以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素治療肺炎及肺纖維化之療效及分子作用機轉;Luteolin alleviates experimental lung inflammation and fibrosis in vivo and in vitro

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(1)中國醫藥大學藥學院中國藥學研究所博士論文. 組別:藥理學組. 编號:ICPS-D66. 指導教授：彭文煌. 博士. 共同指導教授：徐士蘭. 博士. 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素治療肺炎及肺纖維化之療效及分子作用機轉. Luteolin alleviates experimental lung inflammation and fibrosis in vivo and in vitro. 研究生：陳秋媛 Chiu- Yuan Chen. 中. 華. 民. 國. 九十七. 年七月.

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(3) 謝. 辭. 感謝上天的安排，讓我在離開學校十二年後，重新再踏上學習的路程，在浩瀚無邊的知識之海悠游學習和汲取新知。感謝徐士蘭老師，提供良好的研究環境，耐心的指導我跨入原來並不熟悉的領域。感謝彭文煌老師和吳啟瑞老師提供研究方向的建議，感謝謝明村前校長、蔡輝彥院長、陳玉芳所長及張永勳老師細心審閱論文初稿並提供寶貴的意見，更感謝中興大學獸病所廖俊旺老師在疾病動物模式及組織病理切片部分詳盡的指導，使得論文內容能更加的完備。感謝台中榮總分子腫瘤實驗室的研究同仁，旗志學長、俊錡，修竹、淑鐘和美君學姐提供寶貴的經驗，志學、宜瑾和建勳在動物實驗進行時的協助，使我的研究能非常順利的完成。此外，同樣在實驗室日以繼夜為了自己的理想不斷奮鬥的諸位學弟妹，有你們的相伴，研究工作不再是枯燥無趣的，勝利是屬於堅持到最後一刻的人，加油喔﹗ 感謝我的父母在生活上的協助，使我能兼顧家庭並完成學業。更感謝外子及小女一路陪伴，你們的包容與鼓勵是我最大的動力。生命中所有愛護與提攜我的人，在此一併致上最誠心的祝福。.

(4) 目. 錄. 謝辭目錄 ...................................................................................................................... I 略字表 ................................................................................................................... IV 附表及附圖目錄 ................................................................................................... . VI 圖表目錄 ............................................................................................................ VIII 中文摘要 ............................................................................................................... 1 Abstract .................................................................................................................. 3 第一章緒. 論 ..................................................................................................... 5. 第二章總. 論 ................................................................................................... 9. 第一節金銀花之文獻探討 ............................................................................. 9 第二節木犀草素之文獻探討 ..........................................................................13 第三節肺纖維化之病理機轉探討 ..................................................................17 一、肺纖維化的定義 ....................................................................................17 二、急性呼吸窘迫症候群 (ARDS) 與肺纖維化 .....................................18 三、免疫細胞在肺纖維化扮演的角色四、肺泡上皮細胞 (AEC) 與肺纖維化. ......................................................19 ...................................................22. 五、肺纖維母細胞、肌纖維母細胞與肺纖維化六、胞外間質蛋白與損傷修復七、TGF-β1 與肺纖維化. ......................................26. ..................................................................29. ...........................................................................30. 八、國內外有關肺纖維化治療之研究. ......................................................38. 第四節人體的免疫系統與發炎反應 ..............................................................41 一、先天性免疫 ............................................................................................41 二、肺泡巨噬細胞. ......................................................................................42. I.

(5) 三、LPS 與 Toll-like receptors. ...................................................................44. 四、巨噬細胞所釋放的細胞激素. ..............................................................49. 五、NF-κB 及 AP-1 的訊息傳遞路徑. .......................................................56. 六、Reactive oxygen intermediates 與訊息傳遞路徑 ...............................60 第三章. 材料與方法. 第一節實驗材料. ..........................................................................................63 .........................................................................................63. 一、實驗藥劑 ................................................................................................63 二、實驗動物 ................................................................................................66 三、細胞株來源及培養條件..........................................................................66 第二節實驗方法與步驟 .................................................................................67 Part A 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素抗肺纖維化作用及分子機轉探討一、活體動物模式藥效測定..........................................................................67 二、離體細胞模式分子機轉探討..................................................................72 Part B 木犀草素對於肺泡巨噬細胞的免疫調控 .................................................................................76. 一、細胞存活率測定. 二、細胞激素 (Cytokines) 的 ELISA 分析三、一氧化氮 (NO) 含量測定四、 PGE2 含量測定. ............................................77. ................................................................77. ..................................................................................78. 五、細胞免疫螢光染色六、反轉録聚合酶鏈反應. .............................................................................78 .........................................................................78. 七、 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) .......................................79 八、流式細胞儀分析活性氧化物(ROS) ....................................................81 第三節統計分析 .............................................................................................81. II.

(6) 第四章結果 ..........................................................................................................82 Part A 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素抗肺纖維化作用及分子機轉探討一、木犀草素減少 bleomycin 引發之急性期肺炎.....................................82 二、木犀草素減少 bleomycin 引發之肺纖維化.........................................83 三、木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞的生長分化與分泌 ECM ................84 四、木犀草素抑制肺上皮細胞株 A549 進行 EMT ..................................86 Part B 木犀草素對於肺泡巨噬細胞的免疫調控一、木犀草素對細胞存活率之影響..............................................................87 二、木犀草素對 LPS 刺激巨噬細胞產生促發炎細胞激素及發炎物質的影響 ..........................................................................................................87 三、木犀草素對 iNOS 和 COX-2 的蛋白質的調控.................................88 四、木犀草素對相關分子的基因調控..........................................................88 五、木犀草素對 LPS 刺激 NF-κB 活化的影響 .......................................89 六、木犀草素對 LPS 刺激 AP-1 活化的影響 ............................................90 七、木犀草素對對 LPS 刺激 ROS 產生的影響 .......................................91 八、木犀草素對 Akt 與 Ikk 磷酸化的影響 ................................................91 第五章. 討論 .....................................................................................................92. 第六章. 結論 .................................................................................................... 102. 參考文獻 .............................................................................................................. 127. III.

(7) 略字表 2-ME. 2-Mercaptoethanol. α-SMA. Alpha-smooth muscle actin. AEC. Alveolar Epithelial Cells. ALI. Acute lung injury. AP-1. Activating protein-1. ARDS. Acute Respiratory Distress Syndrome. BALF. Bronchoalveolar lavage fluid. BMP. Bone morphogenetic protein. COPD. Chronic obstructive pulmonary disease. COX. Cyclooxygenase. DAPI. 4’,6’-Diamidino-2-phenylindole. DMSO. Dimethylsulfoxide. DNA. Deoxyribonucleic acid. ECM. Extracellular matrix. EGF. Epidermal growth factor. ELISA. Enzyme-Linked Immune Substrate Asssay. EMSA. Electrophoretic mobility shift assay. EMT. Epithelial-mesenchymal transition. ERK. Extracellular-regulated kinase. EtBr. Ethidium bromide. FACScan. Flow cytometer. FITC. Fluorescein isothiocyanate. ICAM-1. Intercellular adhesion molecule-1. IFN. Interferon. IGF. Insulin-like growth factor. IL. Interleukin IV.

(8) iNOS. Inducible NO synthase. IPF. Idiopathic pulmonary fibrosis. JNK/SAPK. c-Jun N-terminal/stress-activated protein kinases. LAP. Latency-associated protein. LTBPs. Latent TGF-β binding proteins. LPS. Lipopolysaccharide. LOX. Lipoxygenase. MAPK. Mitogen-activated protein kinase. MMP. Matrix metarollproteinase. MTT. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazdiumbromide. NFκB. Nuclear factor-kappa B. NO. Nitric oxide. PAI-1. Plasminogen activator inhibitor. PBS. Dulbecco’s phosphatebuffered saline. PGE2. Prostaglandin E2. PI3K. Phosphoinositide 3-kinase. PKB (Akt). Protein kinase B. ROS. Reactive oxygen species. RT-PCR. Reverse transcription polymerase chain reaction. SARS. Severe Acute Respiratory Syndrome. TIMP. Tissue inhibitor of metalloproteinases. TGF-α. Transforming growth factor-α. TGF-β. Transforming growth factor-β. TIMP. Tissue inhibitors of metalloproteinase. TNF-α. Tumor necrosis factor-alpha. V.

(9) 附表及附圖目錄附表 1. Major mediators expressed by lung cells and their potential roles in repair and fibrosis .......................................................................................19 附表 2. Macrophage-secretory products .................................................................44 附表 3. Ligands recognized by alveolar macrophages via receptors........................45 附圖 1. Mechanisms important in the resolution of acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome .......................................................8 附圖 2. Structure of luteolin ....................................................................................13 附圖 3. Pathogenesis of pulmonary fibrosis ...........................................................18 附圖 4. Summary of cellular and cytokine networks in chronic stages of lung injury and fibrosis .......................................................................................25 附圖 5. TGF-β1 induced myofibroblasts differentiation ........................................27 附圖 6. Summary of the key pathogenetic mechanisms of fibroblast and myofibroblast in lung injury and fibrosis ..................................................28 附圖 7. Synthesis and organization of latent complexes of TGF-β1........................34 附圖 8. Model of the consequences of αvβ6 integrin-mediated activation of TGF-β by alveolar epithelial cells ............................................................34 附圖 9. Pre- and postreceptor regulation of TGF-β1 signaling ..............................35 附圖 10. Signalling specificity in the TGF-β superfamily ......................................36 附圖 11. Mechanism of signal transduction mediated by TGF-β .............................37 附圖 12. Innate and acquired immune activation of macrophages ..........................47 附圖 13. TLR and their ligands ................................................................................48 附圖 14. TLR signaling pathway .............................................................................48 附圖 15. LPS stimulation of monocytes activates signaling pathway .....................49. VI.

