由於C18 逆相層析管柱會過度滯留酯化態固醇及三酸甘油酯，並無法達到同
步分析所有種類植物固醇，故接著使用正相層析法，希望能將植物固醇進行大類 分離，藉此可知各類植物固醇的總量。
一、植物固醇正相液相層析法的建立
參考 Moreau 等人 (Moreau et al., 1996; Moreau et al., 2008) 分析樣品中植物 固醇的層析條件，選擇 Diol 管柱分析，移動相使用正己烷 (含 0.1%甲酸) 及異丙
醇。使用標準品進行實驗，初始5 分鐘維持正己烷流洗，可流洗出酯化態固醇；
如在之後將異丙醇比例提高梯度層析，三酸甘油酯及自由態固醇波峰無法分離，
因此最後選擇僅將異丙醇提升至1% 維持至 20 分鐘，2 根波峰能達到基線分離，
但比較文獻中使用 Diol 管柱分離三酸甘油酯及自由態固醇的效果，二者皆能輕易 分離，文獻中使用管柱為LiChrosorb Diol (100 × 3 mm, 5 μm, Chrompack) (Moreau et al., 1996) 及 Lichrosphere Diol (250 × 4.6 mm, 5 μm, Merck) (Perona and
Ruiz-Gutierrez, 2004)，推測本實驗所使用的 Chromatorex Diol SPS 100-5 管柱 (250 × 4.6 mm, 5μm, Fuji Silisia Chemical) 性質與文獻所使用的有較大差異。之後 逐步提升異丙醇比例以流洗出 steryl ferulate、酯化醣苷態固醇及醣苷態固醇。
選擇管柱時曾使用 silica 及 NH2 管柱，但 silica 管柱分離植物固醇效果較 差，NH2 則對高極性的脂類較為滯留，需要使用比異丙醇更高極性的溶劑提高移 動相強度，且考量其具有的陰離子交換性質，可能會使部分帶電荷化合物滯留於 管柱中，故不採用。
蒸發光散射檢測器參數設定參考儀器操作手冊上的建議數值，以能將層析移
動相最難揮發時的75% 異丙醇揮發的數值計算，設定漂移管溫度及霧化氣體流速，
分析時觀察基線平穩，訊號波動不超過 ± 0.1 mV。
ELSD 層析圖譜需依靠波峰滯留時間來判別化合物，由於觀察到 steryl ferulate 波峰處有較多其他物質波峰產生，以在 ELSD 之前的紫外光偵測器於 325 nm 偵測，根據滯留時間的些微差異可更加確認 steryl ferulate 的波峰位置。
圖25. 植物固醇及三酸甘油酯標準品的層析圖
Figure 25. HPLC–ELSD chromatogram of phytosterol and triglycoeride standards. CP:
cholesteryl palmitate, TS: tristearin, SI: β-Sitosterol, OZ: γ-Oryzanol, ESG: esterified steryl glucosides, SG: steryl glucosides
二、檢量線線性及偵測、定量極限
將固醇及三酸甘油酯標準品序列稀釋後分析，計算其檢量線線性及偵測、定 量極限，結果如表19，固醇化合物儀器偵測極限介於 0.5-5 μg/mL，儀器定量極限 為2.5-10 μg/mL。檢量線皆呈現為多項式而非線性 (圖 26)，這與文獻實驗結果相 符 (Perona and Ruiz-Gutierrez, 2004)，本實驗數據以線性計算檢量線公式時，r2 大 多低於 0.98，多項式計算則皆高於 0.99。但亦有文獻使用 ELSD 偵測脂質的檢量 線為線性且 r > 0.99 (Conforti et al., 1993)，ELSD 檢測值是否為線性可能根據檢量 線的範圍 (Perona and Ruiz-Gutierrez, 2004) 或所使用的管柱 (Nordbäck and Lundberg, 1999) 而不同。
mv
minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0 50 100 150
CP
TS SI
OZ ESG SG
表19. 固醇及三酸甘油酯標準品的標準曲線 Table 19. Calibration curve of sterols and triglyceride
Compound LOD (μg/mL)
LOQ (μg/mL)
Calibration range
(μg/mL) Calibration equationsa
a: X represented concentration of sterol. Y represented peak area of sterol.
LOD: limit of detection, LOQ: limit of quantitation.
