國立臺灣大學生物資源暨農學院食品科技研究所 碩士論文
Graduate Institute of Food Science and Technology College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
糙米及豆類中不同型態植物固醇同步分析方法之建立 Simultaneous Determination of Phytosterol Conjugates in
Brown Rices and Legumes
蘇鼎元 Ding-Yuan Su
指導教授：呂廷璋 博士 Advisor: Ting-Jang Lu, Ph. D.
中華民國 101 年 7 月
July, 2012
謝誌
非常感激恩師呂廷璋博士對於學生的指導，在想法上有許多啟發，培養了我 發現問題，解決問題的能力，獲益良多。論文初成，感謝盧訓所長、張永和老師、
王惠珠老師與曾素香博士詳細審閱，對於內文及實驗不足之處提供許多寶貴意見，
使論文更趨完善。
感謝周宏農老師慷慨出借儀器，使實驗能順利進行；感謝聯米企業莊董事長 及蔡先生提供糙米樣品；感謝日本築野食品工業株式會社三浦隆志先生的協助提 供固醇標準品。感謝共儀中心祐維學長、佩吟學姐與宜如學姐協助儀器使用。
很高興能有R301 夥伴的陪伴，順利度過忙碌的碩士生活。感謝群惠學姊一開 始指導我做實驗，打下深厚的基礎，雪婷學姐、鐘凰學姐與麗嬋學姊對實驗的幫 忙與其他事務的協助。與同學凱琪與帆益一起努力做實驗、互相打氣，是段難忘 的日子，雖然實驗上都經歷了許多困難，最後都順利畢業了!謝謝學弟妹們：琬庭、
詩婷、令杰、芸華、韻慈、昱宗和振宇，平日的幫忙，R301 有你們在增添了許多 歡樂，接下來好好努力加油吧！
感謝我最愛的家人的支持，尤其是辛苦的媽媽，疲累的身軀回家後能吃到熱
好的晚餐，總讓疲倦減輕不少。一路走來受到許多幫助，心中的感激實難以三言 兩語表達，最後，謝謝大家！
中文摘要
植物固醇可分為自由態、steryl ferulate、酯化態、醣苷態及酯化醣苷態 5 種。
本實驗目的即為建立以液相層析/大氣壓力化學游離法串聯質譜 (liquid chromato- graphy/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry, LC/APCI-MS) 及 液相層析-蒸發光散射偵測器 (liquid chromatography-evaporative light scattering detector, LC-ELSD) 同步分析不同型態植物固醇的方法，來克服傳統分析植物固醇 的方法因需要酸水解與鹼皂化而造成固醇降解或異構化的缺陷。所建議方法以固 相萃取管 (NH2) 淨化樣品可去除三酸甘油酯，但同時去除酯化態固醇，再以 LC/
APCI-MS 分析；若以自由態植物固醇進行添加回收率評估，回收率介於 83.69- 106.89 %；此固相萃取法可取代傳統水解法並避免固醇分子產生異構化並保持完整 的植物固醇型態。使用逆相液相層析串聯質譜可同步分析自由態、steryl ferulate、
醣苷態及酯化醣苷態固醇的個別分子，植物固醇的最強特徵離子皆為其固醇基團 脫去一分子水的訊號，自由態固醇偵測極限介於5-50 ng/mL。另以正相液相層析- 蒸發光散射偵測器分析，樣品可不經前處理直接分析，正相層析管柱可將植物固 醇依結構上不同結合態分離，並定量該型態固醇的總量。但由於酯化態固醇與蠟 酯無法分離，仍無法對其定量；不同植物固醇偵測極限介於0.5-5 μg/mL。分析糙 米及豆類樣品結果顯示 LC-MS 及 LC- ELSD 的結果具有差異，由於結合態固醇 缺乏單一標準品而無法以 LC-MS 準確定量，而 ELSD 對於結構相似的固醇分子 感應值較相同，因此定量的數值應較 MS 的結果準確。樣品中的固醇組成以 avenasterol、campesterol、stigmasterol 及 β-sitosterol 為主，糙米中主要含有自由 態固醇及 steryl ferulate (γ-oryzanol)，醣苷態及酯化醣苷態的含量較低；豆類樣品 中含有自由態固醇及高量的酯化醣苷態固醇，但皆不含有 steryl ferulate。樣品中 黃豆及黑豆的醣苷態固醇含量較高。
關鍵字：結合態植物固醇、糙米、豆類、液相層析串聯質譜、大氣壓力化學游離 法、蒸發光散射偵測器。
英文摘要
Abstract
There are five common forms of phytosterols: free sterols (FS), steryl ferulates (SF), steryl glycosides (SG), acylated steryl glycosides (ASG) and steryl esters (SE).
The aim of this study was to develop simultaneous methods to determine free and conjugated phytosterols by LC/APCI-MS (liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry) and LC-ELSD (liquid chromatography-
evaporative light scattering detector), respectively, to overcome the degradation and isomerizaion drawbacks caused by acid hydrolysis and alkaline saponification in the traditional method. The suggested method was using NH2 solid-phase extraction (SPE) cartridge as clean-up tool before LC/APCI-MS analysis. The triglycerides but also steryl esters were removed from sample extracts. The recoveries of this method were 83.69 to 106.89 %, evaluated by using free phytosterols as standard. Replacing hydrolysis methods by SPE could avoid sterol isomerization and retain intact sterol conjugates.
Individual compound of FS, SF, SG and ASG was separated by reverse phase C18 column and detected by APCI-MS. All phytosterols give an intense characteristic ion corresponding to the loss of a water molecule from the sterol moiety. The limit of detection (LOD) for free sterols was 5-50 ng/mL. NPLC-ELSD could separate and detect lipid (phytosterol) classes synchronously without further sample pretreatment.
Sterol esters still could not be quantified by NPLC-ELSD because of the coelution of wax esters and steryl esters. The limit of detection (LOD) for phytosterols was 0.5-5 μg/mL. Results showed significant difference in the phytosterol contents of samples between measurement by LC-MS and LC-ELSD. Since the lack of single pure standard
of phytosterol conjugates, it is hard to accurately quantify by LC-MS. ELSD provides a more uniform response to structurally similar analytes, so here we speculated that the results measured by LC-ELSD were much accurate than LC-MS. Avenasterol,
campesterol, stigmasterol and β-sitosterol are predominate among sample phytosterols.
The major phytosterols in brown rices are FS and SF (γ-oryzanol) and there is less SG and ASG in brown rices. Legumes all have high content of FS and ASG but no SF.
Soybean and black soybean contain much higher amounts of SG than other samples.
Keywords: phytosterol conjugates, brown rice, legume, liquid chromatograph/tandem mass spectrometry, atmospheric pressure chemical ionization, evaporative light
scattering detector
縮寫表
APCI Atmospheric pressure chemical ionization ASG Acylated steryl glycoside
ELSD Evaporative light scattering detector ESG Esterified steryl glucoside
ESI Electrospray ionization EIC Extracted ion chromatogram
FS Free sterol
GC Gas chromatography HSE Hydroxycinnamic acid steryl ester LC Liquid chromatography MS Mass spectrometry SE Steryl ester (Steryl fatty acid ester) SF Steryl ferulate
SG Steryl glycoside (Steryl glucoside) SIM Selected ion monitoring SPE Solid phase extraction
