由於使用的萃取溶劑對固醇的溶解度會影響到萃取率，而不同的結合態固醇 其溶解度也不相同，挑選適合的萃取溶劑對於固醇分析為首要關鍵。因此 Heupel 認為在進行固醇的定量分析時，最主要的誤差可能來自於萃取步驟 (Heupel, 1989)。
固醇為低極性物質，一般被歸類於脂類化合物，文獻中可見使用正己烷 (Gunawan et al., 2006)、乙醚 (Rozenberg et al., 2003)、二氯甲烷 (Oliveira et al., 2008)、氯仿/
甲醇 (Miller and Engel, 2006)、丙酮 (Rudell et al., 2011)、甲醇 (Fang et al., 2003) 等有機溶劑或使用超臨界二氧化碳萃取 (supercritical carbon dioxide extraction) (Moreau et al., 1996) 進行固醇成分萃取。
研究顯示膽固醇於醇類中的溶解度從甲醇至正庚醇為止溶解度與醇類碳數成 正比 (Flynn et al., 1979)。Bar 等人測量 β-sitosterol 及膽固醇於高極性有機溶劑 中的溶解度依序為乙腈 < 甲醇 < 乙醇 < 丙酮 (Bar et al., 1984)；Wei 等人測量 β-sitosterol 於常用有機溶劑中的溶解度為甲醇 < 正己烷 < 乙醇 < 丙酮 < 乙酸
γ-Oryzanol 在丙酮、丁酮、乙酸乙酯及二氯甲烷中的溶解度高，異丙醇較低，
而正己烷的溶解度最低 (Kumar et al., 2009)。酯化態固醇如 cholesteryl acetate 的 溶解度為甲醇 < 乙醇 < 異丙醇 < 丙酮 (Bar et al., 1984)；β-sitosteryl maleate 及 stigmasteryl maleate 在乙酸乙酯中的溶解度高於丙酮 (Wang et al., 2007)。醣苷態 固醇於有機溶劑的溶解度並未搜尋到文獻可供參考。
使用Folch 法 (Folch et al., 1957)，以氯仿/甲醇 (2:1，v/v) 混和溶劑萃取包含 固醇的脂質為最常使用的萃取方式。文獻中提出在氯仿/甲醇萃取系統中如果樣品/
溶劑的比例 (solvent-to-tissue ratio) 太低時，可能會產生溶液分層，需要加入額外 的溶劑使溶液不分層，而樣品/溶劑的比例太高時，相對使水分的比例過低，會使 一些較高極性的固醇無法被完全萃取出來，如 di- 及 triglycosylsterols (Grunwald and Huang, 1989)。
二、化學及酵素水解
醣苷態固醇及酯化醣苷態固醇的醣苷鍵可藉由酸水解斷裂，SE、ASG 及 HSE 的酯鍵可由鹼水解 (皂化，saponification) 分離。由於常見檢測總固醇方式為將各 種結合態的固醇水解後再測量其自由態固醇 (包含原自由態固醇及結合態固醇水 解後釋出的自由態固醇) 的含量，這種分析方法須在萃取前或萃取後進行酸水解、
鹼皂化或是二者皆有 (Toivo et al., 2001) 以將結合態固醇水解。可根據樣品中結合 態固醇的含量決定採用何種水解方式，文獻中顯示精煉後的植物油中僅含有自由 態及酯化態 (脂肪酸) 固醇 (Kochhar, 1983)，即使植物油中原來含有醣苷態固醇 (SG 及 ASG)，在油脂精煉過程中也會被移除 (Toivo et al., 2001)，故僅使用鹼皂 化就足夠將所有的結合態固醇分解。
使用酸、鹼水解除了能水解結合態固醇，文獻提出部分固醇可能會卡在植物 的組織中而難以完全萃取出來，藉由酸、鹼水解後再進行萃取可將埋藏在植物組
在溶劑萃取前將樣品以鹽酸水解，比照直接鹼皂化的組別其自由態固醇含量多出 9 ~ 42%，顯示酸水解已將醣苷態固醇水解產生自由態固醇 (Toivo et al., 2001)。而 使用鹼水解可將與固醇一併萃取出的脂質 (如三酸甘油酯及磷脂質等) 分解，避免 後續分析時受到干擾。
但酸、鹼水解亦有缺點，Biedermann 等人的研究顯示，將 latosterol (Δ7- cholesterol) 於 80℃ 鹽酸/甲醇溶液中反應，結果顯示 Δ7-固醇比例隨著反應時間 增加逐漸降低，Δ8(14)- 及 Δ7-固醇的比例逐漸增加，表示在酸水解條件下
latosterol 產生異構化 (Biedermann et al., 1996)。Kesselmeier 等人的實驗指出 Δ5- 及 Δ7-avenasterols 會在酸水解的過程中降解 (Kesselmeier et al., 1985)；Kamal- Eldin 等人 (Kamal-Eldin et al., 1998) 將 fucosterol 鹽酸水解後以 GC-MS 分析產 物，圖譜上出現 fucosterol、Δ5-avenasterol 及其他 3 根波峰，作者推論產生異構化 的機制為在酸水解條件下固醇支鏈上具有 ethylene 基團的固醇該處的雙鍵會因可 能產生碳陽離子 (carbonium ion) 而不穩定，產生碳陽離子後會再脫去一氫質子轉 變成另一高度穩定的烯類，同時產生異構化 (圖 7)，由於三級碳陽離子較二級碳陽 離子穩定，因此在 GC-MS 圖譜上顯示異構物 a、b 及 c 的波峰面積均較 Δ5- avenasterol 高。