Conc. (ppm)
圖26. Cholesteryl palmitate 標準品的檢量線
Figure 26. Calibration curve of cholesteryl palmitate standard
三、樣品中植物固醇的定量分析
分析樣品時發現米類及豆類樣品於酯化態固醇波峰處的波峰其訊號大多超過 儀器訊號值上限 (圖 27)，顯示該處流洗出物質含量極高，但酯化態固醇在植物中 較不可能有這麼高的含量，推測該處有其他含量較高的低極性物質與酯化態固醇 一同流洗出來。查詢文獻後顯示該物質可能為蠟酯 (wax ester) 及類胡蘿蔔素 (carotenoid) (Gonzalez-Castro et al., 1996; Hwang et al., 2002)，而由於以 silica 為基 質的管柱無法分離皆為非極性的蠟酯及酯化態固醇 (Nordbäck and Lundberg, 1999)，
推測實驗樣品中同樣也面臨到此問題，由於 Diol 管柱並無法將蠟酯及酯化態固醇 分離，故無法對酯化態固醇定量。
而在分析樣品時的另一問題為樣品中的三酸甘油酯含量遠超過自由態固醇，
而二者雖然能達成基線分離，但由於三酸甘油酯含量極高，二波峰如面積差異太 大時仍可能無法分離，需要將樣品適當稀釋；另一方面由於部分植物固醇如糙米 的酯化醣苷態固醇含量較低，稀釋倍數過高可能會使其樣品液濃度低於定量極限，
故參考LC-MS 的固醇含量數據及樣品性質，最後選擇將糙米樣品萃取液稀釋 2 倍，
豆類樣品則依三酸甘油酯多寡稀釋0.7-10 倍不等。圖 28 及圖 29 為台南 11 號糙米 及綠豆萃取液層析圖中固醇滯留區段，三酸甘油酯與自由態固醇間的波峰參考文 獻結果應為游離脂肪酸 (Moreau et al., 1996)，其餘非固醇 (脂類)波峰則不討論。
圖27. 台南 11 號糙米萃取液層析圖
Figure 27. HPLC–ELSD chromatogram of Tainan No.11 brown rice extract. SE: steryl esters, WE: wax esters, TAG: triglycerides
mv
minutes
0 20 40 60
0 500 1000
SE+WE TAG
圖28. 台南 11 號糙米萃取液的 18-40 分鐘處層析圖
Figure 28. HPLC–ELSD chromatogram (18-40 minutes) of Tainan No.11 brown rice extract. FS: free sterols, SF: steryl ferulates, ASG: acylated steryl glycosides, SG: steryl glycosides
圖29. 綠豆萃取液的 18-40 分鐘處層析圖
Figure 29. HPLC–ELSD chromatogram (18-40 minutes) of mung bean extract. FS: free sterols, ASG: acylated steryl glycosides, SG: steryl glycosides
mv
minutes
20 25 30 35 40
0 5 10 15
mv
minutes
20 25 30 35 40
0 5 10 15 20 25
FS
SF
ASG
SG
FS
ASG
SG
(一) 糙米樣品
99 年糙米樣品所測植物固醇含量如表 20 及圖 30 所示，並以 t-test 比較 MS 與 ELSD 不同偵測器分析結果有無顯著差異 (表 21)，由於 ELSD 理論上對於相 同類物質所產生的感應值較接近，且皆有固醇標準品製作檢量線定量，所得結果 應較符合實際含量。
ELSD 測量糙米自由態固醇含量為27.34-35.24 mg/100 g，自由態固醇由於主 要組成固醇皆有標準品可供 LC-MS 製作檢量線定量，大部分米種差異不大，且 數值的高低2 種偵測器結果皆符合。僅高雄 145 號及台中秈 10 號的 ELSD 值較 低並有顯著差異，比較米種間固醇組成差異，這2 種米種皆含有較高量的 avensterol，
由於 avensterol 是以 stigmasterol 為定量基準，推測 avensterol 的游離化效果較 stigmasterol 佳，同樣濃度的波峰面積較高，因此 MS 測量的數值應較實際高。
所有米種 MS 及 ELSD 所測的 steryl ferulate 量皆有顯著差異，ELSD 的測 量值 (24.83-69.45 mg/100 g) 較低且差異甚大，由於缺乏單一成分標準品，以結構 不同的自由態固醇來定量 steryl ferulate 較實際值差異較大並不意外，但 ELSD 測 定含量的高低仍與 MS 結果相符。
酯化醣苷態固醇 ELSD 的測量值 (5.69-12.52 mg/100 g) 皆遠高於 MS，此結 果顯示酯化醣苷態於本實驗的質譜游離化條件不佳，感應值較自由態固醇低，而 有些化合物也因訊號低於定量極限而未能計算，因此所測結果較低。而醣苷態固 醇 MS 及 ELSD (6.99-9.94 mg/100 g)的結果較相近。
(二) 豆類樣品
豆類樣品所測植物固醇含量如
表22 及圖 31 所示，表 23 為 MS 及 ELSD 的結果比較。由於豆類含有較高量的 avensterol，與上述推論相符，大部分豆類 ELSD 的自由態固醇測量值 (32.80-61.80 mg/100 g) 較 MS 低，但黑豆則無差異。黑豆亦含有 avensterol，如以上述推論其 ELSD 值應較低，由於僅有黑豆不符推論，有可能為黑豆含有未被質譜分析到的 其他種固醇，這部分需再觀察黑豆自由態固醇區段質譜訊號是否有其他訊號加以