總目錄
中文摘要 ... I 英文摘要 ... II 縮寫表 ... IV 總目錄 ... V 圖目錄 ... VIII 表目錄 ... X
壹、前言 ... 1
貳、文獻整理 ... 2
第一節、植物中的固醇 ... 2
一、結構 ... 2
二、結合態固醇 ... 4
第二節、植物固醇生理活性 ... 5
一、植物固醇的人體吸收及代謝 ... 5
二、植物固醇的活性 ... 6
第三節、植物固醇受加工的影響 ... 8
一、油脂精煉 ... 8
二、固醇氧化 ... 8
第四節、植物固醇的分析 ... 10
一、溶劑萃取 ... 10
二、化學及酵素水解 ... 11
三、固醇分離 ... 14
四、固醇分析與檢測 ... 16
五、自由態及結合態固醇分析 ... 21
參、研究目的與實驗架構 ... 22
肆、材料與方法 ... 24
第一節、實驗材料 ... 24
一、稻米 (Oryza sativa) ... 24
二、豆類 ... 24
第二節、藥品 ... 24
一、植物固醇標準品 ... 24
二、溶劑 ... 25
三、藥品 ... 25
第三節、儀器設備 ... 26
一、樣品製備及萃取 ... 26
二、固相萃取 ... 26
三、溶劑及樣品過濾 ... 26
四、逆相液相層析與串聯質譜系統 ... 27
五、正相液相層析-蒸發光散射偵測器系統 ... 27
第四節、實驗方法 ... 28
一、植物固醇萃取 ... 28
二、固相萃取法 ... 28
三、以逆相液相層析串聯質譜儀分析植物固醇 ... 28
四、以正相液相層析搭配蒸發光散射檢測器分析植物固醇 ... 31
陸、結果與討論 ... 33
第一節、溶劑選擇 ... 33
第二節、逆相液相層析串聯質譜儀分析樣品中的植物固醇 ... 34
一、植物固醇逆相液相層析法的建立 ... 34
三、植物固醇的定性 ... 38
四、檢量線線性、偵測極限及定量極限 ... 53
五、植物固醇的添加回收率 ... 54
六、樣品中植物固醇的含量 ... 57
第三節、正相液相層析搭配蒸發光散射檢測器分析樣品中的植物固醇 ... 68
一、植物固醇正相液相層析法的建立 ... 68
二、檢量線線性及偵測、定量極限 ... 69
第四節、樣品中的非固醇物質及雜質 ... 78
一、三酸甘油酯 ... 78
二、氧化態固醇 (Oxysterols) ... 79
三、雜質 ... 81
柒、結論 ... 85
捌、參考文獻 ... 86
玖、附錄 ... 96
圖目錄
圖1. 4-甲基及 4,4-二甲基植物固醇 ... 2
圖2. 於 4 號碳上無甲基取代的 C28 植物固醇 ... 3
圖3. 於 4 號碳上無甲基取代的 C29 植物固醇 ... 3
圖4. 結合態植物固醇的結構 ... 5
圖5. 固醇脫水的假設機制 ... 9
圖6. 固醇主要的氧化產物 ... 10
圖7. Fucosterol 及 Δ5-avenasterol 經由酸催化產生異構化的可能機制 ... 14
圖8. 糙米植物固醇萃取物的液相層析串聯質譜圖譜 ... 34
圖9. 移動相甲醇及乙腈比例為 1:1 時的植物固醇標準品液相層析串聯質譜圖譜 35 圖10. 三酸甘油酯及固醇標準品於 NH2管柱的層析圖 ... 37
圖11. β-Sitosterol 標準品的質譜圖 ... 42
圖12. β-Sitosteryl glucoside 標準品的質譜圖 ... 42
圖13. 24-methylencycloartanyl ferulate 標準品的質譜圖 ... 43
圖14. 24-methylencycloartanyl ferulate 標準品的質譜圖 (m/z 600-630) ... 43
圖15. β-Sitosteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 的質譜圖 ... 44
圖16. 自由態固醇的二次質譜圖 ... 45
圖17. Seryl ferulate 特徵離子的二次質譜圖 ... 46
圖18. 植物固醇混合標準品的層析質譜圖 ... 47
圖19. 糙米樣品的萃取離子層析圖 ... 49
圖20. β-sitosterol 標準品 (Calbiochem) 的層析圖 ... 49
圖21. 糙米樣品萃取液經日光照射前後的萃取離子圖譜 ... 51
圖22. 植物固醇混合物標準品 γ-oryzanol 處的層析圖 ... 52
圖24. 黃豆植物固醇萃取物的層析質譜圖 ... 56
圖25. 植物固醇及三酸甘油酯標準品的層析圖 ... 69
圖26. Cholesteryl palmitate 標準品的檢量線 ... 70
圖27. 台南 11 號糙米萃取液層析圖 ... 71
圖28. 台南 11 號糙米萃取液的 18-40 分鐘處層析圖 ... 72
圖29. 綠豆萃取液的 18-40 分鐘處層析圖 ... 72
圖30. 糙米中不同種類植物固醇的含量 ... 76
圖31. 豆類中不同種類植物固醇的含量 ... 76
圖32. 糙米樣品中 LLL (trilinolein) 的質譜圖 ... 78
圖33. 糙米樣品中 campesterol 氧化態的二次質譜圖 ... 79
圖34. 糙米樣品中 stigmasterol 氧化態的二次質譜圖 ... 80
圖35. 糙米樣品中 β-sitosterol 氧化態的二次質譜圖 ... 80
圖36. 糙米樣品中塑膠添加物的萃取離子層析圖 ... 81
圖37. 糙米樣品中 erucamide 的二次質譜圖... 82
圖38. 糙米樣品中 DINP 的二次質譜圖 ... 82
圖39. 糙米樣品中 Irgafos 168 phosphate 的二次質譜圖 ... 83
圖40. 氯仿經塑膠及玻璃針筒過濾後的層析圖 ... 84
圖41. 植物固醇結構命名 ... 96
表目錄
表1. 使用正相固相萃取管分離不同型態植物固醇 ... 15
表2. 正相液相層析法分析植物固醇 ... 19
表3. 逆相液相層析法分析植物固醇 ... 20
表4. 經 LC-APCI-MS 分析所得植物固醇的特徵離子及滯留時間 ... 40
表5. 自由態固醇的檢量線 ... 53
表6. 自由態固醇的添加回收率 ... 54
表7. 98 年期作糙米樣品自由態固醇的含量 ... 60
表8. 99 年期作糙米樣品自由態固醇的含量 ... 60
表9. 98 年期作糙米樣品醣苷態固醇的含量 ... 61
表10. 99 年期作糙米樣品醣苷態固醇的含量 ... 61
表11. 98 年期作糙米樣品酯化醣苷態固醇的含量 ... 62
表12. 99 年期作糙米樣品酯化醣苷態固醇的含量 ... 62
表13. 98 年期作糙米樣品 steryl ferulates 的含量... 63
表14. 99 年期作糙米樣品 steryl ferulates 的含量... 64
表15. 不同年份期作糙米植物固醇含量的比較 ... 65
表16. 豆類自由態固醇的含量 ... 66
表17. 豆類醣苷態固醇的含量 ... 66
表18. 豆類酯化醣苷態固醇的含量 ... 67
表19. 固醇及三酸甘油酯標準品的標準曲線 ... 70
表20. HPLC-ELSD 分析糙米植物固醇的含量 ... 74
表21. 不同偵測方法分析糙米植物固醇含量的比較 ... 74
表22. HPLC-ELSD 分析豆類植物固醇的含量 ... 75
表24. 豆類酯化醣苷態及醣苷態固醇實驗數據與文獻數據的比較 ... 77
壹、前言
植物固醇具有降膽固醇、抗腫瘤及抗發炎等生理活性，其結構具有5 種不同
型態，傳統分析植物固醇使用的水解法多僅針對水解後產生的自由態固醇分析，
步驟繁瑣具有許多缺點，如測得的固醇種類較少，醣苷態固醇被認為含量少而常 被忽略，但實際上醣苷態固醇於植物中的含量並不低，且具特殊生理活性。鑒於 現有植物固醇分析方法的諸多缺陷，本研究欲建立同步分析不同種類植物固醇的 方法，由於植物固醇大多無法以紫外光-可見光偵測器偵測，實驗以兩種系統來分 析植物固醇： (1) 正相液相層析搭配蒸發光散射偵測器及 (2) 逆相液相層析串聯 質譜儀，針對層析及質譜資訊作詳盡的討論。
貳、文獻整理
第一節、植物中的固醇
植物固醇 (phytosterols) 屬於三萜類 (triterpene) 的物質，存在於所有植物中，
其在植物細胞膜上具有穩定脂雙層結構的效果，與膽固醇在動物體內的功能類似。
而植物並非不含有膽固醇，它約占植物總固醇量1-2%，在某些植物科別或是植物
局部的組織器官部分，膽固醇可占總固醇量的5% 或更多 (Moreau et al., 2002)。
許多茄科 (Solanaceae) 植物含有高量的膽固醇 (Moreau et al., 2002)，如番茄 (Solanum lycopersicum) 其綠熟期果實的果皮中自由態固醇約含有 8% 的膽固醇 (Whitaker, 1988)。另真菌中的主要固醇為 ergosterol，由於真菌不屬於植物界，一 般將 ergosterol 稱為 fungal sterol (Weete et al., 2010) 而不歸類於植物固醇，但也 有部分文獻將其併入植物固醇的分類 (Piironen et al., 2000; Moreau et al., 2002)。
一、結構
根據在4 號碳上甲基的數目，植物固醇可分為 4-desmethylsterols、4-dimethyl- sterols 及 4-monomethylsterols 三種。4-desmethylsterols 在 4 號碳上不具有甲基，
植物固醇中含量較多的 β-sitosterol、stigmasterol 及 campesterol 皆屬此類；
4-monomethylsterols (如 gramisterol) 和 4-dimethylsterols (如 cycloartanol) 分別於 4 號碳上接上一及二個甲基 (圖 1)，這二種固醇為植物固醇生合成過程的中間產物，
故在大部分植物中的含量皆較 4-desmethylsterols 低 (Moreau et al., 2002)。
圖1. 4-甲基及 4,4-二甲基植物固醇
4-desmethylsterols 以結構中總碳原子數目再分類，主要分為27、28 及 29 個 碳三種 (圖 2 及圖 3)。大部分的固醇在 5 號及 6 號碳 (見附錄圖 41) 上有一雙鍵，
故稱為 Δ5 固醇；另有部分的固醇的雙鍵位在 7 號及 8 號碳上而非 Δ5 的結構，稱 為 Δ7 固醇。Δ5 及 Δ7 固醇都可能在其烴基 (alkyl) 支鏈上含有額外的雙鍵，多位 於22 及 23 號碳及 24 及 28 (24”) 號碳之間。含有 28 及 29 個碳醇在其 24 號碳上 接有甲基或乙基，如該處產生雙鍵則為亞甲基 (methylene) 或乙烯基 (ethylene)。
如固醇結構中的雙鍵全部被還原，則稱為該種固醇的烷醇 (stanol)，如 sitostanol。
圖2. 於 4 號碳上無甲基取代的 C28 植物固醇
Fig 2. C28 4-desmethyl phytosterols (Moreau et al., 2002)
圖3. 於 4 號碳上無甲基取代的 C29 植物固醇
二、結合態固醇
