(B)
時流洗順序為 campesterol → stigmasterol，甲醇的結果則相反 (Abidi, 2001)；但本 實驗結果顯示使用 Kinetex C18 管柱於水-甲醇或是水-甲醇/乙腈的系統下流洗順 序皆為campesterol → stigmasterol。此管柱在水-甲醇系統下無法將 campesterol 及 stigmasterol 分離，故再使用乙腈部分或完全取代甲醇下條件的測試這 2 種固醇分 Figure 9. LC-MS chromatogram of phytosterol standards, mobile phase consisting of methanol:acetonitrile 1:1. Extracted ion chromatogram in the 350 to 450 m/z range. CA:
RT:10.00 - 25.00 SM:15B APCI corona Full ms [200.00-1000.00] MS
二、固相萃取法分離植物固醇
由於三酸甘油酯及酯化態固醇會滯留於 C18 管柱中，於本實驗的層析系統下 需要長時間方能流洗出來。因此尋找將其二者去除並可同時分離出其他型態植物 固醇的固相萃取法極為重要。
(一) Silica SPE
一開始使用最多文獻 (見表 1) 採用的 silica 材質固相萃取管 (SI-1 Silica, 500 mg, Phenomenex) 試驗，以表 1 中所列的流洗方法進行糙米樣品的淨化，使用正己 烷活化固相萃取管後加入溶於氯仿的樣品萃取液，依序以正己烷、正己烷:乙醚 (v:v, 90:10、85:15、80:20、70:30、50:50、0:100) 流洗，結果顯示正己烷:乙醚 = 85:15 含有大部分的自由態及 γ-oryzanol，但仍含有大量的三酸甘油酯，而表 1 中所列的 方法幾乎都針對酯化態及自由態固醇的區分層再進行皂化，顯示這些方法可能無 法對三酸甘油酯及固醇分離，因無法再改善故不再使用正己烷/乙醚的系統。
(二) C18 SPE
另參考 Toivo 等人方法加以修改 (Toivo et al., 1998)，使用 C18 材質的固相 萃取管 (tC18, 400mg, Waters)，測試最佳的系統為以甲醇活化固相萃取管，再以超 純水洗去甲醇，加入溶於丙酮的樣品液，依序以超純水、50%甲醇、80%甲醇及 10%
氯仿/甲醇溶液流洗，結果顯示 10%氯仿/甲醇層含有醣苷態、自由態、γ-oryzanol，
而酯化醣苷態並未完全洗出來。如再進一步流洗則會一同洗出大量的三酸甘油酯 造成分析上的干擾，因此放棄使用 C18 材質的固相萃取管。
(三) NH2 SPE
由於最常使用的 silica 及 C18 固相萃取管淨化樣品的效果皆不佳，查詢文獻
後發現 NH2固相萃取管被廣泛用於生物體脂質成分的分離，但並未搜尋到其使用
於分離植物固醇的文獻，故參考 Pinkart 等人分離微生物脂質的方式 (Pinkart et al., 1998) 及 Russo 等人分離動物油中膽固醇的方法 (Russo et al., 2005) 加以修改，以 正己烷活化 NH2管柱，加入溶於氯仿的糙米樣品液，以正己烷:乙酸乙酯 (95:5, v:v) 流洗洗去三酸甘油酯及酯化態固醇，再以氯仿流洗出自由態固醇及 γ-oryzanol，丙
酮流洗出酯化醣苷態固醇，甲醇流洗出醣苷態固醇。雖然氯仿層仍有少量三酸甘
油酯的存在，但在分析時間內仍可流洗出管柱，故不對分析造成干擾；而 NH2固
相萃取管另可以將脂肪酸酯化態固醇及三酸甘油酯分離開 (Pinkart et al., 1998)，但 在逆相層析實驗中並不分析酯化態固醇，故以正己烷:乙酸乙酯 (95:5, v:v) 將其一
併洗去。而在測試正相層析的層析條件時曾使用 NH2管柱分析固醇標準品，層析
圖如圖10 所示，cholesteryl palmitate (代表酯化態固醇) 於移動相為正己烷時洗出 管柱，tristearin (代表三酸甘油酯) 於梯度提升至約 25%異丙醇時才流洗出來，由 於將二者於從層析管柱上流洗出所需的移動相強度差異較大，推測即便使用分離 效果較差的固相萃取管柱也能達到分離，此一結果除了與文獻結果對照外，並可 作為將來分離酯化態固醇的參考。
圖10. 三酸甘油酯及固醇標準品於 NH2管柱的層析圖
Figure 10. HPLC-ELSD chromatogram of lipid standards using NH2 column (Spherecolon NH2, 250 × 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex) as stationary phase.