以上文獻顯示，結構為 Δ7 及支鏈上具有 ethylene 基團的固醇在酸水解的環 境下不穩定，短時間反應即產生異構化；另外 ergosterol 則會在酸水解下降解 (戴，
2012)。因此在分析含有這些固醇結構的植物或產品時使用酸水解可能會低估這類 結構固醇的含量。
目前並無文獻指出固醇在鹼皂化環境下會產生異構化，但 Oliveira 等人的研 究指出，將富含酯化態固醇的香蕉皮萃取物以氫氧化鉀水解後，4-dimethyl 及 4-monomethylsterol esters 其對應的自由態固醇及脂肪酸並未如預期增加，顯示這 種結構的酯化態固醇具有抗鹼水解的特性，如 cycloeucalenol、cycloartenol 及 24-methylenecycloartanol (Oliveira et al., 2008)。另有文獻指出，在製作紙漿的 kraft
pulping (kraft process) 步驟，4-dimethyl 及 4-monomethylsterol esters 與其他結構的 酯化態固醇相比能抵抗過程中的鹼水解，在水解後仍能存在。(Tenkanen et al., 2003)。
由於部分醣苷態固醇的酸不穩定性，Kesselmeier 等人使用 β-glucosidase 來 水解醣苷態固醇 (Kesselmeier et al., 1985)。並有研究使用酵素取代化學水解結合態 固醇，如使用不同種類的脂酶 (lipase) 水解酯化態固醇並可能同時水解三酸甘油 酯 (Fischer and Holl, 1990; Tenkanen et al., 2003)；Nyström 等人以不同來源的 β-glucosidase 及 steryl esterase 分別水解醣苷態 (SG, ASG) 及 steryl ferulates (Nyström et al., 2008)。但使用酵素水解也有缺點，如結合態固醇於酵素溶液中的溶 解度 (Kesselmeier et al., 1985)、酵素專一性 (Kesselmeier et al., 1985)、酵素水解速 率較慢及反應時間過長等問題，可能因上述缺陷使得使用酵素水解結合態固醇的 研究並不多。
圖7. Fucosterol 及 Δ5-avenasterol 經由酸催化產生異構化的可能機制
Figure 7. Representation of the hypothetical acid-catalyzed isomerization of fucosterol and Δ5-avenasterol (Kamal-Eldin et al., 1998)
三、固醇分離
在分析固醇前通常需要樣品前處理以將欲分析的固醇成分和其他非固醇物質 分離，達到淨化樣品並濃縮 (enrichment) 樣品中的固醇成分。使用製備型薄層層 析法 (thin-layer chromatography, TLC) 可快速分離不同的結合態固醇並針對化合 物定性 (Yamauchi et al., 2001; Caboni et al., 2005)，亦可見使用管柱層析 (column chromatography, CC) (Whitaker, 1988)、製備型高效液相層析管柱 (preparative preparative high performance liquid chromatography) (Xu and Godber, 1999) 區分化 合物；由於方便、快速及節省溶劑等優點，近年來研究多使用固相萃取法 (solid phase extraction, SPE) 進行固醇分離，表 1 為對文獻中使用正相固相萃取管進行不 同植物固醇結合態分離的方法整理。
Table 1. Separation of sterol conjugates by normal phase SPE cartridges Cartridge
type Condition
solvent Sample
solvent Elution solvent (ratio, v:v) Saponification1 References
SE FS HSE ASG SG
20:80 Hex/DEE/EtOH
25:25:50 - - - Y (Phillips et al., -: Not mentioned in the paper.
SE: steryl ester, FS: free sterol, HSE: Hydroxycinnamic acid steryl ester, ASG: acylated steryl glycoside, SG: steryl glycoside.
CHCl3: chloroform, DEE: diethyl ether, EA: ethyl acetate, EtOH: ethanol, Hep: 1-heptane, Hex: hexane, Me2CO: acetone, MeOH: methanol.
