第二章 研究方法
第三節 實驗方法
2.3.1 DNA 轉染 (DNA transfection)
將適量細胞分至6 well plate 待隔天貼附後，利用 Arrest In(AI) transfection kit 進行轉染。將 3.0μg/well 的 DNA 以及 15μl/well 的 Arrest In transfection kit 各自以不含胎牛血清之培養液 0.5ml/well 稀釋後，再使兩 者在室溫下混合均勻靜置十五分鐘，已便DNA/AI complex 形成。移除 欲轉染6 well plate 細胞之培養液，以一倍 PBS 清洗，加入 DNA/AI complex solution，在 37℃、5% CO2 的環境下培養 4 小時，最後更換含 有胎牛血清之培養液持續培養48 小時。
2.3.2 細胞蛋白萃取 (Cell extraction)
依據實驗所需條件及時間點，將細胞培養液移除，加入適量一倍 PBS 清洗後，依細胞量加入 Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer
並放置在4℃、5 分鐘作用，收至 1.5 ml 離心管離心 12000rpm、4℃、
30 分鐘，收集其上清液後，利用超音波細胞破碎機(Sonicator)震盪 2 分 鐘，將細胞蛋白保存在-20℃。
2.3.3 蛋白質濃度測定 (Bradford method)
收下來的細胞蛋白利用Bio-Rad protein assay 染劑測試，以不同濃 度的胎牛血清製作標準曲線，由1mg/ml BSA stock 分別配成 0、0.2、0.4、
0.8。1.0 mg/ml 各 10μl，再加入 990μl 染劑，利用分光光度計測量 OD595nm
吸光值並算出線性公式。最後再取蛋白質樣品10μl 加 990μl 染劑並分析 蛋白質濃度。
2.3.4 蛋白質電泳分析 (SDS-PAGE)
首先配置0.75mm 厚度的 acrylamide gel：上層 stacking gel 含 4%的 acylamide，而下層膠則依蛋白質分子大小決定 acrylamide 含量。配置好 的膠放入Bio-Rad 電泳槽中，並注入電泳緩衝溶液。將收下來的細胞蛋 白質以同體積加入2X protein loading dye，利用乾浴器 110℃、7 分鐘變 性後放置冰上5 分鐘，最後以轉速 12000rpm、3 分鐘離心。將處理好的 細胞蛋白以及標準標示分子量的Multimaker 注入電泳槽的膠孔內，以 80Volts、50mA，30 分鐘之後待蛋白集中在上層膠下緣後，再以 110V 分離蛋白質。
2.3.5 蛋白質轉漬 (Transfer)
本實驗使用Bio-Rad Semi-Dry transfer cell 進行電泳轉漬。先將電泳 膠移除上層膠部分，再小心地將膠拆下。準備transfer buffer，把
Nitrocellulose membrane、3M 濾紙和電泳膠浸泡在 transfer buffer 內，接
著把轉漬機的正極板以transfer buffer 潤濕，依序放上 3M 濾紙、
Nitrocellulose membrane、電泳膠、3M 濾紙，並仔細地移除之間的氣泡。
以15V、1 小時進行轉漬。
2.3.6 西方墨點法 (Western bloting)
電泳膠轉漬到membrane 上之後，將 membrane 浸泡在以 1X TBST 配置 的5%脫脂奶粉，4℃均勻搖晃 1 小時後，用 1X TBST 清洗 membrane 7 分鐘4 次，再加入一級抗體(以 1X TBST 稀釋，稀釋倍數依抗體說明書 建議)，於 4℃搖晃至隔天。翌日將 membrane 以 1X TBST 清洗過後，依 實驗所需加入二級抗體於室溫均勻搖晃2 小時，再以 1X TBST 清洗 7 分鐘5 次。取出 membrane 加入 NBT/TCIP 呈色劑呈色，待蛋白呈色之 後加入ddH20 中止反應並晾乾；另外也可利用 ECL 呈色劑(Reagent 1 與 Reagent 2 1:1 混合)均勻分布在 membrane 上，反應 3 分鐘後，放入壓片 夾中，以X 光片進行壓片。
2.3.7 流式細胞儀 (Flow cytometry)
本實驗是利用Annexin V 對於磷脂類(如 Phosphatidylserine，PS)有 高度親和性去偵測細胞凋亡時PS 從細胞膜內翻轉至膜外，另外利用
