Summary of the key pathogenetic mechanisms of fibroblast and

六、胞外間質蛋白與損傷修復

肺組織的 extracellular matrix (ECM) 由 collagen (尤其是 types I, III), elastin, proteoglycan, fibronectin 及少量其它蛋白所組成。肺損傷會破壞 ECM 結構，之後的修復與重建 (repair and remodeling) 工作極為重要，包 括巨噬細胞、肺泡和支氣管上皮細胞、內皮細胞和纖維母細胞都能製造 ECM components。為了填補損傷造成的空洞，AEC 快速的增生或分化並重 新分布到裸露的區域形成新的障壁；同時也經由活化 anti-fibrinolysis 系統 促進血塊形成。在正常的情況下，fibrinolytic 系統也會同時啟動以形成細 胞爬行的通道。在肺纖維化時，AEC 高度表現 potent procoagulant factor 和 plasminogen activator inhibitor (PAI-1, PAI-2)，將不利於細胞的爬行及修 補功能，不正常的組織修復會使傷口結痂及纖維化。此外，發炎細胞分泌 的發炎激素、 chemokines、生長激素和間質分解蛋白酶 (例如 MMPs) 會 促使纖維細胞聚集、增生和分化。 AEC 和肌纖維母細胞分泌的 MMP-2 和 MMP-9 (gelatinase A 和 B) 會加劇基底膜 (尤其是 type IV collagen) 的破 壞，有利於 fibroblast/肌纖維母細胞 爬行、增生和新產生的 ECM 堆積⁽⁹⁵⁾。 在 IPF 病人肺組織可觀察到分布在基底膜損傷區域的肌纖維母細胞 有高 度的 MMP-2 和 MMP-9 表現。不正常的組織修復造成纖維化也代表正常 肺組織的功能被這些沒有功能的結締組織取代。

基質金屬蛋白酶 Matrix Metalloproteinases (MMPs；zinc dependent matrix degrading proteinases) 為分解 ECM 的一群具有共同基本型態的蛋白 水解酶，在人類 MMPs family共有 23 個成員，MMPs 可根據其結構及受 質類型被分類。最重要的一類包括: collagenases, gelatinases, stromelysin, matrilysin 和 membrane-anchored MMP [membrane- type (MT)-MMP] ⁽⁹⁶⁾。 MMPs 會以 inactive proenzymes 被分泌，到了細胞外再被切成活性片

斷，細胞也會分泌 TIMPs1-4 抑制 MMPs 的活性，換言之 MMPs 的活性 被 TIMPs 精密地監控著，以維持正常組織的恆定狀態⁽⁹⁷⁾。包括 neutrophils, AMs, AEC 和 肌纖維母細胞 在內的許多細胞分泌不同功能的 MMPs /TIMPs 到細胞外，與 ECM, integrins, growth factors 和 parenchymal cells 密切的合作以維持正常狀態的肺組織結構與功能。肺在急性或慢性發炎發 生後，MMPs 的表現增加對修復期的再上皮化(re-epithelialization)來說非常 重要。最近的研究發現，在 IPF 病人肺組織 TIMPs 表現高於 MMPs，這 使肺組織處於非分解性膠原纖維的微環境。此外， TGF-β 會透過抑制纖維 母細胞的 MMP-1/ MMP-2、增加 TIMP 的合成與分泌以減少膠原纖維的分 解，所以 MMPs /TIMPs 的調控失衡也是造成組織纖維化的原因之一^{(96, 98)}。 七、TGF-β1 與肺纖維化

1. TGF-β 結構及活化的調控

乙型轉型生長因子(TGF-β) 是一群多功能的細胞激素，至今以有超過40 個家族成員被發現^{(99, 100)}，TGF-β superfamily 分為三大類：TGF-β family, bone morphogenetic protein (BMP) family和activin family，它們具有共同的結 構、類似的訊息傳遞路徑和重疊的生物活性。在哺乳類生物有三種已知的 TGF-β isoforms (TGF-β1-3)被確認，其中TGF-β1與肺纖維化的關係最為密 切。TGF-β1與 latent TGF-β binding proteins (LTBPs)結合成 latent precursors complex 分泌⁽¹⁰¹⁾，與 latency-associated protein (LAP)形成大複合物結合於

胞外基質⁽¹⁰²⁾ (附圖7)，經過活化的 TGF-β1才能產生生理活性。 在體外，

latent formTGF-β1 可經加熱酸化處理而被活化；在生物體中至少有三條活 化路徑：(1)主要的活化路徑，是透過與 epithelial cell integrin αvβ6 結合造 成 結 構 變 化 而 產 生 活 化 態 的 TGF-β1 ， 作 用 於 鄰 近 細 胞 的 TGF-β1 receptors，(附圖8) (2) 與 matrix protein thrombospondin-1 (TSP-1) 結合，(3)

被蛋白酶 (plasmin, MMP2, MMP9, elastase, or cathepsins) 分解成活化態 TGF-β1 (附圖9)^(103-105)。TGF-β1 分泌及作用的調節不僅取決於轉錄、轉譯、