1: SE and FS fractions were saponified after SPE. 2: HSE fraction was further purified using an acid–base wash. 3: Sterols were directly infused into the Q-TOF
由於固醇的低極性，文獻中幾乎都以正相固相萃取管 (如 silica 及 alumina) 分離不同型態的植物固醇。藉由不同結合態固醇極性的差異，酯化態、自由態及 醣苷態固醇可在正相固相萃取管上分離。Cunha 等人比較 silica 及 alumina 正相 固相萃取匣分離酯化態及自由態植物固醇能力，結果顯示回收率部分二者並無差 異，但 alumina 固相萃取匣再現性較差，可能因該種材質較易受到濕氣影響，故 最後作者採用 silica 固相萃取匣進行實驗 (Cunha et al., 2006)。
Lechner 等人在固相萃取前先將樣品衍生化，固醇結構上未鍵結的羥基處成為
三甲基矽醚而大幅降低其極性，再使用 silica 固相萃取匣將衍生化後的自由態及 酯化態固醇與相較極性稍高的三酸甘油酯分離，隨即以氣相層析分析 (Lechner et al., 1999)。
四、固醇分析與檢測
(一) 氣相層析法 (Gas chromatography, GC)
氣相層析法是最常用來分析固醇的方式 (Abidi, 2001)，在分析前樣品通常需 經過衍生化 (derivatization) 使分析物質能夠揮發，並提高解析度，目前常見以 TMS (trimethylsilyl) 進行衍生化，雖然文獻中也可見不衍生化直接分析的方式。氣 相層析法偵測方式主要為火焰離子偵測器 (Flame ionization detector, FID) 及質譜，
火焰離子偵測器僅能以波峰的滯留時間為定性的依據，而使用質譜可知該波峰的 離子片段而得到更多的結構資訊。
氣相層析法對個別固醇分子的分離效果佳，且固醇質譜離子片段具有較多的 文獻可供比對。但氣相層析法的缺點在於衍生化過程耗時，且可能產生副產物 (Rozenberg et al., 2003)，如在固醇醣基上衍生化不完全產生波峰變寬或重疊現象 (Pieber et al., 2010)；而酯化態、衍生化後的醣苷態 (SG 及 ASG) 固醇的沸點太高，
使用氣相層析法分析需要較高溫的分析條件而造成限制 (Caboni et al., 2005;
Pieber et al., 2010)。
(二) 高效液相層析法 (High performance liquid chromatography, HPLC)
相較於氣相層析法，液相層析法所用的分析條件較溫和，且為非破壞性的偵 測方式，故適用於分析熱敏感的固醇 (Abidi, 2001)。
1. 正相液相層析法 (normal phase liquid chromatography, NPLC)
正相液相層析可用於分離不同種類的結合態固醇，萃取物通常不經鹼皂化及 其他前處理，過濾後直接進行分析 (Moreau et al., 1990; Conforti et al., 1993;
Christie and Urwin, 1995)；正相層析法的優點為利用梯度層析可同步分析不同種類 脂質 (lipid class, 包含植物固醇)，但由於移動相通常由低極性轉換到高極性，要 找到適合的分析條件較為困難。正相層析較無法分離極性相近的個別固醇分子，
並有管柱平衡時間長及移動相揮發性高等缺點 (Abidi, 2001)。表 2 為對使用正相 液相層析法分析植物固醇的方法整理。
2. 逆相液相層析法 (reverse-phase LC, RPLC)
由於多數固醇物質的極性較低，使用逆相液相層析分析需要使用高比例有機 溶劑或不含水 (non-aqueous) 的移動相以避免分析物殘留於管柱中 (Abidi, 2001;
Lagarda et al., 2006)。移動相常使用甲醇、乙腈、異丙醇及四氫呋喃 (tetrahydrofuran) 等溶劑；文獻中多使用 C18 管柱，此外也可見 C8 (Yu et al., 2007)、C30 (Stöggl et al., 2005)及 Phenyl-hexyl (Mezine et al., 2003) 等管柱材質。表 3 為使用逆相液相層 析法分析植物固醇的方法整理。
3. 偵測器
由於除了具有共軛雙鍵的固醇 (如 7-dehydrocholesterol 和 ergosterol) 及 HSE 態的固醇分別在約 280 及 325 nm 有 UV 吸收外，其餘大多數自由態及結合 態固醇並無特殊吸收波長，故使用紫外光檢測器 (UV detector) 時必須在 200-210 nm 低波長下進行偵測，但會面臨使用梯度沖提時移動相 (如甲醇及異丙醇) 的 UV 界限波長 (cut-off) 干擾。
蒸發光散射檢測器 (evaporative light scattering detector, ELSD) 的原理為從管 柱流出的移動相溶劑進入霧化器 (nebulizer) 後與霧化氣體 (氮氣或空氣) 混合產 生氣膠 (aerosol)；氣膠為混合均勻的液滴，進入漂移管 (drift tube) 後其中的揮發 性成分如移動相經加熱蒸發，無法揮發的待測物質形成顆粒；懸浮於蒸氣中的顆 粒通過光檢測區時經雷射光照射產生散射，被散射的光子根據一固定的入射角度 由光二極體 (photodiode) 或光電倍增管 (photomultiplier tube) 偵測 (Young and Dolan, 2003)。
蒸發光散射檢測器的優點為除了高揮發性物質，其能偵測到大部分的化合物；
蒸發光散射檢測器的優點為除了高揮發性物質，其能偵測到大部分的化合物；