第三章 材料與方法
第二節 實驗方法與步驟
Part A 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素抗肺纖維化作用 及分子機轉探討
一、 活體動物模式藥效測定 1. 建立小鼠肺纖維化模式
小鼠以乙醚麻醉後，以 5 mg/kg 單一劑量氣管注入溶於 200 μl 注射用 生理食鹽水的 bleomycin，對照組注入等量的注射用生理食鹽水(NS)。木犀 草素以 1 mg/ml 濃度溶於 50 % ethanol，餵食劑量為 10 mg/kg。
2. 實驗設計與分組
2.1 木犀草素抗發炎作用之評估
除對照組 (NS) 外，bleomycin 造模小鼠採隨機分組，分成 bleomycin (BLM) 組、木犀草素治療組 (Lut) 及類固醇治療組 (Pred) 共四組，每組 10 隻小鼠。木犀草素治療組於造模後隔天每日以胃管餵食 10 mg/kg 木犀草 素， 類固醇治療組於造模後隔天每日以胃管餵食 10 mg/kg prednisolone。
小鼠在餵食藥物後第 7天及第 14天以二氧化碳犧牲，剖胸取肺臟，從氣管 注入 1 ml 福馬林固定組織，包埋，切片，脫蠟，hematoxylin & eosin (H&E) 染色，觀察組織病理變化。另外一批同樣分組的小鼠在餵食藥物後第7天及 第14天以二氧化碳犧牲，取肺灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，
小鼠剖胸取肺臟，從氣管注入 1 ml 生理食鹽水 (4℃) ，稍加按摩後回吸，
重複灌洗四次，約可收集 3 ml 的 BALF，4℃ 離心後收集上清液於 -70
℃貯存，待測 BALF 中 cytokines 含量； 離心後之下層細胞以 1 ml NS
色，顯微鏡下作細胞計數以觀察不同時期發炎細胞比例之變化 (differential cell counts)。上清液以免疫酵素聯結法 (ELISA) 測定 TNF-α 和 IL-6 活 性。
2.2 肺纖維化的時程變化及實驗設計
2.2.1 肺纖維化的時程變化 (Time course of bleomycin-induced lung fibrosis) 為了確認 bleomycin 造模小鼠肺纖維化的病理變化時程，於造模後第 0, 3, 7, 10, 14, 21 天分別取各 3 隻 bleomycin 造模小鼠作病理切片，以 Masson’s Trichrome 染色，觀察肺組織病理變化及膠原沉積產生的時間。
2.2.2 早期治療 (Early treatment)
除對照組 (NS) 外，bleomycin 造模小鼠採隨機分組，分成 bleomycin (BLM) 組、木犀草素治療組 (Lut) 及類固醇治療組 (Pred) 共四組，每組 10 隻小鼠。木犀草素治療組於造模後隔天每日以胃管餵食 10 mg/kg 木犀草 素， 類固醇治療組於造模後隔天每日以胃管餵食 10 mg/kg prednisolone。
小鼠在餵食藥物後第 14 天及第 21天犧牲，剖胸取肺臟，從氣管注入 1 ml 福馬林固定組織，包埋，切片，脫蠟，H&E 和 Masson Trichrome (MT)染 色，觀察組織病理變化。另外一批同樣分組的小鼠犧牲後，剖胸取左側肺 葉作膠原含量分析；右側肺葉抽取 RNA 作 RT-PCR分析。
2.2.3 後期治療 (Delayed treatment)
另外一批同樣分組的小鼠在於 BLM 造模後第 10 天才開始餵食藥
物，木犀草素治療組於造模後造模後第 10 天每日以胃管餵食 10 mg/kg 木 犀草素，類固醇治療組於造模後造模後第 10 天每日以胃管餵食 10 mg/kg prednisolone。小鼠在餵食藥物後第 14 天及第 21 天犧牲，其餘實驗步驟 同上。
3.以組織病理切片的結果評估藥物的療效
肺組織以 10% formalin 溶液固定 24 小時， 每個檢體均取相同的肺葉 並修片，石蠟包埋, 以 4 μm 厚度作連續切片, 待玻片乾後以 H&E 或 MT 染色，光學顯微鏡下觀察肺組織纖維化的程度。組織纖維化程度之判定參 考 Tanino 及 Ashcroft 等人的方法並稍作修改(187, 188)，將纖維化程度輕重分 為0 到 8 級：grade 0-正常肺組織；grade 1-肺泡壁或細支氣管輕微增厚; grade 3-中度肺泡壁增厚但無明顯結構上的破壞; grade 5-明顯的膠原蛋白增生並 破壞肺泡結構，膠原纖維集結成束; grade7-肺泡結構嚴重破壞，大面積的膠 原纖維分布; grade8-膠原纖維充滿全部視野。 在 20x 物鏡下，每片檢體隨 機選取 20 個視野計分，合併 20 個視野的分數並作統計分析。
4. 膠原蛋白含量測定