(10) 附圖 16. NF-κB/Rel proteins ...................................................................................58 附圖 17. Multiple signalling pathways activate NF-κB ..........................................59 附圖 18. Phagocytosis and oxidative burst ..............................................................61 附圖 19. ROS/RNS and intracellular signaling molecules in airway epithelial cells .............................................................................................................62. VII.

(11) 圖表目錄 Table 1.. Primer used in RT-PCR analysis ..............................................................79. Table 2.. Effects of luteolin on total and differential cell counts in BALF...........103. Figure 1.. Time-course changes in the levels of TNF-α and IL-6 level in BALF 104. Figure 2.. Attenuation of bleomycin-induced lung inflammation by luteolin.......105. Figure 3.. Time course of BLM-induced lung fibrosis ..........................................106. Figure 4. Criteria for grading lung fibrosis ............................................................107 Figure 5. Luteolin ameliorated bleomycin-induced lung fibrosis in mice.............108 Figure 6. Down-regulation of bleomycin-stimlated collagen and TGF-β1 gene expression by luteolin............................................................................109 Figure 7. Luteolin inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner..........110 Figure 8. Luteolin inhibitedTGF-β1-induced myofibroblastic differentiation ......110 Figure 9. Luteolin decreased α-SMA, collagen 1 and vimentin production induced by TGF-β1 in lung fibroblasts.................................................111 Figure10. Decrease of TGF-β1-induced Smad3 phosphorylation and Smad4 expression by luteolin in primary lung fibroblasts.................................112 Figure11. Prevention of TGF-β1-induced EMT by luteolin in A549....................113 Figure12. Effect of luteolin on cell viability ..........................................................114 Figure13. Luteolin inhibited LPS-induced TNF-α and IL-6 production...............115 Figure14. Luteolin inhibited LPS-induced NO and PGE2 production ...................116 Figure15.. Luteolin decreased the protein levels of COX-2 and iNOS in LPS-stimulated macrophages ................................................................117. Figure16.. Luteolin decreased the mRNA levels of inflammation-associated genes in LPS-stimulated macrophages..................................................118. Figure17. RT-PCR analysis of IL-1Ra and IL-10 mRNA expression..................119 Figure18. Attenuation of LPS-induced NF-κB activation by luteolin...................120 Figure19.. Effects of luteolin on LPS-induced nuclear translocation of p65 subunit of NF-κΒ...................................................................................121 VIII.

(12) Figure20. Luteolin blocked LPS-induced IκBα degradation.................................122 Figure21. Suppression of LPS-induced AP-1 activation by luteolin .....................123 Figure22. Effects PDTC and curcumin on LPS-induced inflammation-associated genes expression ..............................................................................124 Figure23. Effect of luteolin on LPS-induced ROS generation ..............................125 Figure24. Luteolin decreased the LPS-induced Akt and IKKα/β phosphorylation .....................................................................................126. IX.

(13) 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素治療肺炎及肺纖維化之療效及分子作用機轉. 研究生陳秋媛中國醫藥大學藥學院中國藥學研究所. 摘. 要. 從許多動物體內及體外細胞的研究都證明木犀草素具有良好的抗發炎作用。然而，木犀草素對於肺炎及肺纖維化的作用機轉尚未明確。本研究利用活體動物及離體細胞模式探討木犀草素的抗發炎及抗肺纖維化作用及其分子機轉。 C57BL/6J 小鼠以氣管內注入 bleomycin 引發肺炎及繼發性肺纖維化，治療組以胃管投與木犀草素，並以投與類固醇作為治療對照組。在第 7 和 14 天取出老鼠肺臟，以肺沖洗液之細胞計數及分析發炎性細胞激素含量評估木犀草素的抗發炎效果，並在第 21 天取出老鼠肺臟作病理切片及染色、膠原蛋白含量測定及肺組織 TGF-β1 mRNA 表現等評估肺纖維化改善程度。活體動物實驗結果顯示，早期(第 1 天開始)與後期(第 10 天開始)投與木犀草素都可以減少 bleomycin 引發小鼠的肺纖維化程度。在細胞培養部分，我們利用初代小鼠肺纖維母細胞和肺上皮細胞株 A549 探討木犀草素抗肺纖維化之機轉，結果發現木犀草素抑制 TGF-β1 刺激小鼠肺纖維母細胞產生 α-smooth muscle actin (α-SMA) 和 collagen 1 表現是透過抑制 Smad3 磷酸化及減少 Smad4 的表現。從細胞型態及相關分子的表現 (E-cadherin, fibronectin and collagen1)顯示木犀草素會抑制 TGF-β1 刺激 A549 進行 epithelial-mesenchymal transition (EMT)。根據我們的結果顯示木犀草素的抗纖維化作用可能是透過阻斷肺纖維細胞和肺上皮細胞 TGF-β/Smad 的訊息傳遞，使纖維化相關分子表現減少。本論文也進一步以 1.

(14) 巨噬細胞探討木犀草素調節免疫作用的分子機轉。研究發現在老鼠肺泡巨噬細胞株 (MH-S)及周邊巨噬細胞株(RAW264.7)中，木犀草素可抑制由脂多醣體 (LPS) 引發產生一氧化氮(NO) 和前列腺素 E2 (PGE2)等發炎物質及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及介白素-6 (IL-6)等細胞激素，同時也抑制了 NO 及 PGE2 上游的調控酵素 inducible NO synthase (iNOS)及 cyclooxygenase-2 (COX-2) 的蛋白質表現。從半定量反轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 實驗中證明木犀草素可抑制由 LPS 引發 TNF-α、IL-6、iNOS 和 COX-2 mRNA 等的表現。在 NF-κB 路徑中木犀草素能抑制 IκB- α 的分解以及 NF-κB p65 subunit 進入細胞核與 DNA 結合。不僅如此，木犀草素也明顯地減少 AP-1 與 DNA 結合，進而調控其下游與發炎相關物質的產生。我們也進一步發現細胞前處理木犀草素可抑制由脂多醣體刺激產生活性氧化物 (ROS)，同時也減少 protein kinase B (Akt) 及 IKK 磷酸化。綜合上述結果顯示木犀草素抑制 LPS 刺激肺泡巨噬細胞產生發炎相關物質的機轉為經由抑制轉錄因子 NF-κB 與 AP-1 的活化，其抑制 NF-κB 與 AP-1 的活化可能與 ROS 有關。我們的研究結果顯示木犀草素在活體動物及離體細胞模式下有良好的抗發炎及抗肺纖維化作用。. 2.

(15) Luteolin alleviates experimental lung inflammation and fibrosis in vivo and in vitro Chiu- Yuan Chen Graduate Institute of Chinese Pharmacrutical Sciences, College of Pharmacy, China Medical University. Abstract Luteolin possesses anti-inflammatory property and effectively in treatment of lung diseases.. The present study investigated the antifibrotic effect and its. molecular mechanism of luteolin on lung fibrosis in both in vivo and in vitro models.. C57BL/6J mice were administered a single intratracheal injection. with bleomycin and then treated orally with luteolin. Lung inflammation was examined by direct counting inflammatory cell population and cytokine levels in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) at day 7 and day 14.. Antifibrotic. effect of luteolin was determined by investigating histological changes, collagen contents and induction of TGF-β1 mRNA expression at day 21.. To elucidate. the antifibrotic mechanism of luteolin, the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen 1 and phosphorylated Smad3 protein were analysized by immunofluorescence staining and Western blotting in TGF-β1-stimulated primary mouse lung fibroblasts.. The morphological changes as well as. epithelial and mesenchymal marker were examined in TGF-β1-stimulated human lung carcinoma-derived alveolar epithelial A549 cell line. In vivo study showed that luteolin treatment ameliorated all these biochemical indices and histological alterations induced by bleomycin even delayed luteolin treatment. In vitro study showed that luteolin attenuated TGF-β1-induced α-SMA and collagen 1 upregulation and Smad3 phosphorylation in mouse lung fibroblasts. 3.

(16) Furthermore, TGF-β1 mediated E-cadherin downregulation as well as fibronectin and collagen 1 upregulation was significantly inhibited by luteolin in A549 cells.. Our data suggest that luteolin may be useful as a therapy for. pulmonary fibrosis and its antifibrotic effect at least partly through blockade of TGF-β−signaling pathway.. We also verified the effects of luteolin-mediated. immune modulation in macrophages when stimulated with lipopolysaccharide (LPS).. We examined the effects of luteolin on the production of nitric oxide. (NO) and prostaglandin E2 (PGE2), as well as the expression of inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6) in mouse alveolar macrophage MH-S and peripheral macrophage RAW 264.7 cells. Luteolin dose-dependently inhibited the expression and production of these inflammatory genes and mediators in macrophages stimulated with LPS.. Semi-quantitative reverse-transcription. polymerase chain elongation reaction (RT-PCR) assay further confirmed the suppression of LPS-induced TNF- α, IL-6, iNOS and COX-2 gene expression by luteolin in a transcriptional level.. Luteolin also reduced the DNA-binding. activity of nuclear factor-kappa B (NF-κB) in LPS-activated macrophages. Moreover, luteolin blocked the degradation of IκB-α and nuclear translocation of NF-κB p65 subunit.. In addition, luteolin significantly inhibited the. LPS-induced DNA binding activity of activating protein-1 (AP-1).. We also. found that luteolin attenuated the LPS-mediated protein kinase B (Akt) and IKK phosphorylation, as well as reactive oxygen species (ROS) production.. In sum,. these data suggest that, by blocking NF-κB and AP-1 activation, luteolin acts to suppress the LPS-elicited inflammatory events in mouse alveolar macrophages, and this effect was mediated, at least in part, by inhibiting the generation of reactive oxygen species.. Our observations suggest a possible therapeutic. application of this agent for treating inflammatory disorders in lung.. 4.

