精秤2 g 的樣品粉末 (磨粉條件詳見實驗材料處) 後倒入 125 mL 磨砂口錐形 瓶，加入0.1 mL (10 mg/mL, 溶於甲醇) 的 BHT (butylated hydroxytoluene) 作為抗 氧化劑，加入 10 mL 甲醇，使用超音波震盪 1 分鐘後再加入 20 mL 氯仿，置於 30℃ 水浴槽中振盪萃取20 分鐘。萃取液以 Whatman No. 1 濾紙 (直徑 9 cm) 及 玻璃漏斗過濾至濃縮瓶，濾紙上的濾渣以甲醇沖入錐形瓶中，再進行上述萃取步 驟二次。重複萃取三次的萃取液於40℃ 水浴鍋中減壓濃縮，再以 6 mL 氯仿回溶，
即為樣品液 (最終 BHT 濃度約 0.05%)，所有樣品皆為三重複 (n = 3)。
二、固相萃取法
參考 Pinkart 等人利用 NH2 固相萃取管分離微生物脂質的方式 (Pinkart et al., 1998) 及 Russo 等人利用 NH2 固相萃取管分離出動物油中膽固醇的方法 (Russo et al., 2005) 加以修改，將固相萃取管插入固相萃取真空抽氣裝置上，使用 玻璃吸量管吸取有機溶劑。以3 mL 的正己烷活化 NH2 固相萃取管 (500 mg / 3 mL)，加入樣品液 200 μL，以正己烷/乙酸乙酯 (95:5, v:v) 6 mL 洗去三酸甘油酯及 酯化態固醇，再依序加入各5 mL 的氯仿、丙酮及甲醇，自由態固醇及 steryl ferulate 主要於氯仿層中，酯化醣苷態在丙酮層，醣苷態固醇於甲醇層。合併收集流洗下
來的氯仿、丙酮及甲醇流洗液，收集液減壓濃縮至乾後以2 mL 甲醇回溶，以玻璃
針筒及0.22 µm Nylon
針筒過濾器過濾置入 2 mL 褐色樣品瓶，保存於-20℃ 待 LC-MS 分析。
三、以逆相液相層析串聯質譜儀分析植物固醇 (一) 分析條件
經過固相萃取分離淨化後的樣品，以自動進樣器注入管柱，進樣體積為25 μL。
使用管柱為 Kinetex C18 (150 × 2.1 mm, 2.6 μm)，管柱溫度 30℃；移動相為 A：超 純水、B：乙腈及 C：甲醇組成的三相系統，移動相皆含有 0.1% 甲酸，流速為 0.3 mL/min。層析梯度為線性，條件如下：
Time (min) A (%) B (%) C (%)
0 15.0 42.5 42.5
10 0.0 50.0 50.0
30 0.0 50.0 50.0
32 0.0 20.0 80.0
80 0.0 20.0 80.0
82 15.0 42.5 42.5 100 15.0 42.5 42.5
(二) 標準品
將 cholesterol、campesterol、stigmasterol、β-sitosterol 及 sitostanol 溶於丙酮 中，再以甲醇稀釋成100 μg/mL 的儲備液，分析時以甲醇序列稀釋作為檢量線樣 品。非單一物質的標準品 γ-oryzanol 及 esterified steryl glycosides 溶於丙酮，steryl glycosides 溶於氯仿，分別作為 steryl ferulate、酯化醣苷態及醣苷態固醇的標準品，
同樣以甲醇稀釋並與自由態固醇混合作為對照用的混合標準品。
(三) 自由態固醇的添加回收率
將 cholesterol、campesterol、stigmasterol、β-sitosterol 及 sitostanol 添加到糙 米樣品 (2 g) 中各 30、90 及 180 µg (相當於最後樣品液中濃度 0.5, 1.5 及 3.0 μg/mL)，依前述樣品萃取方式萃取及以固相萃取淨化樣品，經 LC-MS 分析後計 算結果，將添加自由態固醇後測定的固醇量扣除未添加的數值，計算各個自由態 固醇的添加回收率百分比。
(四) 植物固醇的質譜分析 1. 游離化條件設定
由於本實驗方法植物固醇大多於移動相提升到完全為有機相時才被流洗出管
柱，模擬實際分析時的移動相條件，使用T 型接頭連接針筒幫浦 (混和自由態固
醇標準品，1 μg/mL，流速 5 μl/min) 及流洗液 (乙腈:甲醇=1:1，流速 300 μl/min)，
將混和溶液直接注入質譜儀中。於正電模式下以自動調機 (auto tune) 調整儀器參 數，並以半自動模式調整 sheath gas、aux gas、電壓等參數，β-sitoserol 的離子訊 號 (m/z 397) 強度最佳化，並以此 tune file 作為分析時所用的質譜條件：
Capillary temperature: 150℃, APCI vaporizer temperature: 350℃, Sheath gas flow: 20 arb (arbitrary unit), Aux gas flow: 5 arb, Source voltage: 6 kV, Source current: 5 μA, Capillary voltage: 5 V。
2. 以二次質譜對植物固醇進行斷裂片段分析
