UVB 細胞，並繼續以CAE處理24小時，觀察第I型膠原蛋白原的表現。如 Fig. 10所示，於濃度10 μg/mL第I型膠原蛋白原之表現量恢復約0.6 倍。而咖啡酸、綠原酸及MAE對於第I型膠原蛋白原表現量皆無改善 的效果。
(五) 對於MAP kinase之影響
UVB誘導MAP kinase的活化，如Fig. 9(b)所示，JNK隨著UVB的 劑量增加而磷酸化量增加。分別為3.4倍(20 mJ/cm2)、6.5倍(40
mJ/cm2)、7.1倍(60 mJ/cm2)和5.5倍(80 mJ/cm2)。而ERK則是至UVB劑 量達到80 mJ/cm2時，才誘導出磷酸化增加至1.3倍。p38的活化量則是 於60 mJ/cm2始誘導出其增加(1.4倍)，當UVB劑量增加至80 mJ/cm2 時，p38的磷酸化量增加至1.9倍。
如Fig. 11所示，細胞以CAE (5~25 μg/mL)處理後，JNK活化量於 10 μg/mL即有抑制效果，而且具有濃度依存性。ERK活化量於5 μg/mL
與10 μg/mL則沒有抑制效果，至25 μg/mL才有抑制效果並且恢復至未 照射UVB的狀態。p38經UVB (80 mJ/cm2)誘導後磷酸化量為1.2倍，以 CAE處理濃度至25 μg/mL仍無明顯效果。
MAE對於UVB誘導之MAP kinase活化影響，如Fig. 14，JNK的部 分，隨著濃度的增加，抑制磷酸化效果趨於明顯，於MAE 25 μg/mL 時可將磷酸化量降至與未照射UVB者相當。ERK的表現，則是於高劑 量25 μg/mL時，才顯現抑制效果，將磷酸化量抑制至1.3倍。處理MAE 對於p38的影響，效果不顯著，MAE 25 μg/mL時才降至3.2倍(UV誘導 為3.4倍)。
五、 咖啡及玉蘭花萃取物之安全性評估