Table 20. Phytosterol contents of brown rices determinded by HPLC-ELSD
Rice cultivars
Sterol classes 台稉9 號 台南11 號 台農71 號 高雄145 號 越光米 台中秈10 號
Free sterol 33.16 ± 4.35ab 35.24 ± 1.48a 27.34 ± 0.52c 30.31 ± 0.97bc 28.03 ± 2.57c 29.64 ± 1.77bc Steryl ferulate 47.76 ± 6.00b 69.45 ± 3.00a 24.83 ± 0.20d 28.05 ± 1.48cd 33.28 ± 1.97c 30.56 ± 0.27c Acylated steryl glucoside 12.52 ± 0.70a 12.61 ± 1.32a 9.72 ± 0.34b 5.69 ± 0.79c 5.72 ± 0.48c 10.85 ± 0.42b Steryl glucoside 9.94 ± 0.75a 9.10 ± 0.26ab 8.52 ± 0.16bc 6.99 ± 0.36d 7.40 ± 1.07d 8.00 ± 0.32cd Data were shown as mean ± SD (n=3) and were analyzed by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test. Different alphabet means significantly
different (p<0.05).
表21. 不同偵測方法分析糙米植物固醇含量的比較
Table 21. The comparison of phytosterol contents of brown rices analyzed by LC-MS and LC-ELSD
Rice Variety Free sterol Steryl ferulate Acylated steryl glucoside Steryl glucoside
MS ELSD MS ELSD MS ELSD MS ELSD 台稉9 號 35.84 ± 0.92 33.16 ± 4.35 73.42 ± 2.83 47.76 ± 6.00* 2.08 ± 0.11 12.52 ± 0.70* 8.73 ± 0.40 9.94 ± 0.75
台南11 號 35.10 ± 0.57 35.24 ± 1.48 87.93 ± 1.38 69.45 ± 3.00* 1.89 ± 0.07 12.61 ± 1.32* 7.50 ± 0.22 9.10 ± 0.26*
台農71 號 28.40 ± 0.52 27.34 ± 0.52 34.38 ± 1.27 24.83 ± 0.20* 1.29 ± 0.02 9.72 ± 0.34* 7.44 ± 0.14 8.52 ± 0.16*
高雄145 號 33.73 ± 1.14 30.31 ± 0.97* 45.42 ± 3.56 28.05 ± 1.48* 1.47 ± 0.07 5.69 ± 0.79* 9.43 ± 0.55 6.99 ± 0.36*
越光 31.89 ± 1.88 28.03 ± 2.57 54.73 ± 3.30 33.28 ± 1.97* 1.50 ± 0.09 5.72 ± 0.48* 10.44 ± 0.40 7.40 ± 1.07*
台中秈10 號 37.82 ± 1.24 29.64 ± 1.77* 45.86 ± 0.94 30.56 ± 0.27* 1.58 ± 0.05 10.85 ± 0.42* 6.37 ± 0.49 8.00 ± 0.32*
Data were shown as mean ± SD (n=3).
* indicates significant differences between different detection methods (p<0.05).
Table 22. Phytosterol contents of legumes determinded by HPLC-ELSD
Sterol classes Legumes
黃豆 黑豆 紅豆 綠豆 花豆
Free sterol 38.21 ± 0.87d 56.16 ± 0.49b 32.80 ± 1.43e 47.98 ± 1.26c 61.80 ± 3.64a Acylated steryl glucoside 36.13 ± 0.51b 52.08 ± 0.63a 50.57 ± 2.23a 30.32 ± 1.11c 39.75 ± 4.03b Steryl glucoside 17.77 ± 1.46a 19.09 ± 1.46a 4.86 ± 0.34c 9.19 ± 0.30b 8.18 ± 1.06b
Data were shown as mean ± SD (n=3) and were analyzed by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test. Different alphabet means significantly different (p<0.05).