分泌和活化等環節，還受 TGF-β1 接受體的數量及其他細胞激素的相互作 用等複雜因素影響。

TGF-β1 能發揮各種調節功能有賴於其在細胞膜表面的專一性受體，至 今已發現三種與 TGF-β1具高親和性的受體：TβRI、TβRII 和 TβRIII，

TGF-β1 必需同時與 TβRI 和 TβRII 結合才能將訊息往下傳遞。TβRI 和 TβRII 均為穿膜的 serine/threonine kinase receptor ，TβRI 又稱為活化素受 體激酶 (avtivin receptor like kinases, ALKs) (附圖10)，其位在細胞質內近膜 區的 serine/threonine kinase domain 能被 TβRII 磷酸化，TβRII 則具有自 我磷酸化的功能。當活化態的 TGF-β1 與標的細胞膜上的 TβRII 結合使其 自我磷酸化，接著靠近並活化相鄰的 TβRI。被活化的 receptor complex接 著將下游的receptor-regulated Smads (R-Smad; Smad2 and 3 for TGF-β/activin) 在 MH2 domain 的 C-terminal serine residues SXS (S465/S467) 磷酸化

(106)，促使 common mediator Smad (Co-Smad; Smad 4) 與 R-Smad結合成

heterodimer，被活化的 R-Smad/Co-Smad complex 隨即 translocates 到細胞 核，與 co-activators 或 co-repressors 結合共同調控下游分子的轉錄表現

(107)。此外，inhibitory Smad (I-Smad; Smad6 and 7) 透過分解 TβRI 而減弱

TGF-β1 的訊號傳遞(附圖11)。雖然大多數學者公認 Smads 蛋白是細胞內負 責將 TGF-β1 刺激所產生的訊息傳遞至細胞核的傳遞者，但也有其它的傳 遞路徑被討論過，例如在 primary intestinal epithelial cells 和 breast cancer cells lines ， TGF-β1 會 活 化 Ras, extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2) 和 c-Jun N-terminal kinase (JNK)；在murine mesengial cells，

TGF-β1 會活化 protein kinase A ⁽¹⁰⁷⁾。

2. TGF-β 的生理功能

TGF-β 家族成員對許多的組織和器官有著廣泛的生理作用，它們參與 細胞各項的活動包括細胞生長、認知、分化、凋亡、胚胎發育期及成熟組

織的特化^{(100, 108)}，TGF-β 成員中以 TGF-β1 與組織癒合的關係最為明確，

很多不同種類的細胞都能製造 TGF-β1來調控細胞的生長、分化和增加胞外 間貭蛋白的分泌。在正常的生理環境中，TGF-β1 經由調控細胞週期相關分 子的表現而抑制細胞生長，例如：cyclin kinase inhibitors p^15INK4b, p^21CIP1和

p^27KIP(109)；此外 TGF-β1 也會經由Smad-dependent 或 Smad- independent

pathway (包括MAPK pathway 和 PP2A/p70S6 kinase pathway) 抑制細胞生

長⁽¹⁰⁹⁾。在正常細胞，TGF-β1 通常會透過增加胞外間質分泌及抑制其分解

而促進細胞的黏著⁽⁹⁹⁾。TGF-β1 在癌細胞發展的不同時期有不同的調控 ^(105,

110)，在早期，TGF-β1 扮演抑制者的角色抑制癌細胞分裂；當癌細胞進入生 長抑制抵抗期而快速發展時，TGF-β1 則會製造利於癌細胞增生及轉移的微 環境，一旦進入惡性期，TGF-β1 就對癌症的發展與轉移產生很大的影響。

在許多器官的癌細胞都可發現 TGF-β1 大量的表現，大部分的研究也認為 TGF-β1 透過增加 MMP 和 uPA 的表現促進癌細胞的侵潤。 例如在癌化 的上皮細胞發現，TGF-β1 透過活化 Smads ⁽⁸³⁾ 或MAPKs ⁽¹¹¹⁾ 使 MMP2 和 MMP9 的表現增加；在人類卵巢癌細胞發現，TGF-β1 透過活化 Src 或 Smad 增加 uPA 和 PAI-1 的表現 ^{(112, 113)}。

3. TGF-β1 與肺纖維化

TGF-β1 由血小板、巨噬細胞和內皮細胞等產生，它能促進纖維母細胞 趨化、產生膠原 (collagen I, III, IV, V) 和纖維連接蛋白並抑制膠原降解，

對器官纖維化有重大的影響⁽¹¹⁴⁾。 TGF-β1 刺激周圍細胞分泌 fibrogenic cytokines (例如 TNF-α, PDGF, IL-1β 和 TGF-β1)，TGF-β1 本身可促使肌纖 維母細胞分化，並透過 PDGF 刺激纖維母細胞增生；透過 IL-1β 抑制纖維 母細胞凋亡。TGF-β1 造成胞外膠原沉積的原因如下：(1)增加纖維母細胞 collagen、fibronectin、proteoglycans 和其它 ECM components 的mRNA表 現，(2)抑制 plasminogen activators、 MMPs 和 elastase 的表現並增加 TIMPs、PAI-1 和 PAI-2 的表現以減少新產生的 ECM 降解 ^{(98, 115)} 。 從 肺纖維化病人及實驗動物的肺組織都發現活動病灶內有有高度 TGF-β1 表 現；給予 TGF-β1 抗體可減緩纖維化的程度^{(116, 117)}，且不會引起明顯的免

疫干擾⁽¹¹⁸⁾。因此，以 TGF-β signaling pathways 為靶點的治療策略將是研

發抗纖維化藥物很重要的一個方向 ⁽¹¹⁹⁾。