TLR and their ligands

附圖 14. TLR signaling pathway.⁽¹³⁹⁾

附圖 15. LPS stimulation of monocytes activates signaling pathway.⁽¹³⁷⁾

四、巨噬細胞所釋放的細胞激素 1. TNF-α

1985 年，L. Old’s 在動物體內 (in vivo)及體外 (in vitro)的實驗都發 現，當老鼠經過 LPS 的注射後，血液中產生的一種蛋白質會造成某些老鼠 的腫瘤壞死，因此開啟了腫瘤壞死因子的研究。後來的科學家 O'Malley 等 人証實 LPS 對於壞死腫瘤的能力不是直接的，而是血清中的某種被誘導出 的物質所造成的，隨後Carswell等人將其命名為腫瘤壞死因子⁽¹⁴⁰⁾。體內大

(lymphocyte)、肥胖細胞 (mast cell)、多型核白血球(PMN) 等，其中又以巨 噬 細 胞 為 最 大 宗 的 來 源⁽¹⁴¹⁾。TNF-α 是 一 種 很 重 要 的 促 發 炎 激 素 (proinflammatory cytokine)，許多因素都可誘發細胞產生 TNF-α，像是寄生 蟲、細菌、病毒或腫瘤細胞產生之外源性或內源性物質，都會活化細胞產 生 TNF-α 來引發局部或全身性的發炎反應。在急性發炎期，TNF-α 能增 加血管內皮細胞的附著因子，進而吸引嗜中性球和巨噬細胞到被感染部 位，也能促進吞噬作用和清除病原菌及細胞碎片，TNF-α 也會透過活化其 他細胞釋放更多的TNF-α 和 IL-1, PGE2, NO 等物質以放大或延長發炎反 應。正常情況下在局部傷害反應過後，TNF-α 的濃度會降低以限制發炎反 應。在急性發炎期，局部性產生的 TNF-α 是有利於宿主，然而系統性的過 度表現可能會造成全身性的水腫 (systemic capilliary leaking syndrome)、低 血壓、敗血症性休克(sepsis) 及多重器官衰竭，最後死亡；而持續性的表現，

則對於局部的組織造成慢性發炎，導致其他疾病，像是器官纖維化的發展。

TNF-α 的另一功能是經由 Fas ligand 參與細胞凋亡 (apoptosis) 的訊息傳 遞。

在許多肺部疾病的研究中證實 TNF-α 在病理過程中扮演著重要的角 色。例如: interleukin (IL)-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interferon-γ ( IFN-γ ), TNF-α 等，都參與 了氣喘的發炎反應。其中，TNF-α 是一種促發炎細胞激素，同時也會促使 相關的附著分子 (adhesion molecule)，如：E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) 以及 intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 的 表現，對嗜中性白血球及嗜酸性白血球這兩種與發炎反應有關的細胞而 言 ， 也 是 一 種 趨 化 性 的 細 胞 激 素 (chemotactic cytokine) 。 1997 年 Olivenstein R 等 人 在 動 物 實 驗 的 模 式 中 發 現 ， 經 由 ovalbumin 致 敏 (OVA-sensitized) 的老鼠，在其支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage

fluid, BALF) 中，TNFα 濃度的上升會刺激平滑肌細胞分泌 endothelin-1 (ET-1)，進而使得纖維母細胞中 GM-CSF mRNA 表現增加，促進肌纖維母 細胞增生而導致氣道壁纖維化⁽¹⁴²⁾。在肺纖維化病變患者 BALF 中可發現 大量的 neutrophils 和 eosinophils，這些會分泌 proteases 和 oxidants 破壞 肺實質組織的白血球細胞，主要是受到肺泡巨噬細胞分泌的細胞激素 (IL-1 和 TNF-α) 的趨化作用而聚集在肺組織⁽¹⁴³⁾。 發炎細胞與肺實質細胞之間 的多重交互作用也是造成纖維化病變的原因。

2. IL-6

如同 TNF-α，IL-6 是發炎反應的一個關鍵的仲介因子，它是一種多功 能的 (pleiotropic) 細胞激素，其功能包括調節人體的免疫反應、造血作用、

急性期蛋白的合成及發炎反應⁽¹⁴⁴⁾。 IL-6 也能夠促進血小板的增生、活化 及促進凝固作用。活化的吞噬細胞、T 細胞、B 細胞、纖維母細胞、角質 細胞、內皮細胞及神經膠細胞等細胞都可分泌 IL-6 ⁽¹⁴⁵⁾。其它的細胞激素，

如：淋巴毒素 (lymphotoxin)、IL-1、TNF-α、血小板生長因子 (platelet-derived growth factor；PDGF)、血小板活化因子(platelet-activating factor；PAF) 和 顆粒球抑制蛋白 (granulocyte-inhibitory protein) 等也會誘導 IL-6 的合成