除了自由態的固醇，植物中尚有 4 種結合態固醇 (steryl conjugates) (圖 4)，皆 為固醇3 號碳上的羥基與不同的基團鍵結。
酯化態固醇 (steryl ester，SE) 為固醇與脂肪酸以酯鍵結合；常見與含 16 或 18 個碳的飽和或不飽和脂肪酸鍵結 (Zdzislaw, 1992)。
醣苷態固醇 (steryl glycoside，SG) 為固醇接上醣基，主要為 D 型葡萄糖以 β 型式鍵結，多為一個醣分子，如 β-sitosteryl glucoside，也有接上 2 到 4 個醣分子 的結構，如從紅豆中分離出的 β-sitosteryl 3-O-gentiotetraoside 即接有 4 個葡萄糖 (Kojima et al., 1989)；除了六碳醣外也有和五碳醣、醣醛酸及 6-去氧六碳醣鍵結的 固醇從植物中分離出來 (Kovganko and Kashkan, 1999)。
酯化醣苷態固醇 (acylated steryl glycoside，ASG) 為醣苷態固醇的醣分子上的 6 號碳上的羥基與一脂肪酸酯化鍵結，常見脂肪酸組成與酯化態類似 (Zdzislaw, 1992)，也有脂肪酸與醣分子上其他位置羥基鍵結的結構 (Kovganko and Kashkan, 1999)。
Hydroxycinnamic acid steryl ester (HSE) 或 steryl ferulate (SF)，為固醇或三萜 醇 (triterpene alcohol) 和阿魏酸 (ferulic acid)、對-香豆酸 (ρ-coumaric acid) 或咖啡 酸 (caffeic acid) (Fang et al., 2003) 以酯化鍵結，此種固醇大多存在於玉米及稻米 等穀類中，如米糠中可分離出的 γ-oryzanol 即屬 HSE，γ-oryzanol 中主要成分為
24-methylencycloartanyl ferulate、cycloartenyl ferulate、campesteryl ferulate 及
β-sitosterol ferulate (Xu and Godber, 1999)。圖4. 結合態植物固醇的結構
Fig 4. Structures of phytosterol conjugates. The sites of cleavage via alkaline hydrolysis (saponification) and acid hydrolysis are indicated with arrows (Moreau et al., 2002)
第二節、植物固醇生理活性 一、植物固醇的人體吸收及代謝
根據 Berger 等人的文獻回顧，不同族群中的日常植物固醇的攝取量約為 160-400 mg (Berger et al., 2004)；食物中植物固醇的主要來源為植物油，或是穀類 及其相關製品及堅果類。食物來源主要為植物的族群其植物固醇攝取量可能更高，
如墨西哥的 Tarahumara 印第安人較少攝食肉類，每日的植物固醇攝取量可達約 500 mg，而膽固醇攝取量僅 71 mg (Cerqueira et al., 1979)。
雖然植物固醇與膽固醇的結構相似，前者的吸收率遠較後者低。在人體對植 物固醇的吸收率實驗中，sitosterol 的吸收率約 0.5%，campesterol 約為 1.9%；
固醇支鏈的取代基增加及Δ5 處雙鍵被還原皆減少了植物固醇的吸收率 (Gylling and Miettinen, 2005)。
與脂肪酸酯化的酯化態固醇大部分在腸道內被水解成自由態固醇 (Miettinen et al., 2000)，故 Moreau 等人認為植物固醇的生理活性型態主要為自由態 (Moreau et al., 2002)。Lin 等人的動物實驗結果顯示，將酯化醣苷態及脂肪酸酯化態固醇分 別給予小鼠後，二者皆顯著降低膽固醇吸收。而大部分的酯化醣苷態被水解產生 醣苷態固醇，但醣苷態固醇並未進一步再水解成自由態固醇，作者認為醣苷態固 醇並不需要被水解成自由態即能展現降低膽固醇吸收的活性；而小鼠攝食酯化醣 苷態固醇後其肝及血液內植物固醇的含量並無顯著變化，顯示酯化醣苷態固醇並 未被動物體吸收 (Lin et al., 2011)。
二、植物固醇的活性
諸多研究證實所有種類的植物固醇已知皆具有降低血膽固醇的活性 (Tabata et al., 1980; Miettinen et al., 2000; Lin et al., 2009; Lin et al., 2011)，另有文獻顯示植 物固醇亦具有抗腫瘤 (anti-cancer) (Awad and Fink, 2000)、輔助抗癌藥物治療 (Awad et al., 2008)、免疫調節 (immune modulation) (Bouic, 2001)、抗發炎 (anti- inflammatory) (Islam et al., 2008) 及 抑制潰瘍 (anti-ulcer) (Goel and Sairam, 2002) 等活性。由於已有諸多文獻對植物固醇活性進行整理，因此本處僅簡述而不多做 回顧，但近年來醣苷態固醇被發現具有特殊的生理活性，故針對該處詳細整理。
曾在關島地區發生的特殊神經系統退化疾病，統稱為 amyotrophic lateral sclerosis-parkinsonism dementia complex (ALS-PDC)，其致病原因多年來仍不明瞭，
但可能和關島人的日常飲食有關聯。有研究推測這與關島人曾食用的蘇鐵 (Cycas micronesica, cycad) 種子中含有的毒性胺基酸有關，如 β-N-oxalylamino-L-alanine (BOAA) 及 β-N-methylamino-L-alanine (BMAA) (Ly et al., 2007)。但由於傳統上處 理蘇鐵種子時會先取出其含澱粉胚乳部分，切片後再水洗；這些水溶性的毒性胺
基酸大部分會在此水洗過程中被除去 (Duncan et al., 1990)，顯示這些胺基酸可能 並非引起 ALS-PDC 的主要原因 (Shaw and Wilson, 2003)。
由於推測致病因子並非水溶性物質，Khabazian 等人從蘇鐵種子中分離出低極 性的： β-sitosteryl β-D-glucoside (BSSG)、campesteryl β-D-glucoside 及 stigmasteryl β-D- glucoside 三種醣苷態固醇，這些醣苷態固醇具有去極化 field potentials、活 化不同的蛋白質激酶使大鼠腦皮質細胞釋出乳酸脫氫酵素 (lactate dehydrogenase, LDH) 等活性；而 BSSG 的配醣基，即 β-sitosterol 在此實驗中並未展現毒性 (Khabazian et al., 2002)。以 BSSG 處理小鼠運動神經元細胞株 NSC-34，結果顯 示細胞死亡率與 BSSG 濃度具有劑量關係 (Tabata et al., 2008)。將 BSSG (劑量：
10, 100 及 1000 μg/天) 餵食 C57/BL6 小鼠 10 週後，與控制組比較，最高劑量組別 其 lumbar spinal cord 處的運動神經元數目減少了 34%；而在最後給予 BSSG 後 間隔22 週，3 個不同 BSSG 劑量的實驗組其運動神經元數目都顯著減少 (10 μg:
-33%; 100 μg: -31%; 1,000 μg: -44%)，顯示即使停止餵食 BSSG 後，lumbar spinal cord 處的運動神經元仍持續減少 (Tabata et al., 2008)。分析蘇鐵組織中的醣苷態固 醇，顯示皆含有高量的 stigmasteryl glucoside 及 β-sitosteryl glucoside，如生長 8 個月的蘇鐵種子中含有0.790 mg/g stigmasteryl glucoside 及 0.722 mg/g β-sitosteryl glucoside (Marler and Shaw, 2010)。
以上細胞及動物實驗研究顯示醣苷態固醇會造成神經系統退化，並可能與攝 食蘇鐵種子引起的 ALS-PDC 有關連性，但仍有待進一步研究。
第三節、植物固醇受加工的影響
食物經過加工後其中的植物固醇含量可能降低或是固醇結構產生變化，植物 固醇可能在加工過程中產生許多反應，如氧化、水解、異構化及脫水等 (Piironen et al., 2000)。
一、油脂精煉
由於在植物油中含有高量的植物固醇，許多文獻探討油脂精煉對植物固醇的 影響。植物油在脫膠 (degumming) 時會將醣苷態固醇幾乎全部除去，鹼精製/脫酸 的步驟則會移除部份植物固醇，脫色 (bleaching) 會使固醇產生結構變異，如酯化 態固醇可能會脫去烴基、固醇氧化、脫水產生非極性的 steroidal hydrocarbons 及 異構化等 (Kochhar, 1983)。
研究顯示未精煉葵花油經過白土 (earth) 脫色後，Δ7 固醇會異構化產生 Δ8 及 Δ8(14) 固醇，Δ5 固醇的含量同時也降低 (Biedermann et al., 1996)。初榨橄欖 油中的24-methylenecycloartanol 在精煉後則會異構化產生 cyclobranol 及另一含 有 Δ7 雙鍵的固醇異構物 (Lanzón et al., 1999)。
Steroidal hydrocarbons (sterenes) 是植物油中的固醇在脫色時與酸性白土反應 或是脫臭 (deodorization) 時於高溫環境下的產生的脫水產物，如 steradienes 及 steratrienes；這類物質會傾向異構化形成含有共軛雙鍵因而更穩定的 Δ3,5 結構 (見 圖5) (Kasim et al., 2009)。由於 steroidal hydrocarbons 在未精煉油脂中的含量甚低，
因此檢測其含量可以判定油脂是否經過精煉或作為摻假與否 (初榨橄欖油) 的依 據 (Verleyen et al., 2002)。
二、固醇氧化
植物固醇與膽固醇的氧化機制相同，在有氧氣存在時，經加熱、光照或長時 間儲存會產生氧化反應 (Savage and Dutta, 2002; Otaegui-Arrazola et al., 2010)。
固醇氧化產物稱為氧化態固醇 (oxysterols)，7α/β-hydroxysterols、7-ketosterols、
5,6α/β-epoxysterols 及 triols 是最常被偵測到的固醇氧化產物 (圖 6)；固醇的側鏈 也可能產生氧化反應，如三級碳處氧化的20-及 25-hydroxysterols，但這類氧化固 醇的含量較低 (Piironen et al., 2000)。
研究顯示 stigmasterol 於 180℃ 加熱後，除了產生上述極性較高的氧化態固 醇，也偵測到含有中、低極性的氧化產物，如stigmastan-4,22-dien-3,6-dione、
stigmastan-3,5,22-trien-7-one 及 stigmastan-2,4,6,22-tetraene 等，顯示固醇氧化後又 進一步產生了脫水、氧化反應 (Menéndez-Carreño et al., 2010)。