(17) 第一章. 緒論. 呼吸系統直接與外部環境接觸，因此對吸入的有害物質相當敏感。許多散布在空氣中的化學物質及病原菌都會引起肺的損傷。例如二氧化氮，臭氧或硫酸的吸入，會導致肺泡微血管的滲透性增加，並造成第I型、第Ⅱ 型肺泡上皮細胞和結締組織的損害。吸入性肺損傷的原因還包括細菌或病毒性肺炎、吸入胃內容物，以及肺部挫傷等，許多肺部疾病的發展過程都會產生氧化壓力與一連串的發炎反應，例如急性肺損傷 (acute lung injury; ALI )/急性呼吸窘迫症候群 (acute respiratory distress syndrome; ARDS)、敗血症(sepsis)、缺血再灌注(ischemia-reperfusion)、高血氧症(hyperoxia)、肺臟移植 (lung tansplantation)及慢性阻塞性肺炎 (chronic obstructive pulmonary disease; COPD) 等。這些急性或慢性的肺部損傷，均會造成細胞毒性物質的釋放，包括活性氧化物 (reactive oxygen species; ROS) 和活性氮化物 (reactive nitrogen species; RNS) 大量的產生以及細胞激素 (cytokines) 的釋放等，進而使得嗜中性白血球以及肺泡內巨噬細胞的活化，釋放促發炎物質，破壞上皮細胞，或導致微血管通透性增加，產生肺水腫現象，對肺組織造成傷害(1)。以急性肺損傷 (ALI) 造成的急性呼吸窘迫症候群 (ARDS) 為例，病人原先肺部正常，而在外傷或感染後出現急性呼吸困難，低血氧，肺順應性減低 (reduced lung compliance)，胸部 X光有兩側瀰漫性浸潤，以傳統呼吸治療方法無法矯正其低血氧等現象。病理上出現肺組織明顯的充血，肺泡及間質水腫，肺泡塌陷，炎性細胞浸潤，肺泡內有透明膜 (hyaline membrane) 之形成及纖維化病變(2) (附圖1)。由一類新種冠狀病毒 (SARS-CoV) 所引發的嚴重急性呼吸道症候群 (SARS) 是本世紀新興傳染性疾病，從 2002 年 7 月到 2003 年 9 月流行期間，在全世界共造成八千多人感染，死亡人數高達 812 人(3)，典型的症狀. 5.

(18) 為發燒、咳嗽、呼吸困難、肺浸潤及肺實質化，並快速發展為瀰漫性肺泡損傷進而造成致命性的呼吸衰竭 (ARDS) 或繼發性的肺纖維化，平均致死率為 9.6%。急性期病理特徵為肺部單核球浸潤，肺泡塌陷，肺泡上皮及微血管內皮的損傷、以及滲出性的肺間質水腫，與 ALI 所造成之病理特徵類似 (4) 。研究顯示肺泡巨噬細胞和 T 細胞釋放出大量的 proinflammatory cytokines ，如腫瘤壞死因子 -α (tumor necrosis factor-α) 、介白素 -1 (interleukin-1) 和介白素-6 (interleukin-6)、血小板活化因子、前列腺素、 thromboxanes 和活性氧化物 (ROS) 等，都參與了肺部損傷，也在病理機轉中扮演重要的角色。中醫藥對抗疫疾已有三千多年的經驗，從典籍文獻的記載中，影響較大的疫疾包括鼠疫、傷寒、霍亂、流感、肺炎、腦炎、瘧疾、痢疾、天花、麻疹、寄生蟲等疾病。在中醫藥典籍中，記載許多對肺部疾病有療效的方劑或單味藥，如清熱解毒藥金銀花、板藍根、連翹、魚腥草等；還有清肺止咳藥如黃芩、山梔子、桑白皮、桑葉、沙參、麥冬、貝母、枇杷、桔梗等。在 SARS 流行期間，具有抗病毒及消炎作用的金銀花、黃芩、板藍根或是魚腥草等，更被認為有預防疾病的效用。這些沿用已久的中草藥雖有中醫臨床經驗的傳承，但卻缺乏科學化的實驗證明其療效及確實之作用分子機轉，因此無法受到國際醫學界普遍之認同及使用。因此，如何善用中藥的免疫調節作用以中西醫結合的方法來面對 SARS 的挑戰，並將中醫臨床應用上有確實療效之中草藥，以現代的科學知識及技術，探究其藥理分子機制，是將中醫藥推向國際社會之必行之路，也是中醫藥學界重要的研究方向。由於化學合成藥物對正常細胞殺傷力大，近幾年來，歐美各國興起萃取藥用植物進行輔助療法，以減緩化學藥物對人體的危害。因此，從植物活性成分提取到各項生物活性的分析研究，都有不少的成果。以廣泛分佈 6.

(19) 於植物體內的黃酮類 (flavonoids) 化合物為例，它是一類廣泛分佈於植物體內的低分子量多酚類 (polyphenols) 物質，在植物體內多以游離態或與糖結合成苷的形式存在，也是許多藥用植物的主要活性成分。現已發現數百種不同類型的黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性。黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過敏、抗發炎、抗病毒等多種生物活性及藥理作用，對人類的腫瘤、衰老、心血管等疾病的治療和預防都具有重要意義。在傳統中醫藥中，金銀花是忍冬科 (Caprifoliaceae)多年生常綠纏繞灌木忍冬 (Lonicera japonica Thunb.)的乾燥花蕾，以其抗菌、抗病毒及清. 熱解毒、袪風熱、清咽喉熱痛等功效，廣泛地應用在預防及治療流行性感冒、上呼吸道感染、肺炎、細菌性痢疾等發炎疾病。在 SARS 流行期間，具有抗病毒及消炎作用的金銀花，被認為有預防及治療的效用，因而成為防治非典型肺炎處方中使用頻率最高的單味藥(5)。從文獻中得知近幾年在探討天然物之純化物對人類之發炎、心血管疾病、以及癌症具有預防治療作用方面，有顯著的成果，亦可驗證於分子機轉。木犀草素 (luteolin)為金銀花主要成分之一，屬於四羥基黃酮類化合物，在許多的動物體內及體外. 細胞實驗中發現木犀草素具有明顯的抗氧化及免疫調節作用，然而針對木犀草素治療肺部疾病的相關研究則不多。以 bleomycin 誘導小鼠肺纖維化是目前國際上認為與人類肺纖維化病理改變最為接近的一種動物實驗模型，本研究透過 bleomycin 誘導小鼠產生急性損傷性肺炎及繼發性肺纖維化模型，評估木犀草素抗肺炎和抗肺纖維化作用，並深入的探討其作用路徑及相關的分子，以提升金銀花等中藥的應用價值，並提供此藥作為治療肺炎及肺纖維化疾病時之參考。此外，研究肺纖維化的機轉亦可提供其他纖維性疾病一些參考性的資料，例如 atherosclerosis、cirrhosis 和 connective tissue diseases 等，因為這些疾病的發展均有許多相似的過程，如發炎、免疫過度活化、細胞激素及分子機轉等。 7.

(20) 附圖 1. Mechanisms important in the resolution of acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome.(6). 8.

(21) 第二章. 總論. 第一節金銀花之文獻探討 1. 本草資源考證金銀花，又名忍冬花，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，是常用的中藥之一。其名始見於本草綱目忍冬條下。忍冬始載於名醫別錄，列為上品，主治寒熱身腫。陶弘景曰： “處處有之，藤生淩冬不凋，故名忍冬。” 李時珍謂：“忍冬在處有之，附樹延蔓，黃微紫色，對節生葉。葉似薛荔而青，有毛。三四月開花，長寸許，一蒂兩花二瓣，一大一小，如半邊狀，長蕊。花初開者，蕊瓣俱色白，經二三日，則色變黃，新舊項參，黃白相映，故呼金銀花。” 又謂：“莖葉及花，功用皆同。” 在不同的歷史時期，金銀花的藥用部位發生了很大變化。宋代以前獨用莖葉，明代則莖、葉、花同等入藥，此後強調以花為主，其莖葉成為同一植物的另外一種藥物，即忍冬藤。忍冬藤具清熱解毒、通經活絡的作用。金銀花植物來源複雜，在中國分佈廣泛。中華中藥典記載金銀花 Lonicerae Flos 為忍冬科 Caprifoliaceae 植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花 Lonicera confusa DC. 或毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd. 之乾燥花蕾(7)。 2. 金銀花活性成分研究金銀花是忍冬科同屬多種植物忍冬的乾燥花蕾，外形呈棒狀，上粗下細，長 2～3.5 cm ，外表淡黃色，久貯色漸深。金銀花為常見中藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能。臨床應用於治療瘡瘍、瀉痢、外感、熱病等，也用治療呼吸道感染、頭痛咽痛等疾病。傳統認為花蕾採收宜為初夏，莖枝於秋冬割取。現代研究證明:花蕾的採收期大都在清明季 9.