propidium iodide 去排除細胞壞死所造成的 PS 轉移，以得到同時辨識細
胞壞死與細胞凋亡的實驗目的。將TE671-pCR3.1 以及
TE671-pCR3.1-NS5 cells 以 2×105/well 細胞量下至 6 well plate，區分實 驗組與對照組。待隔天細胞貼附，實驗組加入IFN-beta 1000U/ml 48 小 時後，將細胞以trypsin 收下，並利用 1X PBS 清洗兩次，再用 1X Binding buffer 回溶製成 1×106/ml 懸浮液，各取 100μl 細胞液至 Falcon 試管，加 入適量螢光標記Annexin V FITC 以及 propidium iodide(PI)核酸染料混勻 後，在室溫下避光15 分鐘。於各試管內加入 1X Binding buffer 400μl，
並在一個小時內上機完畢。
2.3.8 冷光測試啟動子活性(Luciferase assay)
將TE671-pCR3.1 以及 TE671-pCR3.1-NS5 cells 分盤至 6 well plate，
待細胞貼附隔天，轉染各種不同帶有luciferase 的報導基因質體，例如：
pISRE-Luc、pNFκB-Luc 等，並依 9:1 比例轉染 luciferase 質體及 Renilla luciferase 質體，待 48 小時後質體表現，將細胞分至 24 well plate，細胞 貼附後依實驗條件不同加藥4 小時，吸掉培養液加入 100μl lysis buffer，
將細胞收至1.5ml 離心管離心 12000rpm、10 分鐘。離心完取細胞上清 液測定luciferase 及 Renilla luciferase 的活性。測定時取 20μl 上清液放 至96 孔白盤中，加入 Luciferase assay substrate 100μl 以冷光分析儀測定
Luciferase 活性，再加入 Stop&Glo® reagent 100μl 以冷光分析儀測定並 記錄數值。Promoter 活性是以 Luciferase 及 Renilla luciferase 的比值表 示。
2.3.9 二維電泳蛋白質前處理
蛋白質樣本前處理可使樣品鹽分降低以利二維電泳圖譜的分析 。細 胞定量後，加入 IFN-ß 1000U/ml 處理 48小時，以1x PBS洗2次去除培養 液，加入500μl RIPA buffer 冰上作用5min，用刮子將細胞刮下來，將液 體吸出加至 1.5ml 離心管，4℃ 離心12000rpm 30分鐘，取出上清液以 0.45μM filter 過濾，加入 4 倍體積冰acetone，置於 -80℃ 8小時或
overnight，4℃ 12000rpm 離心30分鐘，完全去除上清液，加入100μl buffer A 回溶蛋白質，定量蛋白質。
2.3.10 蛋白質二維電泳（Two-dimensional electrophoresis）
二維電泳技術是以：第一維的等電點電泳(isoelectric focusing)，依 等電點 (isoelectric points，pI) 分開蛋白質，利用蛋白質等電點的差異，
在 pH 梯度 (pH gradeint)環境存在下，於電場的驅動力之下，蛋白質會 泳動至淨電荷為 0 的 pH 值 下；第二維的 SDS-聚炳烯膠 (SDS -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 是依分子量大小分開蛋
白質。
2.3.11 蛋白質等電點聚焦電泳法 (Isoelectric focusing, IEF)
所使用的 IEF 電泳系統為 IPGphor Isoelectric Focusing System (Bio -Rad)。處理過的樣本取 300 μg 加入 Buffer A (containing 7 M
urea ，2% CHAPS， 2 mM DTT，0.5% IPG buffer，0.1％ bromophenol blue) 使總體積為 350μl，以 pipette 充分混合後，吸入 Immobiline DryStrip Reswelling Tray 中，用鑷子將 DryStrip 膠上的保護膜撕去，膠面朝下 慢慢放入膠條，在膠條上加 ml 礦物油(mineral oil)進行 rehydration，原 本乾燥的膠條在 rehydration 時會將蛋白質吸入膠條的孔洞中，而加入 3 ml 礦物油(mineral oil)可減少反應過程中水份蒸發及尿素結晶，最後將 整個載體放入 IEF 平台上進行電泳，IEF 條件為在 20℃rehydration 16