圖5. 固醇脫水的假設機制
Figure 5. Postulated mechanism of sterol dehydration to form (a) steradienes and (b)
圖6. 固醇主要的氧化產物
Figure 6. Functional groups of major oxidation products of sterols (R, sterol nucleus) (Piironen et al., 2000)
第四節、植物固醇的分析 一、溶劑萃取
由於使用的萃取溶劑對固醇的溶解度會影響到萃取率，而不同的結合態固醇 其溶解度也不相同，挑選適合的萃取溶劑對於固醇分析為首要關鍵。因此 Heupel 認為在進行固醇的定量分析時，最主要的誤差可能來自於萃取步驟 (Heupel, 1989)。
固醇為低極性物質，一般被歸類於脂類化合物，文獻中可見使用正己烷 (Gunawan et al., 2006)、乙醚 (Rozenberg et al., 2003)、二氯甲烷 (Oliveira et al., 2008)、氯仿/
甲醇 (Miller and Engel, 2006)、丙酮 (Rudell et al., 2011)、甲醇 (Fang et al., 2003) 等有機溶劑或使用超臨界二氧化碳萃取 (supercritical carbon dioxide extraction) (Moreau et al., 1996) 進行固醇成分萃取。
研究顯示膽固醇於醇類中的溶解度從甲醇至正庚醇為止溶解度與醇類碳數成 正比 (Flynn et al., 1979)。Bar 等人測量 β-sitosterol 及膽固醇於高極性有機溶劑 中的溶解度依序為乙腈 < 甲醇 < 乙醇 < 丙酮 (Bar et al., 1984)；Wei 等人測量 β-sitosterol 於常用有機溶劑中的溶解度為甲醇 < 正己烷 < 乙醇 < 丙酮 < 乙酸
γ-Oryzanol 在丙酮、丁酮、乙酸乙酯及二氯甲烷中的溶解度高，異丙醇較低，
而正己烷的溶解度最低 (Kumar et al., 2009)。酯化態固醇如 cholesteryl acetate 的 溶解度為甲醇 < 乙醇 < 異丙醇 < 丙酮 (Bar et al., 1984)；β-sitosteryl maleate 及 stigmasteryl maleate 在乙酸乙酯中的溶解度高於丙酮 (Wang et al., 2007)。醣苷態 固醇於有機溶劑的溶解度並未搜尋到文獻可供參考。
使用Folch 法 (Folch et al., 1957)，以氯仿/甲醇 (2:1，v/v) 混和溶劑萃取包含 固醇的脂質為最常使用的萃取方式。文獻中提出在氯仿/甲醇萃取系統中如果樣品/
溶劑的比例 (solvent-to-tissue ratio) 太低時，可能會產生溶液分層，需要加入額外 的溶劑使溶液不分層，而樣品/溶劑的比例太高時，相對使水分的比例過低，會使 一些較高極性的固醇無法被完全萃取出來，如 di- 及 triglycosylsterols (Grunwald and Huang, 1989)。
二、化學及酵素水解
醣苷態固醇及酯化醣苷態固醇的醣苷鍵可藉由酸水解斷裂，SE、ASG 及 HSE 的酯鍵可由鹼水解 (皂化，saponification) 分離。由於常見檢測總固醇方式為將各 種結合態的固醇水解後再測量其自由態固醇 (包含原自由態固醇及結合態固醇水 解後釋出的自由態固醇) 的含量，這種分析方法須在萃取前或萃取後進行酸水解、
鹼皂化或是二者皆有 (Toivo et al., 2001) 以將結合態固醇水解。可根據樣品中結合 態固醇的含量決定採用何種水解方式，文獻中顯示精煉後的植物油中僅含有自由 態及酯化態 (脂肪酸) 固醇 (Kochhar, 1983)，即使植物油中原來含有醣苷態固醇 (SG 及 ASG)，在油脂精煉過程中也會被移除 (Toivo et al., 2001)，故僅使用鹼皂 化就足夠將所有的結合態固醇分解。
使用酸、鹼水解除了能水解結合態固醇，文獻提出部分固醇可能會卡在植物 的組織中而難以完全萃取出來，藉由酸、鹼水解後再進行萃取可將埋藏在植物組
在溶劑萃取前將樣品以鹽酸水解，比照直接鹼皂化的組別其自由態固醇含量多出 9 ~ 42%，顯示酸水解已將醣苷態固醇水解產生自由態固醇 (Toivo et al., 2001)。而 使用鹼水解可將與固醇一併萃取出的脂質 (如三酸甘油酯及磷脂質等) 分解，避免 後續分析時受到干擾。
但酸、鹼水解亦有缺點，Biedermann 等人的研究顯示，將 latosterol (Δ7- cholesterol) 於 80℃ 鹽酸/甲醇溶液中反應，結果顯示 Δ7-固醇比例隨著反應時間 增加逐漸降低，Δ8(14)- 及 Δ7-固醇的比例逐漸增加，表示在酸水解條件下
latosterol 產生異構化 (Biedermann et al., 1996)。Kesselmeier 等人的實驗指出 Δ5- 及 Δ7-avenasterols 會在酸水解的過程中降解 (Kesselmeier et al., 1985)；Kamal- Eldin 等人 (Kamal-Eldin et al., 1998) 將 fucosterol 鹽酸水解後以 GC-MS 分析產 物，圖譜上出現 fucosterol、Δ5-avenasterol 及其他 3 根波峰，作者推論產生異構化 的機制為在酸水解條件下固醇支鏈上具有 ethylene 基團的固醇該處的雙鍵會因可 能產生碳陽離子 (carbonium ion) 而不穩定，產生碳陽離子後會再脫去一氫質子轉 變成另一高度穩定的烯類，同時產生異構化 (圖 7)，由於三級碳陽離子較二級碳陽 離子穩定，因此在 GC-MS 圖譜上顯示異構物 a、b 及 c 的波峰面積均較 Δ5- avenasterol 高。
以上文獻顯示，結構為 Δ7 及支鏈上具有 ethylene 基團的固醇在酸水解的環 境下不穩定，短時間反應即產生異構化；另外 ergosterol 則會在酸水解下降解 (戴，
2012)。因此在分析含有這些固醇結構的植物或產品時使用酸水解可能會低估這類 結構固醇的含量。
目前並無文獻指出固醇在鹼皂化環境下會產生異構化，但 Oliveira 等人的研 究指出，將富含酯化態固醇的香蕉皮萃取物以氫氧化鉀水解後，4-dimethyl 及 4-monomethylsterol esters 其對應的自由態固醇及脂肪酸並未如預期增加，顯示這 種結構的酯化態固醇具有抗鹼水解的特性，如 cycloeucalenol、cycloartenol 及 24-methylenecycloartanol (Oliveira et al., 2008)。另有文獻指出，在製作紙漿的 kraft
pulping (kraft process) 步驟，4-dimethyl 及 4-monomethylsterol esters 與其他結構的 酯化態固醇相比能抵抗過程中的鹼水解，在水解後仍能存在。(Tenkanen et al., 2003)。
由於部分醣苷態固醇的酸不穩定性，Kesselmeier 等人使用 β-glucosidase 來 水解醣苷態固醇 (Kesselmeier et al., 1985)。並有研究使用酵素取代化學水解結合態 固醇，如使用不同種類的脂酶 (lipase) 水解酯化態固醇並可能同時水解三酸甘油 酯 (Fischer and Holl, 1990; Tenkanen et al., 2003)；Nyström 等人以不同來源的 β-glucosidase 及 steryl esterase 分別水解醣苷態 (SG, ASG) 及 steryl ferulates (Nyström et al., 2008)。但使用酵素水解也有缺點，如結合態固醇於酵素溶液中的溶 解度 (Kesselmeier et al., 1985)、酵素專一性 (Kesselmeier et al., 1985)、酵素水解速 率較慢及反應時間過長等問題，可能因上述缺陷使得使用酵素水解結合態固醇的 研究並不多。
圖7. Fucosterol 及 Δ5-avenasterol 經由酸催化產生異構化的可能機制
Figure 7. Representation of the hypothetical acid-catalyzed isomerization of fucosterol and Δ5-avenasterol (Kamal-Eldin et al., 1998)
三、固醇分離
在分析固醇前通常需要樣品前處理以將欲分析的固醇成分和其他非固醇物質 分離，達到淨化樣品並濃縮 (enrichment) 樣品中的固醇成分。使用製備型薄層層 析法 (thin-layer chromatography, TLC) 可快速分離不同的結合態固醇並針對化合 物定性 (Yamauchi et al., 2001; Caboni et al., 2005)，亦可見使用管柱層析 (column chromatography, CC) (Whitaker, 1988)、製備型高效液相層析管柱 (preparative preparative high performance liquid chromatography) (Xu and Godber, 1999) 區分化 合物；由於方便、快速及節省溶劑等優點，近年來研究多使用固相萃取法 (solid phase extraction, SPE) 進行固醇分離，表 1 為對文獻中使用正相固相萃取管進行不 同植物固醇結合態分離的方法整理。
Table 1. Separation of sterol conjugates by normal phase SPE cartridges Cartridge
type Condition
solvent Sample
solvent Elution solvent (ratio, v:v) Saponification1 References
SE FS HSE ASG SG
Silica CHCl3 CHCl3 CHCl3 CHCl3/ Me2CO
90:10 - Me2CO Y (Picchioni et
al., 1994)
Alumina(neutral) Hex Hex/DEE
20:80 Hex/DEE
20:80 Hex/DEE/EtOH
25:25:50 - - - Y (Phillips et al.,
2002)
Silica CHCl3 CHCl3 CHCl3 - - MeOH Y (Phillips et al.,
2005) Silica Hex Hex/EA
90:10
Hex/EA 90:10
Hex/EA 90:10 and Hex/EA/EtOH
25:25:50
- - - Y
(Cunha et al., 2006)
Silica, Hep Hep/DEE
90:10 - - Hep/DEE
90:10 and 50:50
Me2CO N2 (Nyström et
al., 2007)
Silica CHCl3 CHCl3 CHCl3 - CHCl3/Me2CO
50:50
N3 (Wewer et al., 2011) Hex/DEE
99:1
Hex/DEE 85:15 -: Not mentioned in the paper.