表23. 不同偵測方法分析豆類植物固醇含量的比較
Table 23. The comparison of phytosterol contents of legumes analyzed by LC-MS and LC-ELSD Legumes
Free sterol Acylated steryl glucoside Steryl glucoside MS ELSD MS ELSD MS ELSD 黃豆 46.45 ± 1.50 38.21 ± 0.87* 37.45 ± 1.18 36.13 ± 0.51 31.18 ± 1.58 17.77 ± 1.46*
黑豆 56.51 ± 0.49 56.16 ± 0.49 27.72 ± 1.17 52.08 ± 0.63 * 29.87 ± 1.45 19.09 ± 1.46*
紅豆 54.37 ± 0.61 32.80 ± 1.43* 51.44 ± 0.43 50.57 ± 2.23 7.10 ± 0.11 4.86 ± 0.34*
綠豆 60.45 ± 1.87 47.98 ± 1.26* 16.12 ± 0.39 30.32 ± 1.11 * 12.98 ± 0.63 9.19 ± 0.30*
花豆 79.24 ± 0.82 61.80 ± 3.64* 24.52 ± 0.58 39.75 ± 4.03 * 11.36 ± 0.71 8.18 ± 1.06*
Data were shown as mean ± SD (n=3)
* indicates significant differences between different detection methods (p<0.05).
台粳 號9 台南11號 台農71號 高雄145號 越 光 米 台中 秈10號
Sterol content (mg/100 g)
0 20 40 60 80 100 120 140
FS SF ASG SG
圖30. 糙米中不同種類植物固醇的含量
Figure 30. Content of phytosterol conjugates in brown rices. FS: free sterol, SF: steryl ferulate, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside
黃 豆 黑 豆 紅 豆 綠豆 花豆
Sterol content (mg/100 g)
0 20 40 60 80 100 120 140
FS ASG SG
圖31. 豆類中不同種類植物固醇的含量
Figure 31. Content of phytosterol conjugates in legumes. FS: free sterol, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside
豆類樣品並未偵測到含有 steryl ferulate，酯化醣苷態固醇 MS 及 ELSD 的 結果有較大不同，其中黃豆及紅豆的結果無差異，黑豆、綠豆及花豆則為 ELSD 的 測量值較高。推測酯化醣苷態也與自由態相同，游離化程度依不同的固醇基團而 有差異，故雖然依米類結果的討論豆類的酯化醣苷態 ELSD 測量值應較高，但紅 豆 MS 結果顯示紅豆的酯化醣苷態固醇其固醇基團為 avenasterol 者約佔一半，
avenasterol 的游離化較佳，故這部分的含量亦被高估，可能為紅豆含量仍不變的 原因。黃豆其固醇組成較不同處為其接上亞麻油酸 (C18:2)的酯化醣苷態固醇含量 較高，但組成同樣有較高亞麻油酸的黑豆其 ELSD 結果較 MS 高，酯化醣苷態固
醇上的脂肪酸不同影響分子游離化的程度在本實驗中難以評估，黃豆2 種偵測器
測量值結果相同原因較難解釋。
醣苷態固醇的結果顯示 ELSD 測量值 (8.18-19.09 mg/100 g) 均較 MS 低，
由於LC-MS 分析醣苷態時也以自由態固醇定量，米類數據單以數值比較雖然與
ELSD 結果接近，但含量高的米種二者的差異變大，豆類醣苷態固醇的含量較多，
推測以自由態固醇定量時已與實際值大幅偏差；而紅豆醣苷態固醇量雖與米類接 近，但 ELSD 數值仍較低，顯示仍需考量 avenasterol (avenasteryl glucoside) 游離 化的問題。本實驗中豆類酯化醣苷態及醣苷態固醇以 MS 及 ELSD 定量結果差 異較大，但表24 以本實驗數據與文獻中同樣以 NP-LC-ELSD 分析豆類中醣苷態 及醣苷態固醇的結果對照，顯示相對數值大多符合，唯本實驗紅豆的結果略較黑 豆低，與文獻結果不同。
表24. 豆類酯化醣苷態及醣苷態固醇實驗數據與文獻數據的比較
Table 24. The comparison of values of acylated steryl glucoside and steryl glucoside of legumes between reference value and experimental value
Legumes
Acylated steryl glycosides Steryl glycosides
Reference valuea Experimental value Reference valuea Experimental value
黃豆 38.0 36.13 11.6 17.77
黃豆 38.0 36.13 11.6 17.77