(146, 147)。除此之外，被病毒或細菌感染的細胞、受傷害的細胞及腫瘤細胞也

會分泌 IL-6。過量的 IL-6 表現通常和多種免疫功能及發炎相關疾病有 關，例如：風濕性關節炎 rheumatoid arthritis (RA)病人關節液中的 IL-6 濃 度約為血清中的 30-1000 倍⁽¹⁴⁸⁾，而血液循環中IL-6 濃度的升高通常可作 為敗血性休克病患癒後的一項指標。

3. IL-10

Mosmann 等人於 1989 年發現一種由 T helper 2 (Th2) 細胞所分泌的 新型細胞激素，具有抑制 T helper 1(Th1) 細胞產生IFN-γ 的功能，稱為 cytokine synthesis inhibiting factor (CSIF )，這個具有強力免疫調節功能的細 胞激素就是 interleukin-10 (IL-10)⁽¹⁴⁹⁾。體內許多細胞都會產生 IL-10，最主 要還是以巨噬細胞及 Th2 細胞為主。一般而言 IL-10 可藉由減少顆粒性白 血球的數量及發炎性 cytokines 及 chemokines 的產生以達到免疫抑制的 作用。IL-10 抑制包括樹狀細胞在內的抗原呈現細胞 (APC) 活化及 MHC class II 的表現，並透過抑制發炎反應時 NF-κB 的活化，減少吞噬細胞產 生 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β和 IL-12等促發炎細胞激素 (proinflammatory cytokines)。在許多發炎反應、自體免疫實驗的動物模式中，例如：胰臟炎 (pancreatitis) 、 自 體 免 疫 腦 炎 (autoimmune encephalomyelitis) 、 糖 尿 病 (diabetes mellitus)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、敗血性休克 (septic shock)和器官移植 (organ transplantation)等，給予 IL-10 有顯著療效⁽¹⁵⁰⁾。 IL-10基因剔除小鼠很容易發生致死腸道發炎，補充 IL-10 可以減少致死率

(151)。在肺部發炎的研究發現 IL-10 可抑制肺泡巨噬細胞製造 TNF-α 與

IL-1β，因此可減少免疫複合體造成的肺損傷，也可以減少對白血球的趨化 作用。K Nakagome,等人在 bleomycin 致老鼠肺纖維化實驗中發現，給予 IL-10 基因治療可減少膠原蛋白沉積及 αvβ6 integrin 表現而改善肺纖維 化，其機轉可能是透過IL-10 對 TGF-β 的抑制作用⁽¹⁵²⁾。近年來的研究指出 IL-10 會 透 過 化 活 STAT3 以 增 加 soluble type II tumor necrosis factor receptor (TNFR) 和 IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) 的表現，也是抗發炎機 轉之一⁽¹⁵³⁾。

IL-1基因家族可分為幾類: 二種致效劑 (IL-1α, IL-1β)、一種拮抗劑 (IL-1Ra) 和二種接受器 (IL-1RI, IL-1RII) ⁽¹⁵⁴⁾。 IL-1是當細胞受到傷害、感 染或抗原刺激時所產生的一種常見的細胞激素。主要的分泌以巨噬細胞最 多，其他包括內皮細胞、纖維母細胞與 B 細胞等。 IL-1主要有兩種形式：

IL-1α 及 IL-1β，二者都會活化 T 細胞與 B 細胞，並產生發炎反應。IL-1 會加速肝臟急性期蛋白 (acute phase protein) 的製造。幾乎全身所有的細胞 都有 IL-1 的接受器，其對免疫細胞的作用與 TNF-α 類似。如:活化顆粒細 胞 (granulocyte) 的代謝作用，並產生趨化作用 (chemotaxis) 移動到發炎部 位；增加自然殺手細胞 (natural Killer cells, NK) 的毒殺能力；促使內皮細 胞產生粘附因子 (adhesion molecules)，並增加其通透性，以利於免疫細胞 的進出；活化巨噬細胞並加強其毒殺細胞的活性，增加其趨化作用；增強 T 輔助細胞的增生，與刺激其分泌細胞激素。

IL-1Ra 屬於 IL-1 家族之一，它的基因位置與 IL-1 非常接近，同樣 位於第二對染色體上，所產生的蛋白主要有兩類型，第一種是所謂細胞內 的 IL-1Ra (intracellular IL-1Ra；icIL-1Ra)，主要產生 icIL-1Ra 的細胞為角 質細胞與上皮細胞，另外像一些活化後的單核細胞與巨噬細胞也可以產生 此類蛋白質⁽¹⁵⁵⁾。 icIL-1Ra 可以直接在細胞內就調控了 IL-1 的生成，並且 擔任組織遭破壞後第一線消炎反應的功能。第二種則是所謂分泌性的第 IL-1Ra (secreted IL-1Ra; sIL-1Ra)，此種 IL-1Ra 的基因上多了一段可以合 成訊息胜肽的序列，所以在蛋白質合成後，可被運送到細胞外，主要產生 此類蛋白的細胞是週邊血液細胞與上皮細胞。它們被認為是扮演體內發炎 反應負回饋作用中最重要的調節因子。體內一些可以促進發炎反應的細胞 激素，例如：IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ 與 TNF-α 等都可以刺激 sIL-1Ra 的 生成，使進行中的發炎反應得到負向的調控⁽¹⁵⁶⁾。 維持體內 IL-1 和 IL-1Ra