(22) 節，此時成熟花蕾中綠原酸含量最高。對於葉的採收，有人認為以 8～9 月份含綠原酸最豐富，此時採收較為適宜。研究顯示其花中主要含有揮發油、黃酮類、有機酸、三萜類等活性成分(8, 9)。 2. 1. 揮發油類金銀花乾品中含有揮發油成分 60 種以上，其中主要成分酸類化合物. 占揮發油總量的 59.76% ，其次酮類化合物占 15.58% ，醇類化合物占 12.85%，萜類化合物占1.57%，萜類氧化物占1.32%，醛類化合物占1.74%，烷烴化合物占7.18%，共占金銀花中揮發油總量的 98.44%。鮮品揮發油成分多為低沸點的不飽和萜烯類，其中以芳香醇為主，含量占揮發油的45. 5% 以上。金銀花乾花蕾中多為單萜及倍半萜類化合物，含量較高的有香茅醇 (citronellol) 、芳樟醇 (linalool) 、 α- 松油醇 (α-terpineol) 、二十一烷醇 (3-henen-1-ol) 、辛烯醇(1-Octen-3-o1)和香葉醇 (geraniol)等(10)。 2. 2. 黃酮類 1995年高玉敏首次從金銀花中分離出4個黃酮類化合物，經鑑定為木犀. 草素- 7 - O -α - D - 葡萄糖苷( luteolin - 7 - O- α- D-glucoside)、木犀草素- 7 O -β - D - 半乳糖苷( luteolin-7- O- β- D- galactoside)、槲皮素- 3 -O -β - D 葡萄糖苷( quercetin- 3- O- β- D- glucoside)、金絲桃苷( hyperoside)(11)。 2. 3. 有機酸衍生物綠原酸類化合物是金銀花的主要成分之ㄧ，包括綠原酸(chlorogenic. acid)、異綠原酸 (isochlorogenic acid) 和咖啡酸 (caffeic acid)。其中異綠原酸為一混合物，它的異構體有七種，分別為 4,5-二咖啡酸醯奎尼酸、3,4 二咖啡酸醯奎尼酸、3 ,5-二咖啡酸醯奎尼酸、1,3 - 二咖啡酸醯奎尼酸、3阿魏醯奎尼酸、4 -阿魏醯奎尼酸和5-阿魏醯奎尼酸(12)。. 10.

(23) 2. 4. 三萜及三萜皂苷類 1990年陳敏等 (13) 從金銀花中分離出一個新的含有 6 個糖基的三萜皂. 苷。1993年茅青等(14)也分離得到 3 個三萜皂苷， 1994年陳敏等(13)又分離出 2 個新的雙咖啡酸醯奎尼酸酯化合物。婁紅祥等(15)分離出 3 個三萜皂苷類，分別為3 - O - α - L- rhamno pyranosyl ( 1 →2 ) - α - L - arabinopy ranonosyl hederagenin 28 - O - β - D - xylpyranosyl ( 1→6) -β - D - glucopy ranosyl ester、3 - O -α - L -arabinopy ranosyl hedragenin 28 - O -α - L rhamnopyranosyl (1→2) [β - D - xylpyranosyl (1→6) - β- D - glucopy ranosyl ester 和 3 - O - α - L - rhamnopy ranosyl ( 1 →2 ) - α - L - arabinopy ranosyl hederagenin 28 - O - α - L - rhamnopy ranosyl ( 1→2) [β - D - xylpyranosyl ( 1 →6) - β - D – glucopy ranosyl ester。 2. 5. 無機元素金銀花含微量元素共 15 種，分別為Fe、Mn、Cu、Zn、Ti、Sr、Mo、. Ba、Ni、Gr、Pb、V、Co、L i、Ca 。 2. 6. 其他忍冬花蕾中還含有肌醇 (inositol)、β - 穀固醇 (β-sitosterol) 等。另外. 邢俊波等首次從該植物中發現 5 -羥基- 7, 4-二甲氧基黃酮，並首次從該植物花蕾中發現槲皮素、忍冬苷、齊墩果酸和胡蘿蔔苷(16)。 3. 3. 1. 金銀花之藥理作用抗病原微生物體外試驗顯示金銀花對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、. 痢疾桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌等均有抑制作用，對肺炎桿菌、腦膜炎雙球菌、綠膿桿菌、結核桿菌亦有抑制效果(17)。金銀花對變形 11.

(24) 鏈球菌，具有較好的抑菌和殺菌作用，金銀花與青黴素合用，能加強青黴素對耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌作用，兩者具有協同作用(18)。金銀花對流感病毒、孤兒病毒、皰疹病毒、猴免疫缺陷病毒 (SIV) 等多種病毒均有抑制作用，金銀花注射液對綠膿桿菌內毒素有對抗作用(19, 20)。對傷寒桿菌內毒素有減毒作用。此外，體外試驗顯示金銀花及其藤煎劑對鉤端螺旋體有抑制作用。 3. 2. 消炎及解熱作用金銀花提取物對鹿角菜膠、蛋清等引起的大鼠足蹠腫脹有抑制作用，. 還有明顯的抗滲出和增生作用。對金銀花解熱、消炎、免疫等實驗研究結果顯示，其水煮液、口服液和注射液對鹿角菜、三聯菌苗致熱有不同程度的退熱作用，對蛋清、鹿角菜膠、二甲苯所致水腫有不同程度的抑制作用 (21). ，另外，還能明顯提高鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數，證明. 金銀花臨床用作清熱解毒治療感染性疾病，主要是透過調節機體免疫功能而產生的(22)。 3. 3. 保肝利膽作用動物實驗顯示金銀花中的三萜皂苷對四氯化碳引起的小鼠肝損傷有明. 顯的保護作用，並明顯減輕肝臟病理損傷的嚴重程度。金銀花所含綠原酸能增進大鼠膽汁分泌，黃褐毛忍冬總皂苷皮下注射能顯著對抗四氯化碳和 D -半乳糖胺所致肝中毒小鼠血清谷丙轉氨酶升高，降低肝臟甘油三酯含量，明顯減輕肝臟病理損傷程度(23)。 3. 4. 其他作用金銀花有提高免疫功能的作用，煎劑能增加白血球、炎性細胞的吞噬. 能力。有研究指出，金銀花及酒浸液對 S180 肉瘤及艾氏腹水癌有明顯細. 12.

(25) 胞毒殺作用。金銀花提取液口服對大鼠實驗性胃潰瘍有輕度預防效果。金銀花具有降血脂、興奮中樞神經系統、止血和降壓等作用。此外，綠原酸還能輕微增強腎上腺素及去甲腎上腺素對貓與鼠的升壓作用(24-26)。. 第二節木犀草素之獻探討 1.. 木犀草素之結構與理化性質(27). 1.1 化學名： Luteolin (3', 4', 5, 7- tetrahydroxylflavone) 1.2 分子式及分子量： C15H10O6；286.24 1.3 物理性質：木犀草素為黃色針狀化合物，微溶於水，溶於鹼中呈黃色溶液。熔點 328-330℃。 1.4 結構式：. 附圖 2.. Structure of luteolin.. 13.

(26) 1.5 來源植物除了忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica) 之外，木犀草素也在其它植物中被發現，如龍膽科植物濕生萹蕾(Gentianopsis paludosa)、敗醬科黑水纈草 (Valerlana amurensis) 地上部分、豆科落花生(Arachis hypogaea)果實外殼、鷹爪豆 (Spartium junceum) 花中、玄參科金魚草(Antirrhinum majus) 花瓣中、十字花科植物薺菜(Capsela jobursa)(28)。 1.6 金銀花不同部位之木犀草素含量金銀花之木犀草素含量隨著金銀花品種、部位不同而存在較大差異；金銀花同一品種，不同部位中木犀草素含量分布亦不相同，為葉、枝>花蕾 >花。不同品種金銀花及不同部位中，木犀草素含量有很大的差異，從 27.89 μg/g 到 240.39 μg/g 不等，但在各個品種中，葉和枝中的含量都較高，因此有必要對這些資源加以開發利用(29)。 2. 木犀草素之藥理學研究木犀草素屬於四羥黃酮類化合物，黃酮類化合物是一類多酚類化合物，廣泛分佈於植物界中，在植物體內大部分與糖結合成苷，一部分以游離形式存在，屬於植物的二次代謝產物。實驗證明其具有廣泛的生理和藥理活性，包括清除自由基、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗發炎、抗衰老等，對人類的腫瘤、心血管疾病、老人癡呆等慢性疾病的治療和預防有重要意義。因此對該類化合物的研究已成為國內外醫藥界研究的熱門課題。而這許多生理活性多與其抗氧化作用有關，目前在抗氧化研究領域中黃酮類化合物是研究的熱門項目之一。黃酮類化合物泛指結構具有15 個碳原子的多元酚化合物。芳香環 (A 環、 B 環) 之間以一個三碳鏈 (C 環) 相連，用 C6 - C3 - C6 表示(附圖2)。其中 C 環部分可以是酯鏈，也可以與 B 環部分形成六元或五元的氧雜環。根據 C3 部分的成環、氧化和取代方式的差 14.

(27) 異，黃酮類化合物可分為黃酮類 (flavones)、黃酮醇類 (flavonols)、異黃酮類 (isoflavones)、查爾酮類 (chalcones)、噢口弄類(aurones)、花青素類 (anthocyanins) 等以及上述各類的二氫衍生物。黃酮類化合物抗氧化的作用機制是通過酚羥基與自由基反應生成共振穩定的半醌式自由基結構，從而終止自由基鏈式反應(30)。除了具有優異的抗氧化能力之外，許多研究顯示黃酮類化合物在抗病毒、抗發炎、抗過敏或抗癌方面也都有很好的效果。從抗發炎相關的研究中發現，某些黃酮化合物的抗發炎作用優於其它種類。2001年 Xagorari 等人利用細菌內毒素(lipopolysaccharide;LPS)刺激 RAW264.7 巨噬細胞產生發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)的實驗來評估一群黃酮化合物的抗發炎作用，細胞前處理 luteolin 、 luteolin-7-glucoside 、 quercetin 和 genistein可抑制 TNF-α 與 IL-6 的釋放，而 eriodictyol 和 hesperetin 只抑制 TNF-α 的釋放，luteolin 和 quercetin 的 IC50分別為 1 μM 和 5 μM，糖苷 luteolin-7-glucoside 的效果則不如苷元 luteolin. (31). 。2004年 Chen 等. 人以 TNF-α 刺激肺上皮細胞釋放 ICAM-1 的實驗，比較三種黃酮醇 (flavonols): kaempferol, quercetin, myricetin及六種黃酮 (flavones): flavone, chrysin, apigenin, luteolin, baicalein, baicalin 的抑制效果，其中 kaempferol, chrysin, apigenin, luteolin 都可抑制 ICAM-1蛋白質及 mRNA的表現 (IC50 分別為 12.1, 0.9, 0.82, 0.8 μM)，進一步的分子機轉探討中發現 luteolin 可明顯抑制 ICAM-1上游的轉錄分子 AP-1 與 DNA 結合，進而調控蛋白質的表現(32)。 2006年 Mo`nica Comalada 等人在primary bone marrow-derived mouse macrophages (BMDM) 所作的抗發炎實驗中也發現，在所有受試樣品 (flavonols: quercetin, kaempferol; flavones: diosmetin, apigenin, chrysin, luteolin; isoflavones: genistein, daidzein; flavanones: hesperetin)中，quercetin 和 luteolin 對於 BMDM 的增生、IκBα 的磷酸化、cytokines及 NO 的釋 15.