SE: steryl ester, FS: free sterol, HSE: Hydroxycinnamic acid steryl ester, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside.
CHCl3: chloroform, DEE: diethyl ether, EA: ethyl acetate, EtOH: ethanol, Hep: 1-heptane, Hex: hexane, Me2CO: acetone, MeOH: methanol.
1: SE and FS fractions were saponified after SPE. 2: HSE fraction was further purified using an acid–base wash. 3: Sterols were directly infused into the Q-TOF
由於固醇的低極性，文獻中幾乎都以正相固相萃取管 (如 silica 及 alumina) 分離不同型態的植物固醇。藉由不同結合態固醇極性的差異，酯化態、自由態及 醣苷態固醇可在正相固相萃取管上分離。Cunha 等人比較 silica 及 alumina 正相 固相萃取匣分離酯化態及自由態植物固醇能力，結果顯示回收率部分二者並無差 異，但 alumina 固相萃取匣再現性較差，可能因該種材質較易受到濕氣影響，故 最後作者採用 silica 固相萃取匣進行實驗 (Cunha et al., 2006)。
Lechner 等人在固相萃取前先將樣品衍生化，固醇結構上未鍵結的羥基處成為
三甲基矽醚而大幅降低其極性，再使用 silica 固相萃取匣將衍生化後的自由態及 酯化態固醇與相較極性稍高的三酸甘油酯分離，隨即以氣相層析分析 (Lechner et al., 1999)。
四、固醇分析與檢測
(一) 氣相層析法 (Gas chromatography, GC)
氣相層析法是最常用來分析固醇的方式 (Abidi, 2001)，在分析前樣品通常需 經過衍生化 (derivatization) 使分析物質能夠揮發，並提高解析度，目前常見以 TMS (trimethylsilyl) 進行衍生化，雖然文獻中也可見不衍生化直接分析的方式。氣 相層析法偵測方式主要為火焰離子偵測器 (Flame ionization detector, FID) 及質譜，
火焰離子偵測器僅能以波峰的滯留時間為定性的依據，而使用質譜可知該波峰的 離子片段而得到更多的結構資訊。
氣相層析法對個別固醇分子的分離效果佳，且固醇質譜離子片段具有較多的 文獻可供比對。但氣相層析法的缺點在於衍生化過程耗時，且可能產生副產物 (Rozenberg et al., 2003)，如在固醇醣基上衍生化不完全產生波峰變寬或重疊現象 (Pieber et al., 2010)；而酯化態、衍生化後的醣苷態 (SG 及 ASG) 固醇的沸點太高，
使用氣相層析法分析需要較高溫的分析條件而造成限制 (Caboni et al., 2005;
Pieber et al., 2010)。
(二) 高效液相層析法 (High performance liquid chromatography, HPLC)
相較於氣相層析法，液相層析法所用的分析條件較溫和，且為非破壞性的偵 測方式，故適用於分析熱敏感的固醇 (Abidi, 2001)。
1. 正相液相層析法 (normal phase liquid chromatography, NPLC)
正相液相層析可用於分離不同種類的結合態固醇，萃取物通常不經鹼皂化及 其他前處理，過濾後直接進行分析 (Moreau et al., 1990; Conforti et al., 1993;
Christie and Urwin, 1995)；正相層析法的優點為利用梯度層析可同步分析不同種類 脂質 (lipid class, 包含植物固醇)，但由於移動相通常由低極性轉換到高極性，要 找到適合的分析條件較為困難。正相層析較無法分離極性相近的個別固醇分子，
並有管柱平衡時間長及移動相揮發性高等缺點 (Abidi, 2001)。表 2 為對使用正相 液相層析法分析植物固醇的方法整理。
2. 逆相液相層析法 (reverse-phase LC, RPLC)
由於多數固醇物質的極性較低，使用逆相液相層析分析需要使用高比例有機 溶劑或不含水 (non-aqueous) 的移動相以避免分析物殘留於管柱中 (Abidi, 2001;
Lagarda et al., 2006)。移動相常使用甲醇、乙腈、異丙醇及四氫呋喃 (tetrahydrofuran) 等溶劑；文獻中多使用 C18 管柱，此外也可見 C8 (Yu et al., 2007)、C30 (Stöggl et al., 2005)及 Phenyl-hexyl (Mezine et al., 2003) 等管柱材質。表 3 為使用逆相液相層 析法分析植物固醇的方法整理。
3. 偵測器
由於除了具有共軛雙鍵的固醇 (如 7-dehydrocholesterol 和 ergosterol) 及 HSE 態的固醇分別在約 280 及 325 nm 有 UV 吸收外，其餘大多數自由態及結合 態固醇並無特殊吸收波長，故使用紫外光檢測器 (UV detector) 時必須在 200-210 nm 低波長下進行偵測，但會面臨使用梯度沖提時移動相 (如甲醇及異丙醇) 的 UV 界限波長 (cut-off) 干擾。
蒸發光散射檢測器 (evaporative light scattering detector, ELSD) 的原理為從管 柱流出的移動相溶劑進入霧化器 (nebulizer) 後與霧化氣體 (氮氣或空氣) 混合產 生氣膠 (aerosol)；氣膠為混合均勻的液滴，進入漂移管 (drift tube) 後其中的揮發 性成分如移動相經加熱蒸發，無法揮發的待測物質形成顆粒；懸浮於蒸氣中的顆 粒通過光檢測區時經雷射光照射產生散射，被散射的光子根據一固定的入射角度 由光二極體 (photodiode) 或光電倍增管 (photomultiplier tube) 偵測 (Young and Dolan, 2003)。
蒸發光散射檢測器的優點為除了高揮發性物質，其能偵測到大部分的化合物；
其偵測靈敏度與待測分子的光學性質無關而是根據該物質的絕對含量，對不同的 物質的偵測靈敏度較相近；由於移動相會被蒸發而不被偵測，有別於折射率偵測 器 (Refractive index detector, RI) 和紫外光檢測器的限制，蒸發光散射檢測器可使 用梯度沖提，並能同時維持圖譜基線平穩 (Young and Dolan, 2003)。另因蒸發光散 射檢測器對結構相近的化合物可產生均一的感應值 (response)，故在分析同類的物 質如脂質時，可用單一標準品所做的檢量線定量與該標準品相同類的物質 (Young and Dolan, 2004)。
質譜 (mass spectrometry) 的偵測靈敏度高，從分子離子 (molecular ion) 及離 子片段可提供較多的分析物結構資訊，而利用選擇離子偵測模式 (selected ion monitoring, SIM) 或萃取離子層析圖 (extracted ion chromatogram, EIC) 的方式可 對在層析上無法完全分離的波峰進行個別定量，故質譜為近年來最常使用的偵測 方式 (表 3)。由於多數固醇化合物的極性低，結構上缺乏可供電噴灑式
(electrospray ionization, ESI) 游離法離子化的基團 (Trösken et al., 2004)，故在文獻 中使用質譜進行固醇分析時會選擇大氣壓力化學游離法 (atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 作為游離方式 (Lagarda et al., 2006)。但也有部分文獻採 用電噴灑式游離法仍能順利分析不同結合態的固醇 (Caboni et al., 2005; Schrick et al., 2011)。大氣壓力化學游離法的原理為移動相溶劑被氮氣霧化成細小液滴，經 APCI 噴嘴 (APCI nozzle) 加熱後氣化進入游離區，施加高電壓於一接近噴嘴口的 尖針，產生電暈放電 (corona discharge)，溶劑分子形成離子，溶劑離子與待測物 分子作用後形成待測物離子，待測物離子進入質譜儀進行分析。
表2. 正相液相層析法分析植物固醇
Table 2. Normal phase liquid chromatography analysis of phytosterols
Detector Stationary and mobile phase (v:v) Sample solution Sterol investigated Matrix References UV, FID Lichrosorb Si-60 (100 × 3.0 mm, 7 μm)
A = isooctane-THF (99:1), B = IPA, C = H2O
CHCl3 SE, FS, ASG, SG Plant tissues (Moreau et al., 1990)
ELSD Lichrosorb Si-60 (100 × 3.0 mm, 7 μm) A = Hex-THF (99:1), B = IPA, C = H2O
CHCl3:MeOH = 2:1
SE, FS, ASG, SG Wheat flour (Conforti et al., 1993)
ELSD Spherisorb S3CN (100× 3.2 mm, 3 μm) A = isoHex-MTBE (98:2), B = IPA- CHCl3- AA (82:20:0.01), C = IPA-H2O- TEA (47:47:6)
CHCl3 SE, FS, ASG, SG Potato (Christie and Urwin, 1995)
ELSD LiChrosorb DIOL (100× 3 mm, 5 μm) A = Hex/AA (1000:1), B = IPA
Hex SE, FS, SF Corn fiber (Moreau et al., 1996)
ELSD LiChrospher Si-60 (125 × 4 mm, 5 μm) A = CHCl3, B = MeOH-H2O (95:5)
CHCl3 ASG, SG Edible plants (Sugawara and Miyazawa, 1999) ELSD, UV, MS LiChrosorb DIOL (100× 3 mm, 5 μm)
A = Hex/AA (1000:1), B = IPA, C = H2O
CHCl3:MeOH = 85/15
ASG, SG Lecithin, Biodiesel
(Moreau et al., 2008)
SE: steryl ester, FS: free sterol, HSE: Hydroxycinnamic acid steryl ester, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside.