用注射 IL-1Ra 蛋白或基因療法治療發炎疾病的例子，像敗血病、慢性風濕 性關節炎、外科手術傷口、急性發炎與紅斑性狼瘡等，幾乎所有與發炎反 應有關的疾病都可以經由透過 IL-1Ra 調控 IL-1 來達到治療的效果，所以 研究如何提升免疫細胞製造 IL-1Ra 來抗發炎是一個非常有潛力的方向。

5. PGE₂ 與 NO

人類和其它動物的肺泡巨噬細胞都有二種花生四烯酸 (arachidonic acid; AA) 的 代 謝 途 徑 : cyclooxygenase pathway (thromboxanes and prostaglandins) 和 lipoxygenase pathway (leukotrienes and hydroxyl eicosatetraenoic acids HETEs)，這些代謝產物都與發炎反應的調控有關⁽¹⁵⁷⁾。 Cyclooxygenase 產物有 TxA₂, PGE₂, PGD₂ 和 PGF₂；lipoxygenase產物有 LTB₄ 和 5-HETE。其中以 TxA₂ 的量最多( ng/ml)，高於第二大量的 LTB₄ 達 5 倍之多。目前已知 cyclooxygenase 有兩種 isoforms：分別是COX-1 和 COX-2，COX-1在組織中是屬於持續性 (constitutive) 表現，主要作用於維 持體內恆定 (homeostatis) 反應，例如分泌黏液 (mucus secretion)；COX-2 則是一種誘導型 (inducible) 酵素，主要參與調控發炎反應，當前列腺素被 製造之後會快速地從細胞中釋放，透過和 plasma membrane 上特定高親和 力的接受器 (receptor) 結合而作用在鄰近區域。肺泡巨噬細胞會受 IL-1β、

TNF-α、cross-linking of Fc receptors 和 LPS 等發炎刺激物的誘發活化 COX-2 而產生 PGE₂；而 silica 的刺激則是活化 lipoxygenase ⁽¹⁵⁸⁾。

一氧化氮 (NO) 是一個作用短暫的雙原子 (diatomic) 分子，許多不同 的細胞會釋出一氧化氮。一氧化氮和它的代謝物在調節許多生理功能及病 理狀態中扮演著重要的角色，例如產生宿主的防禦系統 (抗微生物及抗腫瘤 的功能)、神經的傳導、神經毒性及血管擴張作用^{(159, 160)}。在內皮細胞所產 生的一氧化氮又稱為 endothelium-derived relaxing factor，具有調節血管擴

張的作用。一氧化氮是細胞利用 L-arginine 經由一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase, NOS) 的作用產生。一氧化氮合成酶可分為三類，即神經型 (neuronal) 一氧化氮合成酶 (nNOS, type I NOS, NOS-1 或 NOS-1)、內皮細 胞 (endothelial) 一 氧 化 氮 合 成 酶 (eNOS, type II NOS, NOS-II 或 NOS-2)、誘發型 (inducible) 一氧化氮合成酶 (iNOS, type III NOS, NOS-III 或 NOS-3)⁽¹⁶¹⁾。 它 們 是 從 不 同 的 基 因 被 表 現 出 來 ， 坐 位 在 不 同 的 chromosomal location ，在不同的細胞展現不同的調節作用。iNOS 在正常 狀態下是不存在於大多數種類的細胞中。當細胞受到葛蘭氏陰性細菌的 LPS 或 cytokines 刺激，會誘發細胞表現出 iNOS⁽¹⁶²⁾。 iNOS是發炎反應 和病原菌清除最重要的一氧化氮來源，研究 iNOS knockout 老鼠可以清楚 地證明在免疫反應中，一氧化氮對於特定微生物的防禦扮演重要的角色。

在一氧化氮和氣喘之間的研究發現，氣喘病患呼吸道上皮細胞 iNOS 表現

增加⁽¹⁶³⁾，且偵測呼出的氣體中也有高量的一氧化氮⁽¹⁶⁴⁾，但對於病人呼吸道

中一氧化氮產生增加和氣喘致病機制之間的關聯仍不明瞭。當細胞持續增 加 iNOS 的表現，並製造出大量的一氧化氮時，會引起細胞毒性及低血壓 休克等現象^{(165, 166)}。因此抑制 iNOS 生成一氧化氮，可作為開發抗發炎藥 物的一個重要的治療標的。

1. NF-κB/IκB kinase ( IKK )路徑

當巨噬細胞上的 receptor 與特定 ligan 結合後，會活化細胞內的訊息 傳遞，此過程會誘導轉錄因子 NF-κB 的活化，以增加 cytokines 的基因表

現^{(167, 168)}。NF-κB 可在數分鐘之內被許多物質所活化，包括發炎性細胞激

素 TNF-α、IL-1 和 T 細胞活化訊號、生長因子及氧化壓力等。在細胞核

素 TNF-α、IL-1 和 T 細胞活化訊號、生長因子及氧化壓力等。在細胞核