肺組織纖維化程度亦可以 Sircol Collagen Assay 偵測 collagen 含量 作為評估項目。Sircol Collagen reagent 含有 Sirius Red (in picric acid) 會與
檢體中 type I-V collagens產生鍵結態的紅色沉澱物。方法如下：小鼠左側 肺組織稱重後剪碎與溶於 0.5 M acetic acid/500 μl的 pepsin (EC 3.4.23.1；
1:10 ratio of pepsin: tissue wet weight) 室溫下作用 over night， 每管檢體加 入 1.0 ml Sircol dye reagent， 蓋緊上蓋後混合均勻，室溫下反應 30 分鐘，
另以 1 mg/ml Collagen acid soluble type I standard 溶於 0.5 M acetic acid 製 備標準濃度之溶液。檢體與標準溶液離心後去除上清液，沉澱物以 100 μl Sircol alkali reagent 回溶，取 200 μl 於 96 孔盤，在 560 nm 波長下測吸 光值並以標準曲線及組織實重換算每毫克肺組織之膠原蛋白含量 (μg/mg of lung tissue)。
5. 反轉録聚合酶鏈反應 (Real-time RT-PCR) 5.1 RNA extraction
小鼠右側肺組織置於滅菌過硏缽中邊加入液態氮邊磨碎，加入 2 ml Trisolution Reagent Plus 與組織充分混合後取出置於無菌試管中反應 5 分 鐘，加入0.5 ml chloroform 室溫下作用 15 分鐘，之後在 4℃下以 12000 rpm 離心 15 分鐘，取約 0.5 至 0.6 ml 的上層液加入含 0.5 ml isopropanol 的 eppendorff 沉澱作用 10 分鐘後，再 4℃下以 12000 rpm 離心 10 分鐘，離 心後吸去上層液體， 以 75％ ethanol 清洗，最後在 4℃下以 12000 rpm 離 心 5 分鐘，吸去上層液體後風乾，待 pellet 成透明狀後加入 30-50 μl 的 ddH2O 置於 4℃冰箱隔夜儲存。 Muose TGF-β1 primer (524 bp)序列如下：
Foward 5-TGGACCGCAACAACGCCATCTATGAGAAAACC-3 ， Reverse 5-TGGA GCTGAAGCAATAGTTGGTATCCAGGGCT-3。
5.2 反轉錄反應 (Reverse transcription)
RNA 以 ddH2O (2 : 98)作50 倍稀釋後，從波長 260 nm 的吸收值換算
和 20 μM Oligo (dT) primer 0.5 μl，以 ddH2O 調整體積至 13.5 μl 後，於 85℃下 denature 15 分鐘，之後加入 4 μl 的 5 倍 reaction buffer (250 mM Tris-HCl pH 8.3、375 mM KCl、15 mM MgCl2)、1 μl 的 10 mM dNTP mix、
0.5 μl Recombinant RNase inhibitor (40 units/μl) 、 1 μl 的 MMLV Reversetranscriptase (200 units/μl) 於 42℃下 extension 1 小時，94℃下作用 5 分鐘，加入 30 μl ddH2O 稀釋成 2 倍 cDNA，置於 -20℃ 下儲存。
5.3 聚合酶鏈反應 ( Polymerase chain elongation reaction)
取 1.5 μl 的 2X cDNA、2 μl 50% glycerol、1 μl 10 X PCR reaction buffer、0.25 μl dNTP mix (10 mM/μl；0.25 mM/reaction)、0.3 μl DNA polymerase (5 units/μl；0.2 units/reaction)、20 μM primer (forward& reverse primer各 0.5 μl)，最後以 ddH2O 調整體積至 10 μl 後，以 Bio-Rad PCR mach ine 作聚合酶鏈反應(反應條件: 95℃/4分鐘→ 95 ℃/ 45 秒 25 cycle、
60℃/1分鐘、72℃/2分鐘) → 72℃/ 7 分鐘→ 4℃ 保存)。
5.4 DNA 電泳膠實驗
利用微波爐加熱含有 2 % agarose 的 TBE buffer，待稍微冷卻後，加 入 5 μl/100 ml 比例的 ethidium bromide (10 mg/ml)，混合均勻後倒入水平 電泳凝膠模型中，盡量避免氣泡的產生，凝固後，置於 4℃ 冰箱冷藏一下 或放置隔夜， 倒入 0.5 倍的 TBE buffer 於電泳槽中，並使 buffer 液面稍 為高於膠面。將 PCR 產物與 6 倍 DNA gel-loading dye 混和均勻之後，