AA: acetic acid, CHCl3: chloroform, Hex: hexane, iso-Hex: isohexane, IPA: isopropanol, MTBE: methyl tert-butyl ether, MeOH: methanol, TEA: triethylamine, THF: tetrahydrofuran.
表3. 逆相液相層析法分析植物固醇
Table 3. Reverse phase liquid chromatography analysis of phytosterols Method
detection
Stationary and mobile phase Separation/clean up method
Sterol investigated
Matrix References UV, APCI-MS Luna C18 (150 × 2.0 mm, 3 μm)
MeOH-EtOH
TLC, Silica gel column
SG, ASG Red bell pepper (Yamauchi et al., 2001)
APCI-MS Prevail C18 (150 × 2.1 mm, 2 μm) H2O/ACN-MeOH
SPE SG, FS Spelt and wheat (Rozenberg et al., 2003)
ELSD, ESI-MS Luna C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm) ACN-IPA
TLC SE Wheats (Caboni et al.,
2005) DAD, APCI-MS Prontosil 200-3-C30 (250 × 2.0 mm, 3 μm)
MeOH-tBME (75:25)
centrifugation HSE Rice bran oil (Stöggl et al., 2005)
UV, API-ES-MS Eclipse XDB-C8 (150 × 4.6 mm, 5μm)
ACN-H2O - HSE Rice germ and bran (Yu et al., 2007) DAD, APCI-MS Chromolith Performance RP-18e
(100 × 4.6 mm)
H2O/MeOH (20:80, v/v)-EtOH
SPE (for initial identification)
SG, FS, ASG, SE Apple peel (Rudell et al., 2011)
SE: steryl ester, FS: free sterol, HSE: Hydroxycinnamic acid steryl ester, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside.
ACN: acetonitrile, EtOH: ethanol, MeOH:methanol, IPA:isopropanol, tBME: tert-butyl methyl ether API-ES: atmospheric pressure interface-electrospray, DAD: diode array detection.
五、自由態及結合態固醇分析
最常見的固醇分析方式為使用溶劑萃取，將萃取液鹼皂化，使用溶劑萃出不 皂化 (unsaponifiable) 物，利用固相萃取淨化樣品 (可能省去此步驟)，衍生化後以 氣相層析法分析 (Piironen et al., 2000)；如使用液相層析法分析則不經衍生化。此 方法缺點為僅測得自由態及酯化態固醇而忽略了醣苷態固醇的存在，因醣苷鍵無 法被鹼水解並可能在皂化後的液/液分配萃取中被分離到水相層 (Heupel, 1989)。
為了測得總固醇的含量，Toivo 等人 (Toivo et al., 2001) 先以鹽酸進行酸水解，
再於氫氧化鉀-乙醇溶液中鹼皂化，萃取不皂化物後衍生化並以氣相層析法分析。
其結果顯示使用酸及鹼水解併用測得的玉米粉及洋蔥的總固醇量高於只使用鹼皂 化的方法，顯示這二種樣品中含有相當量的醣苷態固醇；使用這二種方法檢測葡 萄籽油的總固醇量並無明顯差異，顯示葡萄籽油中不含有醣苷態固醇。雖然這方 法成功檢測了樣品中總固醇的含量，但經酸水解後 Δ5-avenasterol 的含量些微下 降，顯示這種酸敏感的固醇在酸水解環境下產生結構變化。
Breinhölder 等人 (Breinhölder et al., 2002) 以固相萃取分離非極性脂質 (自由 態及酯化態固醇) 及醣脂質 (醣苷態固醇)。非極性脂質鹼皂化後以氣相層析分析 可得自由態及酯化態固醇的合併含量；醣脂質再經固相萃取分離並以液相層析-蒸 發光散射檢測器檢測醣苷態固醇，此方法分開檢測非極性及較高極性的固醇，可 測得不同型態植物固醇的含量，不使用酸水解避免了酸敏感固醇產生異構化。
目前的研究多利用薄層層析法或是固相萃取的方式分離不同型態的植物固醇，
並個別分析分離出的該種固醇 (表 1 及表 3)，對於結合態固醇可能會使用酸/鹼水 解並以釋出的自由態固醇定量 (Cunha et al., 2006; Nyström et al., 2007)。
參、研究目的與實驗架構
第一節、研究目的
鑒於目前缺乏同步分析不同型態植物固醇的分析方法，本實驗的研究目的為：
以固相萃取法取代傳統水解法來分離植物固醇，可保存完整的植物固醇結構；再 以逆相液相層析串聯質譜法進行同步分析，利用化合物的特徵離子來推測其分子 結構。
另使用正相液相層析-蒸發光散射檢測器分析植物固醇，此方法樣品只須以溶 劑萃取後再將萃取液過濾即可進行分析，不須經其他前處理，可將不同脂質 (固醇) 分為大類進行分析，得知該類固醇化合物的總量；並比較二種分析方法測定樣品 植物固醇含量的差異。
第二節、實驗架構
糙米及豆類樣品萃取
以 RP-LC-APCI-MS 分析植物固醇
FS, SF, SG, ASG
固醇特徵離子、二次質譜
定性、定量
方法確校
建立層析方法及 ELSD 霧化條件
固相萃取法淨化樣品、分離植物固醇 選擇固相萃取管
及流洗溶劑
建立層析方法及 質譜游離條件
以 NP-LC-ELSD 分析植物固醇
SE, FS, SF, SG, ASG
肆、材料與方法
第一節、實驗材料 一、稻米 (Oryza sativa)
稻穀樣品由聯米企業提供，期作年份及米種如下：
98 年期作：高雄 139 號、高雄 145 號 、台南 11 號、台農 71 號、台中秈 10 號、
台稉9 號。99 年期作：高雄 145 號、台南 11 號、台農 71 號、台中秈 10 號、台稉 9 號、越光米。稻穀經去殼機脫殼後，糙米部分再以刀片式磨粉機 (固定 20000 rpm) 磨粉，磨粉條件參考儀器對稻穀類建議操作方式，秤取50 g 糙米，磨粉 5 秒鐘 × 2 次。
二、豆類
豆類樣品購自賣場，種類及商品標示產地如下：
黃豆 (Glycine max, 產自加拿大)、黑豆 (Glycine max (L.) Merr., 產自中國)、紅豆 (Vigna angularis, 產自台灣)、綠豆 (Vigna radiate, 產自台灣)、花豆 (Phaseolus coccineus L. var. albonanus Bailey, 產自台灣)。以刀片式磨粉機 (固定 20000 rpm) 磨粉，磨粉條件參考儀器對豆類建議操作方式，秤取50 g 豆類，磨粉 5 秒鐘 × 2 次。
第二節、藥品
一、植物固醇標準品
1. Campesterol，純度≧97%，タマ生化學株式會社，(Tokyo, Japan)。
2. Cholesterol，純度≧99%， Sigma (St. Louis, Mo, USA)。
3. Cholesteryl palmitate，純度≧97%，MP Biomedicals (Boston, MA, USA)。
4. Ergosterol，純度≧95% ，東京化成工業株式會社，(Tokyo, Japan)。
5. Esterified steryl glucosides，純度≧98%，Matreya LLC (Pleasant Gap, PA, USA)。
6. Sitostanol，純度≧95%，Sigma (St. Louis, Mo, USA)。
7. Steryl glucosides，純度≧98%，Matreya LLC (Pleasant Gap, PA, USA)。
8. Stigmasterol，純度≧95%，Sigma (St. Louis, Mo, USA)。
9. Tristearin，純度≧97%，MP Biomedicals (Boston, MA, USA)。
10. β-Sitosterol，純度≧97%，タマ生化学株式會社 (Tokyo, Japan)。
11. β-Sitosterol，總固醇≧95%，Calbiochem (Darmstadt, Germany)。
* 內含 β-Sitosterol 75.5%, Sitostanol 13.0%, Campesterol 8.4%, Campestanol 1.3 % 12. γ-Oryzanol，純度 98.7%，築野食品工業株式會社 (Wakayama, Japan)。
* 參考值內含 campesteryl ferulate 13.2%, β-sitosteryl ferulate 7.4%
cycloartenyl ferulate 36.3%, 24-methylencycloartanyl ferulate 40.7%
二、溶劑
1. Acetone：層析級，純度 99.9%，景明公司 (Miaoli, Taiwan)。
2. Acetonitrile：質譜級，純度 100%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
3. Chloroform：層析級，純度 100%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
4. Ether：層析級，純度 99.9%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
5. Ethyl acetate：試藥級，純度 99.9%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
6. Methanol：層析級，純度 99.9%，Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ, USA)。