(28) 放都有顯著的抑制作用(33)。 2006年 Kazuki Kanazawa 等人認為幾種黃酮化合物中 (quercetin, apigenin, baicalein, chrysin, luteolin, kaempferol)，只有 luteolin 與 quercetin 具有保護 HepG2 細胞免於氧化壓力造成細胞 DNA 傷害的能力(34)。 2007年蔡汎修等人研究發現木犀草素可以改善類澱粉樣蛋白誘發大鼠學習記憶障礙，並對神經細胞有保護作用(35)。 2002年 Hisashi Mastuda 等人在 Antigen-Induced RBL-2H3 Cells (mast cells) degranulation 實驗中發現，在幾種黃酮化合物中 luteolin 具有很強的抗過敏活性，因此作者歸納出黃酮化合物的抗過敏活性乃因其結構上連接了某些特殊的官能基. (36, 37). 。綜合以上所述，黃酮化合物的抗發炎作用與其結構之間存在著. 某種相關性 (structure-activity relationship; SAR)，而 luteolin 的抗發炎的效果是幾種黃酮類中最好的，因此在近幾年內有更多的學者投入了與 luteolin 有關的藥理及分子機轉研究。 2001年 Anastasia Kotanidou 等人在老鼠實驗發現 luteolin 可以降低由 LPS 引發的致死率以及相關 proinflammatory molecules 的表現. (38). 。. 2003年 M. Das 等人發現口服 luteolin 可以減少 ovalbumin 致敏小鼠的氣喘發作，降低血中 IgE 和 bronchoalveolar lavage fluid (BALF) 中 IFN-γ, IL-4 , IL-5 的濃度(39)。 2005年 Liisa Tormakangas 在老鼠感染 Chlamydia pneumoniae 引發急性肺炎的實驗中發現，腹腔注射 luteolin 可降低老鼠的 infection load 及肺部發炎現象(40)。在分子機轉探討的部分，於不同的細胞株所進行抗發炎機轉的研究均認為 luteolin 抗發炎作用是透過調控轉錄分子 NF-κB 的活性，導致下游發炎相關分子的產量減少(41-44)。 Luteolin 的抗發炎作用則可能是透過阻斷鈣離子通道及 PKC signalings 而抑制了下游 histamine 、 leukotrienes (LTs) 、 prostaglandin D2 (PGD2) 和 granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) 等過敏物質的釋出(45)。. 16.

(29) 第三節、肺纖維化之病理機轉探討一、肺纖維化的定義瀰漫性肺間質纖維化病變是一種由多種病因所引起的肺破壞性疾病，超過 200 多種的肺間質疾病 (Interstitial Lung Disease；ILDs) 都會導致肺纖維化，包括已知的成因如職業、環境、藥物、高血壓、感染、免疫系統的異常 (如硬化症或特發性肺纖維化)等，每種病因其確切的發病機制尚未完全明瞭，但不同病種的肺間質纖維化改變極為類似，其共同的發展是以肺泡炎、間質性肺炎、肺泡上皮受損及膠原異常聚集為特徵的慢性炎性疾病，主要症狀為進行性呼吸困難，最終導致呼吸衰竭而死(46,. 47). 。其中特異性肺. 纖維化 (Idiopathic pulmonary fibrosis; IPF) 經確診後平均存活期為 2-4 年， 5 年存活率為 30-50%. (48, 49). 。肺纖維化過程包括肺組織的發炎性損傷、組. 織結構破壞以及隨後伴有肺間質細胞積聚的組織修復過程。在此過程中，肺發炎細胞 (主要為單核巨噬細胞)、肺泡上皮細胞、肥大細胞、內皮細胞和肺間質細胞 (如纖維母細胞、肌纖維母細胞)通過分泌細胞激素 (cytokines)、炎性介質等生物活性物質，發揮直接或間接的作用，活化了膠原蛋白的基因表現且製造大量的膠原蛋白堆積在細胞間質(50-53)。形態學上發現，纖維化病變內肺泡Ⅱ型細胞、纖維母細胞、巨噬細胞以及肥大細胞彼此之間緊密接觸。因此，參與肺纖維化的多種細胞共同構成了一個複雜的細胞網絡，彼此相互影響 (附圖 3)。研究結果顯示，其中以肺巨噬細胞、肺泡上皮細胞及肺纖維母細胞在纖維化起始及進展過程中扮演相當重要的角色。. 17.

(30) 附圖 3.. Pathogenesis of pulmonary fibrosis.(54). 二、急性呼吸窘迫症候群 (ARDS) 與肺纖維化急性肺損傷 (ALI)，包括細菌性、病毒性引發之肺炎或是吸入性、放射性損傷等非炎性因素(55,. 56). 。其中最嚴重的病理反應為急性呼吸窘迫症候群. (ARDS)，即使施予支持性療法，其死亡率仍在 35-40 % 左右。以 2003 年引發人類嚴重呼吸道症候 (SARS) 的新型冠狀病毒為例，當此病毒進入宿主的下呼吸道後，激活人體的免疫系統，尤其是 CD8-T cell 對冠狀病毒感染的呼吸道上皮及單核球細胞產生過強的免疫反應，初期肺泡內吞噬細胞增加，第二階段為瀰漫性 ARDS，又稱為激素風暴期 (cytokine storm)，發炎細胞 (淋巴球、單核球和噬中性球) 聚集、釋放趨化物質及微血管通透性上升，發炎細胞及血漿滲出至肺泡，引發肺水腫及造成肺泡上皮細胞及肺 18.

(31) 泡微血管內皮細胞損傷，患者之換氣功能受阻，缺氧甚而呼吸衰竭致死。第三期為發炎細胞活化後釋放大量之細胞激素造成纖維母細胞 (fibroblasts) 增生，此後多發展成肺部纖維化病變(3, 57, 58)。三、免疫細胞在肺纖維化扮演的角色肺纖維化是許多原因的肺損傷後不正常的組織修復結果。任何的損傷刺激都起始於發炎、免疫系統啟動，到最後完成於組織修復。IPF 病人和實驗動物肺損傷模型的組織都發現有許多的免疫細胞出現在發炎部位，包括最先出現的 neutrophils 及被趨化而至的 monocyte/macrophage 、 lymphocytes 和 eosinophils (附圖4)。其中 macrophages 和 monocytes 是 fibrogenic cytokines、chemokines 和 growth factors (TNFα, TGFβ, PDGF 和 MCP-1) 主要的來源細胞(53)。這些免疫細胞本身及其所釋放的介質對肺上皮組織造成輕重不一的傷害，也與纖維化發展關係密切(附表1)。. 附表1. Major mediators expressed by lung cells and their potential roles in repair and fibrosis.(59). 19.

(32) 1. 嗜中性白血球 (Neutrophils) 在宿主免疫反應中，polymorphonuclear leukocytes neutrophils (PMNs) 通常是最快抵達感染部位執行吞噬功能的白血球。此外，PMNs 製造許多 cytokines, chemokines 和 growth factors，如 IL-1, IL-6, IL-8, MIP-2, TNFα, granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), arachidonic acid metabolites, proteases, reactive oxygen metabolites (ROMs) 和 neutrophilsderived complement fragments 等(60,. 61 ). 。在 PMNs 細胞膜上的接受器 (如. heterotrimeric G protein-coupled seven-transmembrane receptor) 可與 C5a, platelet-activating factor (PAF) 及CXC chemokines family 結合後引發一連串的趨化反應。PMNs 對 parenchymal cells 具有相當程度的破壞力，它會分泌 MMP9 (Gelatinase B), acid hydrolases, low-molecular-weight cationic proteins, ROMs 和 lipid secretory products，這些分子會破壞 parenchymal cell 並促使 ECM 降解 (62) 。在許多的研究中發現 IPF 病人肺沖洗液 (bronchoalveolar lavage; BAL) 中 PMNs 的含量與症狀嚴重程度有正相關性而降低 PMNs 的治療策略也可以延緩纖維化的發生。這些研究顯示 PMNs 在肺泡的發炎反應轉變為纖維化時扮演重要的媒介角色(63)。 2. 肺巨噬細胞 (Alveolar Macrophages) 血液單核球細胞遷移到肺部後分化成具防禦功能的肺巨噬細胞，近年來有許多研究在探討肺泡巨噬細胞的生理功能，包括肺部免疫失調、癌細胞毒殺作用、發炎及纖維化病變。分布在不同區域的肺巨噬細胞功能略有不同，在正常人的肺，分布在肺泡內、氣道及上皮表層與吸入空氣充分接觸的稱為肺泡巨噬細胞 (alveolar macrophages; AMs)，AMs 主要負則第一線的病原菌毒殺及分泌細胞激素以啟動後續免疫活化等功能，最後 AMs 也會分泌 IL- 10 以防止過度發炎及非必要的免疫反應，維持肺泡正常生理功 20.