注入 agarose gel 的凹槽中。利用 50 伏特的電壓進行 DNA 電泳，分離 後，再以 EverGene 數位影像擷取系統(gel analysis system)分析。實驗試劑:
5 倍 TBE buffer : Tris 54g, Boric acid 27.5 g, 0.5 M EDTA /pH 8.020 ml，以 ddH2O 調整體積至 1L。6倍 DNA gel-loading dye: 0.125 g Bromophenol
二、 離體細胞模式分子機轉探討
1. 木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞增生及分化 1.1 小鼠肺纖維母細胞之分離及培養
本實驗每次取 8 隻 8-10 週齡之 C57BL/6J 成鼠，犧牲後取出肺臟，
之後步驟均於無菌操作台操作。以 1 ml無菌 HBSS 溶液沖洗肺臟3次，剪 碎肺葉，以 collagenase (1 mg/ml) 和 0.25% trypsin (in 1 mM EDTA) 37℃
攪拌作用6分鐘，以 22-μm nylon mesh 過濾並加入 DNAase，濾液加入等 體積含血清培養液終止酵素作用，網篩上殘餘組織重複上述消化步驟，合 併所有濾液以 300 x g 離心 5 分鐘，細胞沉澱以 9/10 體積的 ddH2O 溶 解紅血球隨即以 1/10 體積 10x HBSS 恢復等張，離心 5 分鐘，細胞沉澱 以 10 ml 培養液打散，培養於 10 cm dish。培養液為 DMEM 10% FCS, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamine, 100 μM non-essential amino acid (NEAA), 20 μΜ HEPES buffer (pH 7.3), 1.5 % Fungizone。每 2 天換一 次培養液，約 10 天左右肺纖維母細胞長滿培養盤即可以 trypsin 打下進行 繼代分盤，之後每 2 天繼代一次，至第 5 代即為可進行實驗之純化肺纖 維母細胞。以 α-smooth muscle actin 染色確認肺纖維母細胞純度為 95%以 上。進行 cell proliferation 和 TGF-β1-induced myofibroblastic differentiation 實驗時細胞以不含 FCS 的 DMEM 培養。
1.2 木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞增生
以不同濃度木犀草素 (10, 25, 50 μM; DMSO:EOH=1:1) 處理肺纖維母 細胞，分別於 24, 48, 72 小時以 Trypsin 染色法計數細胞並作出生長曲線 圖。
1.3 免疫螢光染色 (Immunofluorescence imaging)
肺纖維母細胞以 3 X 104 cell/well 種於置有圓蓋玻片之 12 孔盤中，以 木犀草素 (25 μM) 前處理 30 分鐘後，以 TGF-β1 (5 ng/ml) 處理不同組別 的細胞，72 小時後取出玻片進行細胞免疫螢光染色。將種有細胞之玻片取 出置於新的 12 孔盤中，PBS 清洗 10 分鐘 3 次，以 2 % paraformaldehyde 固定 30 分鐘，PBS 清洗 10 分鐘 3 次，加入 0.1% Triton X-100/in PBS 作用 20 分鐘，使細胞膜產生孔隙得以讓染劑進入，細胞在室溫下使用 5%
bovine serum albumin /PBS 作用 60 分鐘，以 mouse anti-α-SMA (1:100) antibody 4℃ 作 用 24 小 時 ， PBS 清 洗 10 分 鐘 3 次 ， 接 著 以 FITC- conjugated goat anti-mouse IgG antibody (1:200) 37 °C用 1 小時，PBS 清洗 5 分鐘 3 次。 待乾後覆蓋於載玻片上以 Vectashield /Tris buffer (pH 8.4) 封片。使用 Leica laser scanning confocal 顯微鏡照相記錄。
1.4 木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞分化及分泌 ECM
細胞以木犀草素 (25 μM) 前處理 30 分鐘後，以 TGF-β1 (5 ng/ml) 處 理不同組別的細胞，72 小時後收取細胞蛋白以西方點墨法分析 α-SMA, vimentin 和 collagen 表現量。
1.5 蛋白質之定性及定量分析 (Western blot analysis) 蛋白質的萃取 (Protein Extraction)