7. Methanol：質譜級，純度 100%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
8. n-Hexane：層析級，純度 99%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
9. 2-Propanol：層析級，純度 99.7%，J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)。
三、藥品
1. Formic acid：試藥級，純度 99.7%，Riedel-de Haën (Germany)
2. Butylated hydroxytoluene (BHT)：試藥級，純度≧99%，Sigma (St. Louis, Mo, USA)
第三節、儀器設備 一、樣品製備及萃取
1. 刀片式磨粉機：1095 Knifetec Sample Mill，Foss Tecator 製造 (Höganäs, Sweden) 2. 水浴槽 (Shaker bath)：Hotech 製造 (Taipei, Taiwan)
3. 減壓濃縮機 (Rotary evaporator)：RE111，Buchi 製造 (Flawil, Switzerland) 4. 減壓濃縮機用水浴槽 (water bath)：461，Buchi 製造 (Flawil, Switzerland) 5. 超音波洗淨器 (Ultrasonic cleaner)：power sonic 420，Hwashin 公司製造
(Korea)
二、固相萃取 1. 固相萃取管：
Strata® NH2, 500 mg / 3 mL Tubes，購自 Phenomenex (Torrance, CA, USA) Strata® SI-1 Silica, 500 mg / 3 mL Tubes，購自 Phenomenex (Torrance, CA, USA)
Sep-Pak® Plus tC18 cartridge, 400 mg，購自 Waters (Milford, MA, USA) 2. 固相萃取真空抽氣裝置：Sample preparation unit，Merck 製造 (Dermstadt,
Germany)
3. 抽氣幫浦：Bio-Vac 240 Suction System，今日儀器製造 (Taipei, Taiwan)
三、溶劑及樣品過濾
1. HPLC 流洗液過濾裝置：抽氣瓶：Millipore 製造 (Billerica, MA, USA) 2. 固定濾膜裝置：購自慶發玻璃公司 (Hsinchu, Taiwan)
3. 尼龍過濾膜 (Nylon membrane)：47 mm × 0.22 μm，購自 Chrom Tech (Apple Valley, MN, USA)
4. 濾紙 (filter paper)：No. 1, 9.0 cm I.D.，購自 Whatman (Springfield Mill, UK) 5. 針筒過濾器 (Syringe filter)：Nylon, 13 mm × 0.22 μm，購自 Agilent
Technologies (Santa Clara, CA, USA)
四、逆相液相層析與串聯質譜系統
1. 由 Thermo Scientific 製造 (Waltham, MA, USA)：
離子阱式質譜儀：Finnigan LXQ Linear Ion Trap Mass Spectrometer，含大氣壓 力化學游離離子源 (APCI) 及電噴灑游離離子源 (ESI) 探針 (Probe)
自動進樣器 (Autosampler)：Finnigan Surveyor autosampler plus
層析幫浦 (Pump)：Finnigan Surveyor LC pump plus, sample loop volume: 25 μL 光二極體陣列式檢測器 (Photo Diode Array detector)：Finnigan Surveyor PDA plus detector
數據擷取與處理軟體 (data acquisition and processing software)：LXQ tune and Xcalibur 2.0.7
2. 液相層析管柱 (HPLC column)：
Kinetex C18, 150 × 2.1mm I.D. 2.6 µm, 10 nm，Phenomenex (Torrance, CA, USA) KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter 0.5 µm Depth Filter x 0.004in ID，
Phenomenex (Torrance, CA, USA)
五、正相液相層析-蒸發光散射偵測器系統 1. 由 Hitachi 公司製造 (Tokyo, Japan)：
層析幫浦 (Pump)：Model L-7100
紫外光-可見光偵測器 (UV-VIS Detector)：Model L-7420 自動進樣器 (Autosampler)：Model L-7200，進樣體積：20 μL
2. 管柱恆溫器 (column oven)：Model EOC-1，立行公司製造 (Taipei, Taiwan) 3. 蒸發光散射偵測器 (evaporative light scattering detector)：Varex MKIII ELSD，
Alltech 公司製造 (Deerfield, IL, USA)
4. 無油式空氣壓縮機 (Oilless Piston Air Compressor)：Model M450GX，Gast Manufacturing 公司製造 (Benton Harbor, MI, USA)
5. 數據擷取與處理軟體 (data acquisition and processing software)：SISC chromatography data system，購自訊華公司 (Taipei, Taiwan)
6. 液相層析管柱 (HPLC column)： Chromatorex Diol SPS 100-5 (250×4.6 mm I.D.
第四節、實驗方法 一、植物固醇萃取
精秤2 g 的樣品粉末 (磨粉條件詳見實驗材料處) 後倒入 125 mL 磨砂口錐形 瓶，加入0.1 mL (10 mg/mL, 溶於甲醇) 的 BHT (butylated hydroxytoluene) 作為抗 氧化劑，加入 10 mL 甲醇，使用超音波震盪 1 分鐘後再加入 20 mL 氯仿，置於 30℃ 水浴槽中振盪萃取20 分鐘。萃取液以 Whatman No. 1 濾紙 (直徑 9 cm) 及 玻璃漏斗過濾至濃縮瓶，濾紙上的濾渣以甲醇沖入錐形瓶中，再進行上述萃取步 驟二次。重複萃取三次的萃取液於40℃ 水浴鍋中減壓濃縮，再以 6 mL 氯仿回溶，
即為樣品液 (最終 BHT 濃度約 0.05%)，所有樣品皆為三重複 (n = 3)。
二、固相萃取法
參考 Pinkart 等人利用 NH2 固相萃取管分離微生物脂質的方式 (Pinkart et al., 1998) 及 Russo 等人利用 NH2 固相萃取管分離出動物油中膽固醇的方法 (Russo et al., 2005) 加以修改，將固相萃取管插入固相萃取真空抽氣裝置上，使用 玻璃吸量管吸取有機溶劑。以3 mL 的正己烷活化 NH2 固相萃取管 (500 mg / 3 mL)，加入樣品液 200 μL，以正己烷/乙酸乙酯 (95:5, v:v) 6 mL 洗去三酸甘油酯及 酯化態固醇，再依序加入各5 mL 的氯仿、丙酮及甲醇，自由態固醇及 steryl ferulate 主要於氯仿層中，酯化醣苷態在丙酮層，醣苷態固醇於甲醇層。合併收集流洗下
來的氯仿、丙酮及甲醇流洗液，收集液減壓濃縮至乾後以2 mL 甲醇回溶，以玻璃
針筒及0.22 µm Nylon
針筒過濾器過濾置入 2 mL 褐色樣品瓶，保存於-20℃ 待 LC-MS 分析。
三、以逆相液相層析串聯質譜儀分析植物固醇 (一) 分析條件
經過固相萃取分離淨化後的樣品，以自動進樣器注入管柱，進樣體積為25 μL。
使用管柱為 Kinetex C18 (150 × 2.1 mm, 2.6 μm)，管柱溫度 30℃；移動相為 A：超 純水、B：乙腈及 C：甲醇組成的三相系統，移動相皆含有 0.1% 甲酸，流速為 0.3 mL/min。層析梯度為線性，條件如下：
Time (min) A (%) B (%) C (%)
0 15.0 42.5 42.5
10 0.0 50.0 50.0
30 0.0 50.0 50.0
32 0.0 20.0 80.0
80 0.0 20.0 80.0
82 15.0 42.5 42.5 100 15.0 42.5 42.5
(二) 標準品
將 cholesterol、campesterol、stigmasterol、β-sitosterol 及 sitostanol 溶於丙酮 中，再以甲醇稀釋成100 μg/mL 的儲備液，分析時以甲醇序列稀釋作為檢量線樣 品。非單一物質的標準品 γ-oryzanol 及 esterified steryl glycosides 溶於丙酮，steryl glycosides 溶於氯仿，分別作為 steryl ferulate、酯化醣苷態及醣苷態固醇的標準品，
同樣以甲醇稀釋並與自由態固醇混合作為對照用的混合標準品。
(三) 自由態固醇的添加回收率
將 cholesterol、campesterol、stigmasterol、β-sitosterol 及 sitostanol 添加到糙 米樣品 (2 g) 中各 30、90 及 180 µg (相當於最後樣品液中濃度 0.5, 1.5 及 3.0 μg/mL)，依前述樣品萃取方式萃取及以固相萃取淨化樣品，經 LC-MS 分析後計 算結果，將添加自由態固醇後測定的固醇量扣除未添加的數值，計算各個自由態 固醇的添加回收率百分比。
(四) 植物固醇的質譜分析 1. 游離化條件設定
由於本實驗方法植物固醇大多於移動相提升到完全為有機相時才被流洗出管
柱，模擬實際分析時的移動相條件，使用T 型接頭連接針筒幫浦 (混和自由態固
醇標準品，1 μg/mL，流速 5 μl/min) 及流洗液 (乙腈:甲醇=1:1，流速 300 μl/min)，
將混和溶液直接注入質譜儀中。於正電模式下以自動調機 (auto tune) 調整儀器參 數，並以半自動模式調整 sheath gas、aux gas、電壓等參數，β-sitoserol 的離子訊 號 (m/z 397) 強度最佳化，並以此 tune file 作為分析時所用的質譜條件：
