針對 Cyclophilin A 做為治療標的之測試

3.3.1 確認干擾素對 NS5 蛋白表現細胞中 Cyclophilin A 之影響

基於蛋白質體學之分析結果，進一步確認 Cyclophilin A 於 NS5 蛋 白表現之細胞的影響。將空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細胞於培養液 中加入0、250、500、1000 U/ml IFN-β，經過 24、48 小時之後，把細胞 收下並處理蛋白，利用西方墨點法以及壓X 光片呈色方式呈現。由結果 可知，空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細胞比較之後，有 NS5 蛋白表 現細胞之Cyclophilin A 的表現量有上升的現象(圖十三)，與二維電泳圖 譜分析比對之後的結果吻合。之後的實驗我們將針對這個點做為一個治 療標的，觀察是否能影響日本腦炎病毒的複製。

3.3.2 Cyclosporin A 抑制 ISRE 啟動子活性

由於有研究指出 Cyclosporin A 可抑制 Cyclophilin A 的活性，進而 影響病毒複製，因此我們選用Cyclosporin A 當作抑制劑，測試它抗病毒

之能力。

利用穩定表現空載體對照細胞及 NS5 蛋白表現細胞培養至 6 孔 盤，將pISRE-Luc 與 pRunilla-Luc 的冷光報導基因以 9:1 的比例轉染進 細胞中，待48 小時培養之後，於培養液中分別加入四組濃度：0 U/ml IFN-β+0 ng/ml CsA、3000 U/ml IFN-β + 0 ng/ml CsA、0 U/ml IFN-β + 2000 ng/ml CsA、3000 U/ml IFN-β + 2000 ng/ml CsA，4 小時後，利用冷 光儀所得的數值以pISRE-Luc/pRunilla-Luc 呈現。由結果發現，有 NS5 蛋白表現的細胞原本能抑制IFN-β 下游啟動的 ISRE 啟動子之活性，但 是在加入Cyclosporin A 之後，ISRE 啟動子又恢復其活性(圖十四)。可 知Cyclosporin A 也許能針對日本腦炎病毒達到抗病毒的功效。

3.3.3 Cyclosporin A 對於 Cyclophilin A 下游 ERK 分子之影響

由於 Cyclophilin A 下游會影響 ERK 磷酸化，進而促進細胞增生與

分化，因此我們利用0 U/ml IFN-β + 0 ng/ml CsA、3000 U/ml IFN-β + 0 ng/ml CsA、0 U/ml IFN-β + 2000 ng/ml CsA、3000 U/ml IFN-β + 2000 ng/ml CsA 處理空載體對照細胞及 NS5 蛋白表現細胞，1 小時之後收下 細胞蛋白，進行西方墨點法。由結果可知NS5 蛋白表現的細胞在加入 Cyclosporin A 後，ERK1/2 磷酸化有被抑制的現象(圖十五)。

3.3.4 測試 Cyclosporin A 抗病毒之能力

為了確認 Cyclosporin A 是否有抑制日本腦炎病毒的能力，我們將 TE671 細胞培養至 25 T 培養瓶中，於培養液中加入四組藥物濃度：(1) 0 U/ml IFN-β+ 0 ng/ml CsA、(2) 500 U/ml IFN-β+0 ng/ml CsA、(3) 0 U/ml IFN-β+ 1000 ng/ml CsA 以及(4) 500 U/ml IFN-β+ 1000 ng/ml CsA，並且

同時加入JEV T1P1 strain (m.o.i=0.5)，進行下面實驗。首先於 24 小時之 後觀察細胞病變情形(Cytopathic effect)。由顯微鏡觀察發現，24 小時後

只有加病毒液的實驗組CPE 情形明顯，而同時加入 IFN-β 與 Cyclosporin A 之實驗組細胞存活率為最高(圖十六)。利用上述實驗收取上清病毒液 後，萃取出病毒RNA，並利用 Real time PCR 以及設計好之 JEV T1P1 ED3 引子去測試病毒的表現量，此結果以Ct 值(Cycle thereshold value)呈現，

數值越高表示表現量越低。因此由結果可知，隨著一至四組濃度，病毒 表現量越低，所以Cyclosporin A 確實能抑制 JEV T1P1 的感染力(圖十 七)。

接著我們利用 TE671 細胞，並依照相同之實驗條件(1) 0 U/ml IFN-β+

0 ng/ml CsA、(2) 500 U/ml IFN-β+0 ng/ml CsA、(3) 0 U/ml IFN-β+ 1000 ng/ml CsA 以及(4) 500 U/ml IFN-β+ 1000 ng/ml CsA，同時加入 JEV T1P1 (m.o.i=0.5)感染 24 小時之後，處理細胞染上 Annexin V FITC-PI，利用流

式細胞儀去分析發現在同時加入干擾素與Cyclosporin A 的實驗組，其細 胞凋亡的現象有下降的情形(圖十八)。

3.3.5 Cyclosporin A 於 BHK-21 細胞的抗病毒能力

進一步確認 Cyclosporin A 在其他種類的細胞株是否也有相同抗病 毒之能力，我們使用BHK-21 細胞進行病毒斑點試驗。分成以下藥物濃 度：(1) 500 U/ml IFN-β，(2) 500 ng/ml、1000ng/ml CsA，(3) 500 U/ml IFN-β + 500ng/ml CsA、500 U/ml IFN-β + 1000ng/ml CsA，同時感染病毒 100 PFU/ml，48 小時之後觀察病毒蝕斑情形。發現 Cyclosporin A 在濃度 1000 ng/ml 比起單獨加入 IFN-β 有較佳的抑制病毒效果，在同時配合加入干 擾素與Cyclosporin A 則更能影響病毒蝕斑的現象(圖十九)。由圖二十可 得到單獨加入cyclosporin A 或是同時加入干擾素時，確實有抑制病毒複 製的趨勢。