The gradient starts at 100% hexane at 0-5 minutes, and increases to 15/85, hexane/isopropanol at 25 minutes, flow rate is 1 mL/min
mv
minutes
0 5 10 15
0 50 100 150 200
Cholesteryl palmitate
Tristearin
β‐Sitosterol
三、植物固醇的定性
由於植物固醇種類繁多，商業上大多缺乏固醇的單一標準品可供使用，如本 實驗中所用的結合態植物固醇標準品皆為混合物。要針對樣品中含有的植物固醇 定性，除了在層析上將不同化合物分離開，更需依賴質譜所提供的離子訊號來得 到結構資訊。
(一) 不同型態植物固醇於 APCI 正電模式下的特徵離子訊號
預實驗時將自由態固醇標準品溶液直接注入質譜儀中，在電噴灑游離法正電 及負電模式下皆未觀察到有特徵離子產生，顯示自由態固醇無法以電噴灑游離方 式游離化。故本實驗選擇大氣壓力化學游離法作為游離源，於正電模式下可觀察 到固醇的訊號，負電模式下則連背景訊號都不穩定，故後續實驗皆以正電模式下 分析，表4 為以 LC-MS 分析固醇標準品及樣品後所得植物固醇的特徵離子訊號 及層析滯留時間。
將植物固醇標準品及樣品以 LC-MS 分析後發現，自由態、steryl ferulate、醣 苷態及酯化醣苷態固醇於 APCI 正電模式下的特徵離子皆以其固醇基團 (不含取 代基) 脫水後的離子 [M +H-H2O]+ 最高 (見表 4 及圖 11)，此結果與文獻的結果一 致 (Yamauchi et al., 2001; Rozenberg et al., 2003; Stöggl et al., 2005; Rudell et al., 2011)。而大多數固醇此特徵離子訊號落於 m/z 350-450 之間，故呈現層析質譜圖 時也選擇此 m/z 範圍產生萃取離子層析圖，較易觀察到固醇的波峰。自由態固醇 另有較弱的 [M +H-2H]+ 及 [M +H-4H]+ 的訊號，這二者分別代表固醇分子產生 脫氫 (dehydrogenation) 及環化 (cyclization) (Rozenberg et al., 2003)；本實驗中僅 ergosterol 產生較強的分子離子 (molecular ion) 訊號 (m/z 397, [M+H] +)，推測此差 異是因其結構上帶有共軛雙鍵而與其他固醇分子不同所產生。而在所用游離系統 下皆未觀察到固醇分子接上甲酸、鈉或鉀離子的加成訊號。
如圖12 所示，醣苷態固醇的次要離子訊號與自由態固醇相同，為其配醣基 (固 醇基團) 減去 2 及 4 個氫離子 ( [Aglycone +H-2H]+ 及 [Aglycone +H-4H]+)，推測 亦為固醇分子產生脫氫及環化。分子離子訊號與Yamauchi 等人的 [M+Na]‧+ (Yamauchi et al., 2001) 及 Rozenberg 等人的 [M+ H2O]‧+ (Rozenberg et al., 2003) 結果不同，本實驗中醣苷態固醇 [M+H] +的分子離子訊號強度極低，對溫度 (APCI
vaporizer temperature) 及電壓 (Source voltage) 進行調整未使訊號強度增加，使用 自動調機也無法使醣苷態分子離子訊號增強。由於醣苷態與自由態產生的離子訊 號種類相同，對醣苷態固醇定性除了比較其次要離子訊號的強度外亦須仰賴其與 自由態固醇的滯留時間差異來判斷。
Steryl ferulate 的質譜圖如圖13 所示，其次要離子訊號為與其分子量相近的一 連串訊號 (圖 14)，文獻中以 APCI 正電模式下分析 steryl ferulate 除了其固醇基 團脫水的訊號外並未產生分子離子訊號 (Fang et al., 2003; Stöggl et al., 2005)，目前 並無文獻可供比對，故暫時推測為 [M‧]+ 的訊號。表 4 中列出的 isomer-409 及 isomer-423 為其最強特徵離子訊號為 409 及 423，Stöggl 等人分析粗米糠油亦發現 γ-oryzanol 中的未知化合物也有 409 及 423 的訊號 (Stöggl et al., 2005)，由於二者 訊號分別與cycloartenyl ferulate 及 24-methylencycloartanyl ferulate 相同，以一次 質譜訊號僅能推測可能為已知化合物的類似物。
文獻中酯化醣苷態固醇的分子離子訊號有 [M + H2O]‧+ (Rozenberg et al., 2003) 及[M + Na]‧+ (Yamauchi et al., 2001)，在本實驗中產生的分子離子訊號有三種：
[M+H]+、[M +H-H2O]+ 及 [M + H2O]‧+ (見表 4 及圖 15)。經比較訊號強度後發現，
與飽和脂肪酸 (C16:0及C18:0) 酯化鍵結的酯化醣苷態固醇其分子離子訊號 [M +H-H2O]+ 強度最強，但產生的訊號多未及特徵離子訊號的 10%，而不飽和脂肪酸 (C18:1、C18:2及 C18:3) 鍵結的酯化醣苷態固醇則並不固定，但隨著結構中雙鍵的增 加分子離子訊號的訊號強度比例大部分皆有上升。推測結構中雙鍵增加可使分子 離子訊號增強，自由態固醇中具有三個雙鍵的 ergosterol 亦產生明顯的分子離子 訊號。
Table 4. Molecular mass, MS data and retention time (RT) for standard sterols and phytosterols found in samples, analysed by LC/APCI-MS Compound Molecular
mass Characteristic ions (intensity，%) RT (min)
Steryl glucoisdes [M+H]+ [Aglycone +H-2H]+ [Aglycone +H-4H]+ [Aglycone + H -H2O]+
Avenasterol glucoside 574 575 (1.3) 411 (9.2) 409 (33.8) 395 (100) 8.05
Campesteryl glucoside 562 563 (0.2) 399 (4.6) 397 (7.1) 383 (100) 8.88
Stigmasteryl glucoside 574 575 (0.7) 411 (7.9) 409 (10.5) 395 (100) 9.11
β-Sitosterol glucoside 576 577 (0.4) 413 (4.0) 411 (5.9) 397 (100) 9.83
Free sterols [M+H]+ [M +H-H2O]+ [M +H-2H]+ [M +H-4H]+
Ergosterol 396 397 (7.4) 379 (100) 395 (4.7) 393 (22.2) 11.52
Cholesterol 386 369 (100) 385 (23.0) 383 (23.0) 13.79