Capillary temperature: 150℃, APCI vaporizer temperature: 350℃, Sheath gas flow: 20 arb (arbitrary unit), Aux gas flow: 5 arb, Source voltage: 6 kV, Source current: 5 μA, Capillary voltage: 5 V。
2. 以二次質譜對植物固醇進行斷裂片段分析
選定一次質譜所得植物固醇的離子訊號，額外施加能量撞擊此母離子使其解 離 (collision-induced dissociation, CID)，可得該離子的二次質譜，為該化合物特有 的離子片段，可做為定性參考。實驗中皆設定 CID 能量值為 25%。
3. 檢量線配製及質譜分析的偵測與定量極限
配製不同濃度的自由態固醇標準品溶液：10000, 5000, 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1 ng/mL，以液相層析串聯質譜儀分析，數據處理時將 peak smoothing (波峰平滑) 的設定至最大，以濃度及積分面積的關係製作檢量線並計算 其 R square 值。另以該波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N) ≧ 3 時的濃度定
為儀器偵測極限 (limit of detection, LOD) ；
波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N)≧ 10 時的濃度定為儀器定量極限 (limit of quantitation, LOQ)。
4. 定量計算
以數據處理軟體 Xcalibur 選擇固醇基團脫去一分子水的最強特徵離子訊號，
以 extracted ion chromatogram (EIC) 選擇該離子觀察，得出各波峰的面積。自由態 固醇各以其標準品定量，無標準品的 avenasterol 則以 stigmasterol 定量，由於缺 乏各類結合態固醇的單一物質標準品，仍以自由態固醇為定量基準，如結合態固 醇其結構中固醇基團為β-sitosterol 者，皆以 β-sitosterol 定量，以此類推，固醇基 團為 avenasterol 者則以 stigmasterol 定量。Steryl ferulate 中的 cycloartenyl ferulate, cycloartanyl ferulate 及 24-methylencycloartanyl ferulate，包含其 cis-ferulate 型皆以β-sitosterol 定量。
四、以正相液相層析搭配蒸發光散射檢測器分析植物固醇 (一) 分析條件
將萃取後的樣品液以氯仿適當稀釋後以玻璃針筒及0.22 µm Nylon
過濾器過濾 置入 2 mL 褐色樣品瓶，以自動進樣器注入分析，進樣體積為
20 μL，使用管柱為 Diol (250 × 4.6 mm, 5 μm)，管柱溫度 30℃；移動相為 A：正己烷 (含有 0.1% 甲 酸) 及 B：異丙醇，流速為 1.0 mL/min。層析梯度為線性，條件如下：Time (min) A (%) B (%)
0 100 0
5 100 0
7 99 1
20 99 1
25 80 20
35 75 25
40 15 85
50 15 85
52 100 0 75 100 0
蒸發光散射檢測器參數設定：漂移管溫度 (Drift tube temperature)：75℃，
霧化器氣體流速 (Nebulizaer gas flowrate)：2.2 SLPM (Standard Liters Per Minute)，
氣體為空氣。
(二) 標準品
以 cholesteryl palmitate (酯化態固醇)、tristearin (三酸甘油酯)、β-sitosterol (自 由態固醇)、γ-oryzanol (steryl ferulate)、esterified steryl glycoside (酯化醣苷態固醇) 及 steryl glycoside (醣苷態固醇) 作為定量用標準品，除 steryl glycosides 溶於氯仿:
甲醇 = 2:1 (v:v) 的 Folch 溶劑中，其餘標準品皆溶於氯仿。將標準品混合配製為 200 μg/mL (steryl glycosides 及 esterified steryl glycoside 為 100 μg/mL) 儲備液保 存，分析時以氯仿序列稀釋成不同濃度的溶液作為檢量線樣品。
(三) 檢量線配製及蒸發光散射檢測器的偵測與定量極限
Cholesteryl palmitate、β-sitosterol 及 γ-oryzanol 的配製濃度為：1, 5, 10, 20, 40, 80, 120, 160, 200 μg/mL；tristearin、esterified steryl glucoside 及 steryl glucoside 的 配製濃度為：0.5, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL。以濃度及積分面積的關係製 作檢量線並計算其 R square 值。另以該波峰的訊噪比 (Signal-to-noise ratio, S/N) =
3 時的濃度定為儀器偵測極限 (limit of detection, LOD)；波峰的訊噪比 (Signal-to-
noise ratio, S/N) = 10 時的濃度定為儀器定量極限 (limit of quantitation, LOQ)。
陸、結果與討論
第一節、溶劑選擇
雖然植物固醇均屬低極性物質，但其接上不同的取代基後仍造成其極性及對 溶劑溶解度的改變，而本實驗目的在於同步分析不同型態的植物固醇，因此尋找 對各種植物固醇皆有良好溶解度並能與流洗液互溶的溶劑為首要關鍵。
在溶解自由態植物固醇標準品試驗中發現甲醇、異丙醇及正己烷的溶解度皆 不佳，而丙酮的溶解效果良好，故自由態、γ-oryzanol 及酯化醣苷態植物固醇標準 品皆溶於丙酮；但發現醣苷態固醇於丙酮的溶解度較差，因此改溶於氯仿，後續 再以甲醇稀釋，作為逆相層析時所用的標準品溶劑。正相層析實驗由於流洗液構 成含低極性正己烷，參考分析脂類物質文獻所使用的溶劑 (Moreau et al., 1990;
Christie and Urwin, 1995)，將標準品溶於氯仿中，但因醣苷態配製的濃度較高，發 現氯仿已不能有效溶解，改以氯仿/甲醇 2：1 (v:v) 的 Folch 溶劑即能順利溶解。
樣品溶劑的選擇除了溶解度與其和移動相的互溶性外，另一需考慮的為該溶 劑與移動相強度的差異。如將樣品溶解於比移動相溶劑強度更高的溶劑中，可能 造成波峰變寬 (broadening) 或變形 (distortion) (Snyder et al., 2010)。在逆相層析分 析植物固醇的預實驗時，由於初始選擇丙酮作為固相萃取後收集液濃縮回溶的溶 劑，經分析後發現產生嚴重的波峰變形 (圖 8-A)，為解決此問題將該丙酮樣品液 以流洗強度較弱的甲醇稀釋10 倍後即改善 (圖 8-B)；而由於僅取少量樣品進行固 相萃取，植物固醇的濃度已大幅降低，之後則全以甲醇回溶、稀釋樣品。正相層 析實驗則因氯仿對各種植物固醇都有良好的溶解度，因此選擇氯仿作為樣品的溶 液，實驗時並未發現產生波峰變形的問題。
綜合上述結果，單一組成溶劑中可與水互溶的溶劑以丙酮對於不同型態的植 物固醇的溶解度最好，不與水互溶的溶劑則為氯仿；而氯仿的溶解度又較丙酮更 佳，因其能溶解一定比例 (根據實驗推測至少 100 μg/mL) 的醣苷態固醇。植物固 醇中的醣苷態固醇由於含有醣基，極性為固醇中最高者，氯仿對其溶解度不高，
高極性的丙酮亦難溶，使用 Folch 溶劑方能溶解高濃度的醣苷態固醇標準品，根 據此現象推論使用 Folch 法萃取不同型態植物固醇仍是目前最有效率的方法。但
圖8. 糙米植物固醇萃取物的液相層析串聯質譜圖譜
Figure 8. LC-MS chromatograms of brown rice phytosterols extract (A) dissolved in acetone (B) diluted the acetone solution 10 times with methanol
第二節、逆相液相層析串聯質譜儀分析樣品中的植物固醇 一、植物固醇逆相液相層析法的建立
(一) 管柱選擇
在建立層析方法時選用了Kinetex C18 (150 × 2.1mm, 2.6 µm) 管柱，在預實驗 時比較了 Kinetex C18 與其他 2 種管柱 Kinetex PFP (150 × 2.1mm, 2.6 µm) 及 YMC hydrosphere C18 (150 × 2.0 mm, 5 um) 對於 6 種自由態固醇的分離效果，結 果顯示Kinetex C18 管柱分離效果遠高於 YMC hydrosphere C18 管柱，如 YMC 管 柱對 campesterol 及 stigmasterol 分離不佳，而 Kinetex PFP 管柱則幾乎無法將個 別的自由態固醇分離開。因此本實驗以 Kinetex C18 管柱進行後續分析。
(二) 移動相選擇
大部分的植物固醇都於移動相提升至100%的有機相時才被流洗出管柱，但實
驗結果顯示移動相由85%的有機相開始梯度層析會比一開始就使用 100%有機相的
分離效果好。根據文獻對層析方法的整理，使用逆相層析移動相中有機相為乙腈
RT:14.00 - 40.00 SM:15B
14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Time (min) 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Relative Abundance
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Relative Abundance
NL: 8.97E5 Base Peak m/z=
350.00-450.00 F: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-2000.00] MS 20111120-BR-CHCl3
NL: 1.77E5 Base Peak m/z=
350.00-450.00 F: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-2000.00] MS 20111125-br-chcl3-meoh- 10x