(33) 能。間質巨噬細胞 (interstitial macrophages; IMs) 分布在隔開肺泡的間質組織，IMs 體積較 AMs 小，吞噬力也較弱，但因細胞表面較多的 MHC Class II 和CD54 表現，對 T-cell 有較強的 antigen presenting capability (64)。肺損傷或發炎時，受單核細胞趨化，從幹細胞分化而來並大量增生的肺巨噬細胞會使肺泡間質增厚，活化的肺巨噬細胞分泌大量的促纖維化細胞激素 (TGF-β1, TNF-α, MCP-1 和 insulin-like growth factor; IGF-1)；刺激周圍 epithelial, endothelial 和 mesenchymal cells 釋放其它纖維化細胞激素，同時作用於纖維細胞增生和 collagen deposition (65, 66)。研究指出肺巨噬細胞對細胞外間質形成/降解的平衡與氣喘或肺纖維化疾病有某些關聯，肺巨噬細胞分泌的降解酵素 (MMPs, serine, cystine protease 和 acid hydrolases；主要是 MMP-1, MMP-2 和 MMP-9) 可分解 collagen 和 elastin 等 ECM 蛋白(67)。肺巨噬細胞受 cytokines 和 growth factors (尤其是TGF-β)刺激時也會分泌降解酵素抑制劑 TIMP 以利組織重建(68)。通常在 IPF 病人 TIMPs 會有較高的表現。MMPs/ TIMPs 失衡是造成細胞外膠原蛋白過度堆積甚至纖維化的重要因素。直到近幾年對於肺巨噬細胞的功能才逐漸明瞭，目前已知肺巨噬細胞具有遷移到肺損傷或發炎部位並參與組織修復工作，但對於它如何參與纖維化的發展仍有許多問題有待進一步研究。 3. 淋巴球 (Lymphocytes) 淋巴球可區分自身物質和外來的物質。 T 細胞會附著在攜有抗原的細胞上，並且直接和這些細胞相作用；而 B 細胞藉著分泌抗體(antibodies) 間接地對付抗原，抗體由體液攜帶並以許多不同的方式破壞特定的抗原或攜有抗原的物質。免疫系統中有兩種主要 T 細胞，分別是毒殺性 T 細胞 (cytotoxic T cell)及輔助性 T 細胞 (helper T cell)，它們皆含有 α鏈及 β 鏈 21.

(34) 所組成的 T 細胞接受器 (TCRs)，並用它來辨認細胞上的組織相容性分子及抗原所形成的複合體 (MHC-Ag)。二者所不同的是：毒殺性 T 細胞以 αβT 細胞接受器及 CD8 輔助接受器來辨認標的細胞 (target cells)上的第一型組織相容性分子 (MHC-I) 及抗原，並分泌各種因子 (例如perforin)來攻擊並破壞這些標的細胞(例如，受微生物感染的細胞或腫瘤細胞)。而輔助性 T 細胞則以 αβT 細胞接受器及 CD4 輔助接受器來辨認抗原呈現細胞 (APCs) 上的組織相容性分子 (MHC-II) 及抗原，並分泌介白質(interleukins) 以刺激這些抗原呈現細胞(如 B 細胞或毒殺性 T 細胞)分裂現象並製造抗體及 T 細胞接受器，用以去除外來抗原(69,. 70). 。近年來也有研究討論關於. T-helper (Th) 淋巴球分泌的細胞激素與纖維化進展的關係，T-helper (Th) 淋巴球可分為二群，Th1 細胞分泌 IL-2, IL-12, IL-18 和 interferon-γ (IFN-γ)； Th2 細胞分泌 IL-4 , IL-5, IL-10 和 IL-13。 Th1 clones 媒介 delayed-type 過敏反應並與自體免疫疾病有關，升高體內 IgG2a 濃度而非 IgE。 Th2 clones 刺激 B cells 產生IgE ，與氣喘等過敏反應及 IPF 等慢性纖維化病變 (chronic fibro-proliferative disorders) 有關。IPF 病人的肺組織相對有較高的 Th2 cytokines 表現及較少的 Th1 cytokines ( 例如 anti-fibrotic cytokines-IFN-γ 的表現減少) 造成 collagen deposition(71)。因此，Th2 /Th1 的失衡也是與慢性纖維化病變進展的原因之一。四、肺泡上皮細胞 (AEC) 與肺纖維化除了免疫細胞之外，肺實質細胞(尤其是肺泡上皮細胞)除了作為肺損傷的主要標的，同時也參與發炎反應(72)。大量的組織學觀察發現慢性纖維性肺泡炎病人的肺泡上皮 (Type I 和 Type II) 細胞有非常明顯的變化， Type I 肺泡上皮細胞被破壞而減少肺泡表面活性物質的製造及運轉，導致肺泡萎縮和塌陷；Type II 肺泡上皮細胞增生並重新分布於裸露的基底膜之. 22.

(35) 上使肺泡壁間質變厚(73)。肺泡上皮屏障的損壞將使得造成肺纖維化的前驅物質更容易移位至肺泡內，最後上皮細胞會被大量的纖維母細胞及平滑肌細胞取代，使得修復的過程朝向肺纖維化發展。肺泡上皮細胞受到細胞激素及 ECM components 的調控，自己也會製造 IL-8,MCP-1,GM-CSF, adhesion molecules,proteases,surfactant proteins 和 ECM components。在實驗動物的觀察中發現，急性肺損傷初期嗜中性白血球劇增，隨後而至的巨噬細胞和淋巴細胞聚集在肺泡壁(72)，分泌大量的 mediator 刺激纖維母細胞增生及 ECM 沉積。如果發炎現象沒有結束或被抑制，這些發炎細胞及其分泌物就會對肺泡上皮造成傷害。在某些嚴重或大面積的損傷，肺泡上皮被取代而無法再生，正常的組織修復及結構復原便無法完成，也因此產生纖維化組織 (附圖4)。雖然大部分的肺纖維化研究都聚焦於發炎反應、纖維母細胞的活化和 ECM 沉積，近年來從解剖學及動物實驗都發現 Type II 肺泡上皮細胞增生為 IPF 的病理特徵之一(47, 51, 56)；許多 IPF 病人以抗發炎藥物或免疫抑制劑 (steroids and/or immunosuppressive drugs) 治療並無明顯改善。因此AECs在損傷/發炎之後的 dysregulated repair、 abnormal mesenchymal cell activation 都扮演重要角色。近來有許多研究都指出. AECs 具有. epithelial-mesenchymal transition (EMT) 的能力，在 TGF-β 刺激下會轉變為具 myofibroblast phenotype 的細胞，證明了纖維化時期 AECs 也可作為 myofibroblast 的來源細胞(74-76)。在胚胎發育期間 EMT 促使細胞移動以形成新的器官(77, 78)。 EMT 的轉變代表細胞從原本上皮細胞 (epithelial cell) 分化成具有爬行能力的 mesenchymal cell。細胞進行 EMT 時，cell junctions 發生變化，原本緊密連接的細胞彼此脫離並失去上皮細胞該有的極性 (epithelial polarity)，新的結構蛋白(vimentin 和 α-smooth muscle actin; α-SMA) 產生，改變了細胞的 23.

(36) 形態並增加爬行能力 (migration)，因此從外觀型態 (e.g. change from a cuboidal cell shape to an elongated or spindle-shaped form) 及一些 epithelial markers (E-cadherin) 和 mesenchymal markers (vimentin 和 α-SMA) 的表現即可觀察 EMT 的變化。在各種器官的纖維化也可觀察到 EMT 的進行，例如:在腎性糖尿病患者的腎小管間質部纖維化病灶發現 renal proximal tubular cells 的 α-SMA 表現明顯增加(79, 80)。 EMT 會在 epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factors (FGF) ，尤其是 TGF-β 及 extracellular matrix components (通常是collagen ) 刺激下進行。包括肺纖維化的在內的器官纖維化過程中，TGF-β 被認為具 “master switch” 的能力，是促進 EMT 及造成纖維化的主因(81,. 82). 。肺泡上皮細胞細胞膜表面的 TGF-β 接受器與. 活化態的 TGF-β 結合後會活化細胞內的轉錄因子 Smad proteins，引發下游基因轉錄調控或活化其它轉錄因子 ( 如 Slug, Snail, Scatter, lymphoid enhancing factor-1 和 β-catenin)(83) 。這些轉錄因子都與 “EMT proteome” (junctional disassembly, cytoskeletal rearrangement 和 cellular motility) 的調控有關(84)。綜合以上所述，肺泡上皮細胞在纖維化的過程中不再是被動的旁觀者，Adamson 等人認為持續的 AEC injury 和遲緩的上皮修復都是促進纖維病變的原因(72,. 85). 。分化後的 AEC 不但沒有促進組織再生及修復功能，. 還會製造多種的 profibrotic cytokines，與相鄰的纖維細胞組成聯繫的網路，促進彼此的 proliferation/survival 及功能。. 24.

(37) 附圖 4. Summary of cellular and cytokine networks in chronic stages of lung injury and fibrosis.(59). 25.