Avenasterol (Δ5+Δ7) 412 395 (100) 411 (15.0) 409 (16.5) 14.00
Campesterol 400 383 (100) 399 (22.0) 397 (22.2) 15.28
Stigmasterol 412 395 (100) 411 (22.0) 409 (21.5) 15.66
β-Sitosterol 414 397 (100) 413 (23.0) 411 (23.1) 17.15
Stigmastanol (sitostanol) 416 399 (100) 415 (0.8) 413 (9.1) 19.22
Steryl ferulates
[M]‧+ [M-Ferulate+ H -H2O]+Cycloartenyl ferulate 602.9 603 (4.9) 409 (100) 18.67
Cycloartenyl cis-ferulate (Isomer-409) 602.9 603 (1.9) 409 (100) 19.87
24-methylencycloartanyl ferulate 616.9 616 (2.8) 423 (100) 20.20
Stigmasteryl ferulate 588.9 588 (7.6) 395 (100) 21.01
24-methylencycloartanyl cis-ferulate (Isomer-423) 616.9 616 (0.5) 423 (100) 21.66
β-Sitosteryl ferulate 590.9 590 (4.4) 397 (100) 22.94
Cycloartanyl ferulate 604.9 604 (3.3) 411 (100) 23.18
Acylated steryl glucosides
[M+H]+ [M +H-H2O]+ [M + H2O]‧+ [M-Fatty acid-Glc+H -H2O]+Campesteryl (6’-O-linolenyl)- β-D-glucoside 834 835 (34.1) 817 (26.8) 852 (1.9) 395 (100) 34.18
Stigmasteryl (6’-O-linolenyl)- β-D-glucoside 822 823 (11.6) 806 (21.3) 840 (8.9) 383 (100) 34.56
Avenasteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 836 837 819 854 395 (100) 36.51
β-Sitosteryl (6’-O-linolenyl)- β-D-glucoside 836 837 (20.2) 819 (11.9) 854 (19.6) 397 (100) 36.62
Campesteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 824 825 (15.6) 807 (16.1) 842 (10.3) 383 (100) 39.29
Stigmasteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 836 837 (31.7) 819 (22.2) 854 (23.0) 395 (100) 39.72
β-Sitosteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 838 839 (16.3) 821 (12.0) 856 (13.0) 397 (100) 42.38
Avenasteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside 812 813 (5.4) 795 (8.1) 830 (6.2) 395 (100) 43.59
Avenasteryl (6’-O- oleyl)- β-D-glucoside 838 839 (2.1) 821 (1.4) 856 (1.9) 395 (100) 43.62
Campesteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside 800 801 (1.5) 783 (5.8) 818 (4.5) 383 (100) 46.15
Campesteryl (6’-O-oleyl)- β-D-glucoside 826 827 (6.7) 809 (8.7) 844 (4.8) 383 (100) 46.50
Stigmasteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside 812 813 (0.2) 795 (7.6) 830 (7.4) 395 (100) 46.53
Stigmasteryl (6’-O-oleyl)- β-D-glucoside 838 839 (8.4) 821 (10.9) 856 (10.8) 395 (100) 46.60
β-Sitosteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside 814 815 (1.3) 797 (4.1) 832 (5.0) 397 (100) 50.12
β-Sitosteryl (6’-O-oleyl)- β-D-glucoside 840 841 (5.6) 823 (6.6) 858 (4.3) 397 (100) 50.39
圖11. β-Sitosterol 標準品的質譜圖
Figure 11. Mass spectrum of β-sitosterol standard
圖12. β-Sitosteryl glucoside 標準品的質譜圖
Figure 12. Mass spectrum of β-sitosteryl glucoside standard
20120330-mix-STD-all #4351RT:17.15 AV:1 NL:1.22E5 F:ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00]
350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450
m/z
353.43 367.28 379.59 401.73 435.42439.55442.89448.99
20120330-mix-STD-all #2470-2491 RT:9.74-9.82 AV:11 NL:9.19E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00]
360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
m/z
377.38 425.58 440.52 453.74 541.52 559.42
366.58 470.73478.96 498.97 514.65523.54 575.88 593.88