小時， 200V 1 小時，500V 1 小時，1000V 1 小時，5000V 2 小時，8000V 8 小時。
2.3.12 SDS 聚丙烯膠電泳 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)
第一維電泳完成後，將 IEF 機器電源關上。以夾子將膠條取出，電 泳膠條先在 20 ml DTT 平衡緩衝液(6M Urea，30% glycerol, 2% SDS，
0.2g DTT)室溫搖晃作用 20 分鐘，以調整膠條的環境至 SDS-PAGE 電
泳的狀態，倒除 DTT 平衡緩衝液後，再以 20 ml IAA 平衡緩衝液(6M Urea，30% glycerol， 2% SDS， 0.4g iodoacetamide ) 室溫搖晃作用 20 分 鐘，倒除 IAA 平衡緩衝液後，電泳膠條靠右側橫放在先前已鑄好的 12%
Tris- glycine SDS polyacrylamide gel上（Protean®II xi Cell , Bio-Rad），左 側放入滴上 5μl Marker 的濾紙，上層以 Agarose sealing solution 封滿鑄 膠玻璃，去除多餘之氣泡，室溫靜置 10 分鐘待上層 Agarose 凝固，放 入蛋白質垂直電泳系統( PROTREAN II xi, Bio -Rad，具水流冷卻管可增 加蛋白質再現度)，倒入 SDS electrophoresis buffer 蓋上蓋子，設定電泳 條件，開啟開關進行電泳，過程大約 15 小時。
2.3.13 銀染 (Sliver stain)
將 SDS-PAGE 膠片放入裝有ddH2O的水盆搖晃清洗2次，每次10分 鐘，倒除ddH2O之後，將膠片浸入，加入Fixation solution中固定2小時，
移除 Fixation solution，以ddH2O搖晃清洗兩次，每次10分鐘，加入 sensitizing solution (5 % Sodium thiosulphate solution, 0.1% Sodium acetate solution，25 % Glutardialdehyde solution) 作用30 分鐘，倒掉 sensitizing solution 再以ddH2O沖洗2次，每次5 分鐘。加入Silver solution (2.5 % AgNO3 solution，37 % Formaldehyde
solution)進行 20 分鐘的銀染作用，再以 ddH2O 沖洗 2 次，每次 5 分鐘，
加入Developing solution，避光呈色 1~2 分鐘，加入 37 % Formaldehyde solution，浸泡至膠片上的蛋白質點呈現清晰且完整出現為止，倒掉 37 % Formaldehyde solution 加入 stop solution (0.02％ EDTA solution) 終止
反應10 分鐘，最後利用 ddH2O 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，銀染後的膠 片使用高解析度的掃描器（GS-800 Calibrated Imaging Densitometer, Bio-Rad）掃瞄，掃瞄後將電泳膠封片，放 4℃冰存。
2.3.14 軟體比對
使用的軟體為 BIO-RAD PDQUEST-7.0.0 軟體，可自動進行不同膠 片的蛋白質圖譜比對以及蛋白質點的定量分析。
2.3.15 膠內蛋白質水解
將先前實驗中所得到的二維電泳膠數位化影像，使用 BIO-RAD PDQUEST -7.0.0 的軟體來進行不同膠片的蛋白質圖譜比對，將具有表現
差異性的蛋白質點利用被剪刀剪斷，尖端之孔動直徑大小為2-3mm 的 200μl pipette tip 從膠片上挖出放入 1.5 ml 微量離心管中，以 100μl wash buffer （25mM aminonim bicarbonate in 50％acetone nitrite）震盪清洗 2 次，每次15 分鐘 ，去除 wash buffer，加入 100μl silver stain solution（10 mg potassium ferricyanide、15mg sodium thiosulfate in 1ml Q water）進行