選定一次質譜所得植物固醇的離子訊號，額外施加能量撞擊此母離子使其解 離 (collision-induced dissociation, CID)，可得該離子的二次質譜，為該化合物特有 的離子片段，可做為定性參考。實驗中皆設定 CID 能量值為 25%。
3. 檢量線配製及質譜分析的偵測與定量極限
配製不同濃度的自由態固醇標準品溶液：10000, 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1 ng/mL，以液相層析串聯質譜儀分析，數據處理時將 peak smoothing (波峰平滑) 的設定至最大，以濃度及積分面積的關係製作檢量線並計算 其 R square 值。另以該波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N) ≧ 3 時的濃度定
為儀器偵測極限 (limit of detection, LOD) ；
波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N)≧ 10 時的濃度定為儀器定量極限 (limit of quantitation, LOQ)。
4. 定量計算
以數據處理軟體 Xcalibur 選擇固醇基團脫去一分子水的最強特徵離子訊號，
以 extracted ion chromatogram (EIC) 選擇該離子觀察，得出各波峰的面積。自由態 固醇各以其標準品定量，無標準品的 avenasterol 則以 stigmasterol 定量，由於缺 乏各類結合態固醇的單一物質標準品，仍以自由態固醇為定量基準，如結合態固 醇其結構中固醇基團為β-sitosterol 者，皆以 β-sitosterol 定量，以此類推，固醇基 團為 avenasterol 者則以 stigmasterol 定量。Steryl ferulate 中的 cycloartenyl ferulate, cycloartanyl ferulate 及 24-methylencycloartanyl ferulate，包含其 cis-ferulate 型皆以β-sitosterol 定量。
四、以正相液相層析搭配蒸發光散射檢測器分析植物固醇 (一) 分析條件
將萃取後的樣品液以氯仿適當稀釋後以玻璃針筒及0.22 µm Nylon
過濾器過濾 置入 2 mL 褐色樣品瓶，以自動進樣器注入分析，進樣體積為
20 μL，使用管柱為 Diol (250 × 4.6 mm, 5 μm)，管柱溫度 30℃；移動相為 A：正己烷 (含有 0.1% 甲 酸) 及 B：異丙醇，流速為 1.0 mL/min。層析梯度為線性，條件如下：Time (min) A (%) B (%)
0 100 0
5 100 0
7 99 1
20 99 1
25 80 20
35 75 25
40 15 85
50 15 85
52 100 0 75 100 0
蒸發光散射檢測器參數設定：漂移管溫度 (Drift tube temperature)：75℃，
霧化器氣體流速 (Nebulizaer gas flowrate)：2.2 SLPM (Standard Liters Per Minute)，
氣體為空氣。
(二) 標準品
以 cholesteryl palmitate (酯化態固醇)、tristearin (三酸甘油酯)、β-sitosterol (自 由態固醇)、γ-oryzanol (steryl ferulate)、esterified steryl glycoside (酯化醣苷態固醇) 及 steryl glycoside (醣苷態固醇) 作為定量用標準品，除 steryl glycosides 溶於氯仿:
甲醇 = 2:1 (v:v) 的 Folch 溶劑中，其餘標準品皆溶於氯仿。將標準品混合配製為 200 μg/mL (steryl glycosides 及 esterified steryl glycoside 為 100 μg/mL) 儲備液保 存，分析時以氯仿序列稀釋成不同濃度的溶液作為檢量線樣品。
(三) 檢量線配製及蒸發光散射檢測器的偵測與定量極限
Cholesteryl palmitate、β-sitosterol 及 γ-oryzanol 的配製濃度為：1, 5, 10, 20, 40, 80, 120, 160, 200 μg/mL；tristearin、esterified steryl glucoside 及 steryl glucoside 的 配製濃度為：0.5, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL。以濃度及積分面積的關係製 作檢量線並計算其 R square 值。另以該波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N) =