不同時間點收集經藥物處理或未經處理之細胞，在 4℃ 以 1600 rpm 離心 5 分鐘，並用冰的 PBS 將細胞清洗一次後，於 4℃下再離心 5 分 鐘，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，將細胞 pellet 均勻打散，加入 適量的 RIPA buffer 【50 mM Tris (pH 7.4) , 150 mM NaCl , 1% Triton X-100 ,
μg/ml Leupeptin , 0.2 mM PMSF, 5 μg/ml Aprotinin , 1 mM Na Vanadate , 1 mM NaF】，置於冰上作用 20 分鐘，4℃下將細胞液以 55000 rpm 超高速 離心 30 分鐘，收集上清液，以一系列已知濃度的 BSA 做成之 standard curve 換算蛋白質濃度 (μg/μl)。將蛋白質分裝並用 RIPA buffer 調整成相 同體積，接著再加入 1/3 量的 4 倍 protein loading dye (8 % SDS, 0.04 % serva blue R-250, 40% glycerol, 200 mM Tris pH6.8, 10%
2-mercaptoethanol)，以 95℃ 乾浴加熱變性 10 分鐘後，即可置於 -80℃中 保存。
聚丙烯醯胺膠體電泳法 (SDS-PAGE Assay)
利用 SDS-PAGE 將蛋白質依分子量大小予以分離。首先配置 1.5 mm 厚的 discontinuous acrylamide gel，下層 separating gel 其 acrylamide 的百 分 比 ， 視 分 析 蛋 白 質 分 子 量 而 定 ， 上 層 的 stacking gel 則 含 有 4 % acrylamide。配置完成的膠體放至於電泳槽內，加入電泳緩衝液(runnung buffer : 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1 % SDS)。接著將萃取出的蛋白質 sample 及標示標準分子量的 Multimaker 依序注入膠體的孔槽中， 通以電 壓 80 伏特，待樣品通過 stacking gel 後電壓調整為 100 伏特，視其分子 量大小斟酌電泳時間。
西方點墨法 (Western blot)
將 PVDF membrane 浸於 methanol 數秒後以 Milli-Q water 浸濕，接 著將裁好的濾紙與 PVDF membrane 先浸泡在 transfer buffer (25 mM Tris , 192 mM glycine)中。取出電泳膠以濕式轉漬器轉漬至 PVDF membrane，於 4℃通以 100 Voltage電 壓 1小時。將 membrane 取出，浸泡於 5% non-fat milk /TBST中，於室溫下搖晃一小時。以 TBST buffer (24 .22 g Tris , 87.75 g NaCl , 10 ml Tween20，加水調到1 L) 清洗 membrane 10 分鐘 3次，加入一
級抗體於 4 ℃下作用 over night。隔日先以 TBST buffer 清洗 membrane 10 分鐘 3 次，加入二級抗體，使其在室溫下搖晃作用 1 小時之後，再用 TBST buffer 清洗10 分鐘 3 次， 接著在暗房中將membrane 與 ECL (Enhance chemi-luminescence) 反應後，裝於透明塑膠袋內並置於壓片夾 中，以 X-ray film 感光顯影，再以自動沖片機沖片。
1.6 木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞之 TGF-β1 /Smads 訊息傳遞
細胞以木犀草素 (25 μM) 和 TGF-β1 inhibitor (SB431542, 10 μM) 前 處理 30分鐘後，以 TGF-β1 (5 ng/ml) 處理不同組別的細胞，30分鐘後收取 細胞蛋白以西方點墨法分析 p-Smad3, Smad3 和 Smad4 的表現量。
2. 木犀草素抑制肺上皮細胞株 A549 進行 EMT
A549 cells (human lung carcinoma-derived alveolar epithelial cell line;
ATCC, CCL-185)培養於 5 % FCS RPMI 和100 U/ml penicillin/streptomycin。
當細胞長至八分滿時換成 0.1% FCS medium (starved for 24 hours)，以木犀
當細胞長至八分滿時換成 0.1% FCS medium (starved for 24 hours)，以木犀