脫色反應（destain），直至膠片呈現透明無色，再以 100μl 25 mM NH4HCO3 震盪清洗 2 次，每次 10 分鐘，加入 100μl 100％ acetone nitrite，室溫靜置 10 分鐘使膠片脫水乾躁，去除 100％ acetone nitrite，
待其完全乾燥後，加入3μl typsin（1μg/ml）4℃反應 1 小時，加入 25mM aminonim bicarbonate，置於 37℃下反應 12-16 小時，再加入 100 μl 10 ％ formic acid 萃取 peptides，可將處理好之樣品儲存於-20 ℃下保存或直接 進行串聯式質譜儀鑑定。
2.3.16 病毒增幅 (virus amplyfication)
日本腦炎病毒 T1P1 株（長庚大學陳維鈞教授提供）是利用貼附性 BHK-21 細胞當作病毒的放大細胞。當 BHK-21 細胞長滿單層時，移去 舊培養液加入新培養液10ml。以 M.O.I=10（病毒顆粒/細胞數）比例，
感染BHK-21 細胞在 37℃恆溫培養箱以 T-75 (75cm2 cell culture flask)培 養，培養液為含有2﹪胎牛血清的 MEM 培養液。病毒的收取在感染後 2-3 天，觀察細胞的細胞病理現象（Cytopathic Effect,CPE）。待細胞 CPE 達 80﹪以上，收集病毒培養液，以離心速度 3000rpm、離心時間 30 分鐘去除細胞碎屑，再以 0.22μm filter 過濾離心後的上清液以每管 0.5ml 分裝並儲存於-80℃冰箱。
2.3.17 核醣核酸萃取 (RNA extraction)
i. 病毒核醣核酸
病毒感染細胞之後，依時間點收取上清液，利用QIAamp Viral RNA Mini Kits (QIAGEN) 所提供之步驟去純化病毒核醣核酸。其中以含有 carrier RNA 的 AVL buffer 去萃取，純化好的核醣核酸保存在-80℃。
ii. 動物細胞核醣核酸
依實驗條件收下細胞，以1 倍 PBS 清洗 1~2 次，離心 2000rpm、5 分鐘，去除上清之後剩餘的細胞沉澱物利用PureLinkTM Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogen)試劑去純化動物細胞之核醣核 酸。萃取出來的核醣核酸保存在-80℃。
2.3.18 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription PCR)
將萃取好的病毒或動物細胞核醣核酸，依照不同物種去選擇合適的 reverse primer，並且透過聚合酶連鎖反應的方式，以反轉錄酶的活性將 RNA 反轉錄成 cDNA。
2.3.19 即時定量聚合酶連鎖反應 (Real-time PCR)
將反轉錄好的 cDNA 在測過核酸濃度之後，以 cDNA 當做模板，設 計好想要偵測的正、反向引子，利用Smart Quant Green Master Mix 試劑
嵌入雙股DNA 之特性，偵測 mRNA 層級的表現量。PCR 的反應條件為：
第一階段95℃，15 分鐘；第二階段 95℃，15 秒鐘；第三階段 60℃，1 分鐘，反應進行40 個循環，然後利用 ABI Prism 7000 SDS software 評 估所得之數據資料。本實驗計算方式利用Ct 值與△△Ct 值(Cycle threshold value)呈現(△△Ct=(Ct. treated-Ct. GAPDH)-(Ct. untreated-Ct.
GAPDH))，數值越高代表細胞內表現量越低。
2.3.20 病毒斑點試驗 (plaque assay)
先將BHK-21 cells（幼小倉鼠腎臟纖維母細胞 BHK-21; baby hamster kidney cell）培養於含 10%FBS 的 MEM 培養基的 6 格培養盤
（6-well plate），再加入病毒液每個well 加入 200μL（二重複），在37ºC，
5% CO2 培養箱，每格 15 分鐘輕拍 6 格培養盤，使病毒液均勻分散。
5% CO2 培養箱，每格 15 分鐘輕拍 6 格培養盤，使病毒液均勻分散。