圖13. 24-methylencycloartanyl ferulate 標準品的質譜圖
Figure 13. Mass spectrum of 24-methylencycloartanyl ferulate standard
圖14. 24-methylencycloartanyl ferulate 標準品的質譜圖 (m/z 600-630)
Figure 14. Mass spectrum (m/z 600-630) of 24-methylencycloartanyl ferulate standard
20120330-mix-STD-all #5114RT:20.20 AV:1 NL:1.06E5 F:ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00]
360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z
391.56 453.17 480.93 509.64 537.34
371.33 436.66 495.26 546.44 562.14 583.51 611.08 632.91 648.61
20120330-mix-STD-all #5114RT:20.20 AV:1 NL:4.27E3 F:ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00]
600 602 604 606 608 610 612 614 616 618 620 622 624 626 628 630
m/z
圖15. β-Sitosteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside 的質譜圖
Figure 15. Mass spectrum of β-sitosteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside (mixed standard)
(二) 植物固醇的二次質譜
針對植物固醇特徵離子施加能量撞擊分析可得到其二次質譜，有助於對化合 物的固醇基團進一步確認。圖16 為自由態固醇特徵離子 [M +H-H2O]+ 的二次質 譜圖，與文獻中的二次質譜比對極為相似 (Rozenberg et al., 2003; Igarashi et al., 2011)，分析樣品中含有的固醇 avenasterol 及 stigmasterol 的特徵離子皆為 m/z 395，雖然其流洗順序不同，但在分析其結合態時然仍造成定性上的困擾；而二者 的二次質譜具有差異，stigmasterol 的二次質譜中 m/z 297 的訊號較 avenasterol 強， 以此判定這 2 種化合物。但在分析樣品中 avenasterol 並非為單一化合物，
圖19 顯示 avenasterol 波峰由 2 波峰組成，比對文獻 (Rozenberg et al., 2003) 後推 測為 Δ5- 及 Δ7-avenasterol，其特徵離子訊號皆為 m/z 395，且二次質譜無明顯差 異(Rozenberg et al., 2003)，故難以質譜訊號分辨二者。結合態植物固醇特徵離子的 二次質譜與其固醇基團 (即自由態固醇) 相同，故不逐一列出。
圖17 為 steryl ferulates 中缺少其固醇基團標準品的化合物其特徵離子的二次 質譜，其中 cycloartenyl ferulate 與其質譜訊號相同的 isomer-409 的二次質譜相似；
24-methylencycloartanyl ferulate 及 isomer-423 亦同，推測其結構上的固醇基團相 似度極高；其餘 steryl ferulates 特徵離子的二次質譜與其自由態固醇相同。
20120330-mix-STD-all #10712-10730 RT:42.34-42.41AV:10 NL:7.38E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00]
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
m/z
425.27 687.48 839.74856.29
389.38
893.89 669.43
456.82 498.65 537.79 575.63594.50 651.51 719.59 751.23785.80803.71
圖16. 自由態固醇的二次質譜圖
Figure 16. APCI-MS/MS spectra of (A) ergosterol, (B) cholesterol, (C) avenasterol, (D) campesterol, (E) stigmasterol, (F) β-sitosterol, and (G) sitostanol
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
173.31 267.47 323.65 379.62
201.27
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
147.11 187.26201.28 241.33 269.37
135.25 313.45 339.40
121.21 353.43 367.40 377.52
20120417-mungbean-2-SIM #4202RT:18.67AV:1NL:1.07E3 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [100.00-400.00]
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
20120417-asukibean-3-SIM #4291RT:19.07AV:1NL:4.43E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [105.00-400.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
159.15173.24 283.49297.45
147.22 241.28 257.29 311.39
135.26 187.33 213.42229.38 325.57339.39
123.27 353.63 377.74
20120417-asukibean-3-SIM #4685RT:20.81AV:1NL:1.43E3 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [105.00-400.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
135.25 175.18 215.31 257.41 301.55
203.36 217.31 273.50
121.09 287.55 313.45 327.52
259.36 341.45 351.29 365.49 385.25
