日本腦炎 NS5 蛋白對干擾素訊號傳遞之影響

3.1.1 建立 NS5 蛋白表現之 TE671 細胞

首先將 NS5 蛋白表現在 PCR3.1 質體(感謝中央研究院 林宜玲老師 提供)裡，再利用 PCR3.1 與 PCR3.1-NS5 兩種質體轉染至 TE671 細胞中，

由於質體上帶有neomycin resistance 基因，我們利用 G418 加入細胞培養 液中做篩選，建立細胞持續穩定表現空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細 胞。將細胞收下經過蛋白處理之後，利用西方墨點法NBT 呈色之方式，

於103 kDa 的位置發現 NS5 蛋白之表現(圖一)。

3.1.2 以 IFN-β 測試 NS5 對干擾素之抗性

將載體送入細胞之後，利用穩定表現空載體對照細胞及 NS5 蛋白表

現細胞培養至六孔盤中，於培養液加入1000 U/ml IFN-β 處理，經過 0、

24、48 小時於顯微鏡下觀察細胞，發現在 48 小時之後，TE671 PCR3.1 細胞有大量死亡的現象，而有NS5 蛋白表現之細胞大部分仍存活(圖二)。

3.1.3 NS5 蛋白幫助細胞對抗干擾素誘導之細胞凋亡

由圖二之結果發現有 NS5 蛋白表現之細胞加入干擾素處理後細胞

存活率較高，因此我們利用空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細胞培養至 6 孔盤，加入 1000 U/ml IFN-β，48 小時後，進行 Annexin V FITC 與 PI 雙染，利用Flow cytometry 分析螢光反應，發現 TE671 PCR3.1 的細胞 在早期與晚期細胞凋亡的情況到達70%；而有 NS5 蛋白表現之細胞，

凋亡情況只有10%以下(圖三)。接著利用西方墨點法去觀察 Caspase-9 的表現，發現空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細胞對照之後，空載體對 照細胞有較多的活化型Caspase-9 的表現(圖四)。此結果表示有 NS5 蛋 白存在的細胞或許具有對抗細胞凋亡的功能。

3.1.4 日本腦炎 NS5 抑制 ISRE 啟動子之活性

由於文獻指出日本腦炎 NS5 蛋白能影響干擾素作用，因此利用穩定

表現空載體對照細胞及NS5 蛋白表現細胞培養至 6 well plate，將

pISRE-Luc 與 pRunilla-Luc 的冷光報導基因以 9:1 的比例轉染進細胞中，

待48 小時培養之後，於培養液中加入 3000 U/ml IFN-β，4 小時後，利 用冷光儀所得的數值以pISRE-Luc/pRunilla-Luc 呈現，發現有 NS5 蛋白 表現之細胞其ISRE 的活性與 mock 細胞相比降低了 90%(圖五)。由此證 明，NS5 蛋白的表現確實會影響干擾素下游的作用。

3.1.5 日本腦炎 NS5 促進 NF-κB 啟動子之活性

利用穩定表現空載體對照細胞及 NS5 蛋白表現細胞培養至 6 well plate，將 pNF-κB-Luc 與 pRunilla-Luc 的冷光報導基因以 9:1 的比例轉染 進細胞中，待48 小時培養之後，於培養液中加入 3000 U/ml IFN-β，4 小時後，利用冷光儀所得的數值以pNF-κB-Luc/pRunilla-Luc 呈現，結果 發現有NS5 蛋白表現之細胞其 NF-κB 的活性比起 PCR3.1 細胞活性高出 70%(圖六)。而 NF-κB 的下游基因表現有能增進細胞增生與抗細胞凋亡 的功能，因此由結果可知NS5 蛋白的表現可以幫助細胞對抗細胞凋亡。

3.1.6 日本腦炎 NS5 蛋白對細胞激素與干擾素下游基因表現之影響

進一步將空載體對照細胞及 NS5 蛋白表現細胞培養在 25 T 培養瓶 中，於培養液中加入1000 U/ml IFN-β，8 小時後，將細胞收下並萃取細 胞RNA，並反轉錄成 cDNA 後，利用 Real time PCR 分析後以△△Ct 值(Cycle threshold value)呈現(△△Ct=(Ct. treated-Ct. GAPDH)-(Ct.

untreated-Ct. GAPDH))，數值越高代表細胞內表現量越低。我們利用 IL-6、IRF-3、PKR 與 OAS 四組設計好的引子去分析，發現在 NS5 表現 的細胞中，除了IRF-3 沒有太大的差異之外，IL-6、PKR 與 OAS 表現 量比起PCR3.1 之細胞有下降的趨勢(圖七)，由結果可知 NS5 蛋白的表 現會影響細胞激素IL-6 與 IFN-β 下游所表現的抗病毒蛋白。