(38) 五、肺纖維母細胞 (Lung fibroblasts)、肌纖維母細胞 (Myofibroblasts) 與肺纖維化雖然肺纖維化的成因各異，但異常的 ECM 蛋白沉積破壞了正常的組織結構是共同的特徵，而這些 ECM 蛋白即是由佔據纖維化區域的一群 mesenchymal cell 所製造(86)。肌纖維母細胞是一種型態上介於平滑肌細胞和纖維母細胞並大量表現 α-SMA 的 mesenchymal cell，出現在損傷部位負責傷口的癒合，並製造大量的 ECM 蛋白以修補受損區域。正常狀態下，肺纖維母細胞少量地分布在組織間隙，損傷訊號或發炎激素的趨化會使附近或血液中的 fibrocytes 聚集到受損部位 (87) ，這些具有 proliferation marker-positive nuclei 的纖維母細胞快速增生或分化為具 stress fiber 的肌纖維母細胞(附圖5)。在不正常的組織修復及纖維化區域都有大量的纖維母細胞和肌纖維母細胞的分布。肺纖維母細胞和肌纖維母細胞分泌 matrix degrading enzymes 以分解受損組織，也同時合成新的 matrix 填補空缺 (附圖6)。相較於其它肺部細胞，肺纖維母細胞主要功能為損傷後的組織修復工作，因此較能抵抗各種傷害而存活。在正常的傷口癒合過程肌纖維母細胞會逐漸減少，肺纖維化的進展表示正常的傷口癒合動作無法停止，肌纖維母細胞持續地表現。在正常的情況下，肌纖維母細胞是經由 apoptosis 途徑消失 (88)，in vitro 研究發現在纖維化老鼠的肌纖維母細胞由 IL1β-induced apoptosis 相關的 antiapoptotic protein Bcl-2/proapoptotic protein Bax 表現與正常老鼠的肌纖維母細胞不同，顯示它有較強的抗凋亡能力(89)。此外， TGF-β1 可促進肌纖維母細胞分化和增生，在 bleomycin-induced pulmonary fibrosis model 發現阻斷 TGF-β1 signaling 也會減少肌纖維母細胞的數量 (90). 。. 26.

(39) 許多 growth factors 和 cytokines 會調控 fibroblasts 的遷移、增生、分化和 ECM 的合成/分解，而這些 fibrogenic cytokines 多半也是 fibroblasts 自己活化後所分泌的。纖維母細胞和肌纖維母細胞在纖維化的過程中扮演的角色越來越受重視，不僅如同發炎細胞一樣會分泌多種 fibrogenic mediator，而且是 ECM 的主要製造者。有許多的 fibrogenic cytokines，像 TGF-β, PDGF, GM-CSF, FGF, TNF-α, IL-4 和 IL-13，會增加 α-SMA 及 ECM 蛋白的表現，其中 TGF-β 是最重要的一種，而 IFNγ 和 IL-1β 則會減少 α-SMA 及 ECM 蛋白的表現(91-93)。. 附圖 5. TGF-β1 induced myofibroblasts differentiation.(94). 27.

(40) 附圖 6. Summary of the key pathogenetic mechanisms of fibroblast and myofibroblast in lung injury and fibrosis.(59). 28.

(41) 六、胞外間質蛋白與損傷修復肺組織的 extracellular matrix (ECM) 由 collagen (尤其是 types I, III), elastin, proteoglycan, fibronectin 及少量其它蛋白所組成。肺損傷會破壞 ECM 結構，之後的修復與重建 (repair and remodeling) 工作極為重要，包括巨噬細胞、肺泡和支氣管上皮細胞、內皮細胞和纖維母細胞都能製造 ECM components。為了填補損傷造成的空洞，AEC 快速的增生或分化並重新分布到裸露的區域形成新的障壁；同時也經由活化 anti-fibrinolysis 系統促進血塊形成。在正常的情況下，fibrinolytic 系統也會同時啟動以形成細胞爬行的通道。在肺纖維化時，AEC 高度表現 potent procoagulant factor 和 plasminogen activator inhibitor (PAI-1, PAI-2)，將不利於細胞的爬行及修補功能，不正常的組織修復會使傷口結痂及纖維化。此外，發炎細胞分泌的發炎激素、 chemokines、生長激素和間質分解蛋白酶 (例如 MMPs) 會促使纖維細胞聚集、增生和分化。 AEC 和肌纖維母細胞分泌的 MMP-2 和 MMP-9 (gelatinase A 和 B) 會加劇基底膜 (尤其是 type IV collagen) 的破壞，有利於 fibroblast/肌纖維母細胞爬行、增生和新產生的 ECM 堆積(95)。在 IPF 病人肺組織可觀察到分布在基底膜損傷區域的肌纖維母細胞有高度的 MMP-2 和 MMP-9 表現。不正常的組織修復造成纖維化也代表正常肺組織的功能被這些沒有功能的結締組織取代。基質金屬蛋白酶 Matrix Metalloproteinases (MMPs；zinc dependent matrix degrading proteinases) 為分解 ECM 的一群具有共同基本型態的蛋白水解酶，在人類 MMPs family共有 23 個成員，MMPs 可根據其結構及受質類型被分類。最重要的一類包括: collagenases, gelatinases, stromelysin, matrilysin 和 membrane-anchored MMP [membrane- type (MT)-MMP] MMPs 會以 inactive proenzymes. (96). 。. 被分泌，到了細胞外再被切成活性片. 29.

(42) 斷，細胞也會分泌 TIMPs1-4 抑制 MMPs 的活性，換言之 MMPs 的活性被 TIMPs 精密地監控著，以維持正常組織的恆定狀態(97)。包括 neutrophils, AMs, AEC 和肌纖維母細胞在內的許多細胞分泌不同功能的 MMPs /TIMPs 到細胞外，與 ECM, integrins, growth factors 和 parenchymal cells 密切的合作以維持正常狀態的肺組織結構與功能。肺在急性或慢性發炎發生後，MMPs 的表現增加對修復期的再上皮化(re-epithelialization)來說非常重要。最近的研究發現，在 IPF 病人肺組織 TIMPs 表現高於 MMPs，這使肺組織處於非分解性膠原纖維的微環境。此外， TGF-β 會透過抑制纖維母細胞的 MMP-1/ MMP-2、增加 TIMP 的合成與分泌以減少膠原纖維的分解，所以 MMPs /TIMPs 的調控失衡也是造成組織纖維化的原因之一(96, 98)。七、TGF-β1 與肺纖維化 1. TGF-β 結構及活化的調控乙型轉型生長因子(TGF-β) 是一群多功能的細胞激素，至今以有超過40 個家族成員被發現 (99,. 100). ，TGF-β superfamily 分為三大類：TGF-β family,. bone morphogenetic protein (BMP) family和activin family，它們具有共同的結構、類似的訊息傳遞路徑和重疊的生物活性。在哺乳類生物有三種已知的 TGF-β isoforms (TGF-β1-3)被確認，其中TGF-β1與肺纖維化的關係最為密切。TGF-β1與 latent TGF-β binding proteins (LTBPs)結合成 latent precursors complex 分泌(101)，與 latency-associated protein (LAP)形成大複合物結合於胞外基質(102) (附圖7)，經過活化的 TGF-β1才能產生生理活性。在體外， latent form TGF-β1 可經加熱酸化處理而被活化；在生物體中至少有三條活化路徑：(1)主要的活化路徑，是透過與 epithelial cell integrin αvβ6 結合造成結構變化而產生活化態的 TGF-β1 ，作用於鄰近細胞的 TGF-β1 receptors，(附圖8) (2) 與 matrix protein thrombospondin-1 (TSP-1) 結合，(3) 30.

(43) 被蛋白酶 (plasmin, MMP2, MMP9, elastase, or cathepsins) 分解成活化態 TGF-β1 (附圖9)(103-105)。TGF-β1 分泌及作用的調節不僅取決於轉錄、轉譯、分泌和活化等環節，還受 TGF-β1 接受體的數量及其他細胞激素的相互作用等複雜因素影響。 TGF-β1 能發揮各種調節功能有賴於其在細胞膜表面的專一性受體，至今已發現三種與 TGF-β1具高親和性的受體：TβRI、TβRII 和 TβRIII， TGF-β1 必需同時與 TβRI 和 TβRII 結合才能將訊息往下傳遞。TβRI 和 TβRII 均為穿膜的 serine/threonine kinase receptor ，TβRI 又稱為活化素受體激酶 (avtivin receptor like kinases, ALKs) (附圖10)，其位在細胞質內近膜區的 serine/threonine kinase domain 能被 TβRII 磷酸化，TβRII 則具有自我磷酸化的功能。當活化態的 TGF-β1 與標的細胞膜上的 TβRII 結合使其自我磷酸化，接著靠近並活化相鄰的 TβRI。被活化的 receptor complex接著將下游的receptor-regulated Smads (R-Smad; Smad2 and 3 for TGF-β/activin) 在 MH2 domain 的 C-terminal serine residues SXS (S465/S467) (106). 磷酸化. ，促使 common mediator Smad (Co-Smad; Smad 4) 與 R-Smad結合成. heterodimer，被活化的 R-Smad/Co-Smad complex 隨即 translocates 到細胞核，與 co-activators 或 co-repressors 結合共同調控下游分子的轉錄表現 (107). 。此外，inhibitory Smad (I-Smad; Smad6 and 7) 透過分解 TβRI 而減弱. TGF-β1 的訊號傳遞(附圖11)。雖然大多數學者公認 Smads 蛋白是細胞內負責將 TGF-β1 刺激所產生的訊息傳遞至細胞核的傳遞者，但也有其它的傳遞路徑被討論過，例如在 primary intestinal cells lines ， TGF-β1 會活化. epithelial cells 和 breast cancer. Ras, extracellular signal-regulated kinase. 1/2(ERK1/2) 和 c-Jun N-terminal kinase (JNK)；在murine mesengial cells， TGF-β1 會活化 protein kinase A (107)。. 31.