111.25
20120417-asukibean-3-SIM #5216RT:23.16AV:1NL:3.99E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [105.00-400.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
135.25 175.38 189.29203.25215.33229.27 261.34 287.36299.52 315.66
133.27 341.37
119.23 355.25 365.91 379.33
20120417-991-Taikeng9-2-SIM #5841RT:25.90AV:1NL:8.98E2 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [105.00-400.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
135.32149.19 177.31191.35 217.47231.25245.22 276.12 301.38311.53 339.17 367.37 392.20
123.27 209.38 268.32
圖17. Seryl ferulate 特徵離子的二次質譜圖 Figure 17. APCI-MS/MS spectra of (A) cycloartenyl ferulate, (B) isomer-409, (C) 24-methylencycloartanyl ferulate, (D) isomer-423, and (E) cycloartanyl ferulate
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
m/z
135.20 245.40 271.50 299.42 327.52 353.63
121.26 367.59 381.73
20120417-991-Taikeng9-2-SIM #5890RT:26.12AV:1NL:1.92E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [110.00-450.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
m/z
135.33 269.50 299.44 325.64 353.57 381.35
20120417-991-Taikeng9-2-SIM #5988RT:26.54AV:1NL:1.47E4 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [115.00-450.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
m/z
203.29 231.37245.31 271.44 299.41 177.24
163.25
149.14 297.46
135.18 189.20 257.47 313.37 339.52 367.52
133.32
381.48 395.30
20120417-991-Taikeng9-2-SIM #6408RT:28.38AV:1NL:3.86E3 F:ITMS + c APCI corona Full ms2 [email protected] [115.00-450.00]
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
m/z
177.29 245.37257.40 339.54 353.50
135.10 189.40 313.55 367.50
381.49
121.20 325.25
395.50
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
m/z
147.38 247.38 285.47299.34
123.05 271.43 309.67 334.30 355.80369.46
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
圖18. 植物固醇混合標準品的層析質譜圖
Figure 18. LC-MS chromatogram of mixed phytosterol standrads, base peak mode, m/z 350-450. 1: avenasteryl glucoside, 2: campesteryl glucoside, 3: stigmasteryl glucoside, 4. β-sitosteryl glucoside, 5. ergosterol, 6: cholesterol, 7: campesterol, 8: stigmasterol, 9: β-sitosterol, 10: cycloartenyl ferulate, 11: sitostanol, 12: isomer-409, 13:
24-methylencycloartanyl ferulate, 14: campesteryl ferulate, 15: stigmasteryl ferulate, 16: isomer-423, 17: β-sitosterol ferulate, 18: cycloartanyl ferulate, 19: β-sitosteryl (6’-O-linolenyl)- β-D-glucoside, 20: campesteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside, 21: stigmasteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside, 22: β-sitosteryl (6’-O-linoleoyl)- β-D-glucoside, 23: avenasteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside, 24: campesteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside, 25: stigmasteryl (6’-O-palmitoyl)- β-D-glucoside, 26:
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
350.00-450.00 F: ITMS + c APCI corona Full ms [200.00-1000.00] MS 20120330-mix-STD-all
(三) 植物固醇的層析流洗順序及綜合分析
針對樣品中的植物固醇進行定性除了質譜特徵離子訊號及二次質譜資訊外，
化合物的層析流洗順序 (滯留時間) 也為重要的依據。根據 Abidi 的整理，於逆
化合物的層析流洗順序 (滯留時間) 也為重要的依據。根據 Abidi 的整理，於逆