(44) 2. TGF-β 的生理功能 TGF-β 家族成員對許多的組織和器官有著廣泛的生理作用，它們參與細胞各項的活動包括細胞生長、認知、分化、凋亡、胚胎發育期及成熟組織的特化(100,. 108). ，TGF-β 成員中以 TGF-β1 與組織癒合的關係最為明確，. 很多不同種類的細胞都能製造 TGF-β1來調控細胞的生長、分化和增加胞外間貭蛋白的分泌。在正常的生理環境中，TGF-β1 經由調控細胞週期相關分子的表現而抑制細胞生長，例如：cyclin kinase inhibitors p15INK4b, p21CIP1和 p27KIP(109) ；此外 TGF-β1 也會經由Smad-dependent 或 Smad- independent pathway (包括MAPK pathway 和 PP2A/p70S6 kinase pathway) 抑制細胞生長(109)。在正常細胞，TGF-β1 通常會透過增加胞外間質分泌及抑制其分解而促進細胞的黏著(99)。TGF-β1 在癌細胞發展的不同時期有不同的調控. (105,. 110). ，在早期，TGF-β1 扮演抑制者的角色抑制癌細胞分裂；當癌細胞進入生. 長抑制抵抗期而快速發展時，TGF-β1 則會製造利於癌細胞增生及轉移的微環境，一旦進入惡性期，TGF-β1 就對癌症的發展與轉移產生很大的影響。在許多器官的癌細胞都可發現 TGF-β1 大量的表現，大部分的研究也認為 TGF-β1 透過增加 MMP 和 uPA 的表現促進癌細胞的侵潤。例如在癌化的上皮細胞發現，TGF-β1 透過活化 Smads (83) 或MAPKs (111) 使 MMP2 和 MMP9 的表現增加；在人類卵巢癌細胞發現，TGF-β1 透過活化 Src 或 Smad 增加 uPA 和 PAI-1 的表現. (112, 113). 。. 32.

(45) 3. TGF-β1 與肺纖維化 TGF-β1 由血小板、巨噬細胞和內皮細胞等產生，它能促進纖維母細胞趨化、產生膠原 (collagen I, III, IV, V) 和纖維連接蛋白並抑制膠原降解，對器官纖維化有重大的影響 (114) 。 TGF-β1 刺激周圍細胞分泌 fibrogenic cytokines (例如 TNF-α, PDGF, IL-1β 和 TGF-β1)，TGF-β1 本身可促使肌纖維母細胞分化，並透過 PDGF 刺激纖維母細胞增生；透過 IL-1β 抑制纖維母細胞凋亡。TGF-β1 造成胞外膠原沉積的原因如下：(1)增加纖維母細胞 collagen、fibronectin、proteoglycans 和其它 ECM components 的mRNA表現，(2)抑制 plasminogen activators、 MMPs 和 elastase 的表現並增加 TIMPs、PAI-1 和 PAI-2 的表現以減少新產生的 ECM 降解. (98, 115). 。從. 肺纖維化病人及實驗動物的肺組織都發現活動病灶內有有高度 TGF-β1 表現；給予 TGF-β1 抗體可減緩纖維化的程度(116,. 117). ，且不會引起明顯的免. 疫干擾(118)。因此，以 TGF-β signaling pathways 為靶點的治療策略將是研發抗纖維化藥物很重要的一個方向. (119). 33. 。.

(46) 附圖 7. Synthesis and organization of latent complexes of TGF-β. (102). 附圖 8. Model of the consequences of αvβ6 integrin-mediated activation of TGF-β by alveolar epithelial cells.(102). 34.

(47) 附圖 9. Pre- and postreceptor regulation of TGF-β1 signaling. Latent TGF-β1 can be activated by proteases (such as MMPs, plasmin) and by binding to TSP-1 or the integrin avb6, expressed on epithelial cells.(120). 35.

(48) 附圖 10. Signaling specificity in the TGF-β superfamily. Classification of the mammalian Smad signaling cascade into activin/TGF-β and BMP pathways. (121). 36.

(49) 附圖 11. Mechanism of signal transduction mediated by TGF-β.(122). 37.

(50) 八、國內外有關肺纖維化治療之研究 1. 中醫對肺纖維化的研究中醫認為本病屬於肺痹的範疇，“痹＂有痹阻之義，本病是正氣本虛反復外感，邪舍於肺，肺氣痹阻而成。肺痹一病，其病名始見於黃帝內經，認為皮痹不愈，反復感邪，內舍於肺，發為肺痹，素問·痹論：“肺痹者，煩滿，喘而嘔。“淫氣喘息，痹聚在肺＂。現代中醫對肺痹進行了較為深入的研究，對肺痹的概念、證候特點、病因病機、診斷依據、治療方法進行了較為系統的論述。該病呈慢性進展，臨床表現出急性發作期和緩解期；感染常為急性發作的誘因又是病情加重的條件。急性發作期(肺泡炎期)病程較短，以肺泡炎症滲出為主，中醫辨證多屬實證，以痰、瘀、熱、毒等阻滯肺絡最為常見。在間質纖維化期(慢性遷延期)，肺泡間隔多有纖維結締組織增生和纖維化形成，病程日久，遷延不愈，病機多屬因實致虛，絡虛不榮，虛實夾雜，以氣虛血瘀痰阻之證最為常見，辨證治療常選擇現代藥理中具有明確的逆轉肺纖維化的藥物及具有調節免疫功能的藥物相結合。通肺活血主要應用生黃耆、金銀花、當歸、丹參、鬱金、旋覆花等藥，傳統藥性認為生黃耆“補五臟諸虛＂，在這裏還取其“能通調血脈，流行經絡…＂的作用。現代藥理研究還指出生黃耆、當歸皆可調節免疫功能，其中生黃耆、丹參有逆轉肺、肝纖維化的作用。臨床可結合不同患者的病情隨症加減治療。中醫認為分期論治及活血化痰通絡是肺間質纖維化的根本大法，肺絡痹阻是肺間質纖維化的基本病機特點，但在不同時期其病機發展重點則有所區別。急性期：常因外感六淫誘發，以痰、瘀、熱、毒等阻滯肺絡最為多見。因此，解表化痰通絡和清熱利濕解毒、活血化痰通絡為肺纖維化急性期常用之法。 (1) 解表化痰通絡：肺纖維化常因外感六淫誘發、加重和惡化，尤以風寒襲肺、風熱犯肺、風燥傷肺之證最為多見。 “絡以辛為泄＂，因此若因風寒襲肺誘發者，治以辛溫解表、散寒通絡， 38.

(51) 小青龍湯加減，藥如炙麻黃、桂枝、白芍、乾薑、細辛、五味子、制半夏、厚朴、杏仁、甘草等。若因風熱犯肺誘發者，治以辛涼解表、化痰通絡，銀翹散加減，藥如金銀花、連翹、荊芥、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、桃仁、杏仁、漏蘆等。 (2) 清熱利濕解毒，活血化痰通絡：肺纖維化急性期痰濕內阻，鬱而化熱，蘊久成毒，毒瘀阻絡而為肺痹。因此，清熱利濕解毒，活血化痰通絡為肺纖維化急性期常用治法。藥如全栝樓、黃芩、清半夏、當歸、浙貝母、苦參、連翹、郁金、牡丹皮、丹參等。慢性遷延期：絡虛不榮，虛實夾雜為慢性遷延期病機特點。“大凡絡虛，通補最宜＂(葉天士引臨證指南醫案)，故通補兼施，寓通於補為肺纖維化慢性遷延期總的施治原則(123, 124)。 (1) 益氣活血，化痰通絡：肺纖維化反覆發作，遷延不愈，終致氣虛、血瘀、痰阻，本虛標實，虛實夾雜。氣虛血瘀痰阻為肺纖維化慢性遷延期最常見證候之一，故益氣活血、化痰通絡法為肺纖維化慢性遷延期的主要治法。藥如黨參、黃耆、赤芍、川芎、地龍、桂枝、法半夏、旋覆花、皂角刺、白芥子等(125)。(2) 益氣養陰，化瘀解毒通絡：放射性肺炎以及彌漫性間質性肺病長期應用糖皮質激素後易出現氣陰兩虛，瘀毒阻絡證候。因此，益氣養陰，化瘀解毒通絡為其常用治法。藥如太子參、沙參、麥冬、五味子、百合、當歸、丹參、牡丹皮、浙貝母、海蛤殼等(126)。中醫重視整體治療，善於通過調整整個機體功能治療疾病。對於肺纖維化，在採用”活血化瘀”法的同時，兼顧 ”扶正、補虛、健脾、益氣” 和 ”補腎” 等措施，往往能提高抗纖維化的療效。. 39.

(52) 2. 西醫治療藥物肺纖維化是一種進行性且不可逆的疾病，至今尚未有任何藥物可有效阻止其病程進展。肺纖維化的傳統治療包括類固醇單獨或併用免疫抑制劑，類固醇在肺泡炎性期可能有效，但在廣泛間質纖維化期則難有改觀(127)。目前關於肺纖維化的治療研究最多的是針對肺泡巨噬細胞所分泌的細胞激素及拮抗劑，如 IL-1、 TNF-α、 TGF-β 和 IFN-γ 等(128, 129)。另外，直接抑制纖維母細胞增生的藥物，如 pirfenidone，在 bleomycin 引發的肺纖維化實驗中可減輕實驗老鼠的肺纖維化，in vitro 實驗中可降低纖維母細胞產生 TGF-β1 並減少細胞外膠原蛋白的沉積(130, 131)。由於西方醫學對肺纖維化複雜的過程及機轉越來越清楚，也認為不同的病理階段可能需要不同的治療策略，與中醫講求的＂分期論治＂之治療原則不謀而合。近年來也有許多的中草藥被用在治療肺纖維化的研究，例如，從中藥雷公藤抽取出之成分 PG-490-88 具有免疫抑制的作用，在發炎期或發炎後期治療實驗動物的肺纖維化均有成效，同時有抗發炎及抗纖維化的作用(132)。因此，經由對疾病機轉充分的瞭解將有助於證明傳統中醫藥的有效性。. 40.