Part A 以活體動物及離體細胞模式評估木犀草素抗肺纖維化作用 及分子機轉探討
一、木犀草素減少 bleomycin 引發之急性期肺炎
肺灌洗液中的發炎細胞數量的增加可反應出急性肺損傷之後產生的肺 部發炎程度。我們也從從小鼠肺灌洗液中的發炎細胞數量來評估木犀草素 對於 bleomycin 引發急性期肺炎之抗發炎效果。在 bleomycin 造模後第3 天，肺灌洗液中的發炎細胞總數明顯增加，到了第 7 天發炎細胞總數激增 為原來的 5 倍之多(Table 2)，以木犀草素或類固醇藥物治療組的老鼠，在 整個期間肺灌洗液中的發炎細胞總數都比 bleomycin 組少，在第 7 天減少 程度最為明顯 (2.28 ± 0.17 / 1.35 ± 0.11 x105)。以細胞分群所佔的比例來 看，木犀草素可明顯減少 bleomycin 造成的嗜中性白血球增加 (21.07 ± 2.43 / 14.4 ± 2.99 %)。
急性肺炎的另一項指標為肺灌洗液中早期發炎細胞激素的激增，尤其 是 TNF-α 和 IL-6。從 ELISA 分析結果發現，在 bleomycin 造模後第 3 天，IL-6 濃度增加為正常的 3 倍 (Figure 1B)；在 bleomycin 造模後第 7 天，TNF-α 濃度增加為正常的 4 倍多 (Figure 1A)，而木犀草素治療組明 顯地降低由 bleomycin 引發的 TNF-α 和 IL-6 釋放，與類固醇藥物治療組 相較並無明顯差異。
直接從 H&E 染色的小鼠的肺組織切片也可以觀察肺損傷程度。在 bleomycin 造模後第 7 天，大量的單核球浸潤，佔據了大部分的肺泡與間 質，也破壞了正常的肺實質結構，到了第 14 天，單核球浸潤現象略為減 緩。木犀草素治療組可減少單核球的聚集，保留肺組織的完整性，類固醇
草素治療組受到的破壞較少，與類固醇藥物治療組相較並無明顯差異 (Figure 2)。
二、木犀草素減少 bleomycin 引發之肺纖維化
在 對 木 犀 草 素 的 抗 肺 纖 維 化 作 用 進 行 評 估 之 前 ， 首 先 要 瞭 解 由 bleomycin 造成小鼠肺纖維化的病程進展。 Figure 3A 為 bleomycin 造模 後經過不同天數的 Masson’s Trichrome 染色病理切片，紅色部分為正常的 細胞構成的肺組織結構，藍色部分為膠原蛋白的沉積。正常的肺組織及肺 泡結構完整，bleomycin 造模後第 3 天肺泡開始被大量的發炎細胞佔據，
第 7 天時，肺泡間隔明顯加寬，可見數量不等的纖維組織增生伴有些微的 膠原產生；到了第 10 天，膠原蛋白明顯增加；到了第 14天，肺泡間隔可 見大量增生的上皮細胞，並有為數不少的巨噬細胞散布在肺泡中(Figure 3B)，肺泡間質累積大量的膠原蛋白(Figure 3C)；第 21 天，肺泡壁被大量 沉積的膠原蛋白瓦解，肺泡塌陷，形成局部的纖維化病變 (focal fibrotic lesions)。
接著進行木犀草素的抗肺纖維化作用評估，並參照實驗方法中所述之 量化標準進行統計(Figure 4)。實驗分為二部分:(1)早期給藥療程:於造模後 隔天每日以胃管餵食藥物；(2)後期給藥療程: 於造模後第 10 天才開始每 日以胃管餵食藥物。從第 21 天的組織病理切片圖發現，在早期給予木犀 草素治療的小鼠的肺組織纖維化現象明顯比 bleomycin 造模組輕微許多 (Figure 5A)，膠原沉積的面積和密度也比較小，統計所有切片的肺纖維化程
度量化值顯示，早期給予木犀草素治療可以預防肺纖維化的產生 (Mean
fibrosis score, p<0.001 vs. BLM)；早期給予傳統的抗發炎藥物類固醇也有 相近的效果 (p<0.01 vs. BLM)。在造模後第 10 天也就是膠原沉積已形成之 後才開始給予木犀草素治療，對肺纖維化也有明顯的改善 (Figure 5B)
(Mean fibrosis score, p<0.01 vs. BLM)；後期的類固醇治療效果則較不明顯 (p<0.05 vs. BLM)。
膠原沉積是肺纖維化的重要指標；促纖維化激素 (profibrotic cytokine) TGF-β1 的高度表現也對纖維化有很大的促進作用。我們也從小鼠肺組織的 膠原沉積量和 TGF-β1 基因表現來評估木犀草素對肺纖維化的改善程度。
在 bleomycin 造模後 21 天，肺組織的膠原蛋白量明顯增加為正常的 5 倍，早期給予木犀草素治療可以明顯減少肺組織的膠原蛋白量 (Figure 6A) ( p<0.001 vs. BLM)；早期給予類固醇也有相近的效果 ( p<0.01 vs. BLM)。
在造模後第 10 天才開始給予木犀草素治療，也可以減少肺組織的膠原蛋 白量 (Figure 6C) ( p<0.01 vs. BLM)；後期的類固醇治療則無法減少肺組織 的膠原蛋白量。在肺組織的 TGF-β1 基因表現部分，早期給予木犀草素治 療可以明顯減少肺組織的 TGF-β1 mRNA 表現量 (Figure 6B) ( p<0.001 vs.
BLM)；在造模後第 10 天才開始給予木犀草素治療，也可以減少肺組織的 TGF-β1 mRNA 表現量 ( Figure 6D ) ( p<0.01 vs. BLM)；晚期類固醇治療與 早期類固醇治療一樣，對肺組織的 TGF-β1 mRNA 減少程度較不明顯 ( p<0.05 vs. BLM)。 這些結果提供了更多的證據證明木犀草素不僅在肺損 傷的急性期有良好的抗發炎作用，在纖維化已形成的階段也有明顯的改善 效果。
三、木犀草素抑制小鼠肺纖維母細胞的生長分化與分泌 ECM
從動物實驗結果得知木犀草素有良好的抗肺纖維化作用，為了能更確 認木犀草素抑制肺纖維化的作用機轉，我們對一些參與肺纖維化的細胞進 行分析。肺纖維母細胞在纖維化起始及進展過程中扮演相當重要的角色，
它會分泌多種 fibrogenicmediator，而且是 ECM 的主要製造者，肺纖維母 細胞在 TGF-β1 的刺激下，會增加 α-SMA 及 ECM 蛋白的表現，也會進
一步分化成肌纖維母細胞，分泌更多的 fibrogenicmediator。
我們從小鼠的肺分離出肺纖維母細胞，繼代培養純化後，以不同濃度 木犀草素 (10, 25, 50 μM) 單獨處理肺纖維母細胞，從 72 小時的生長曲線圖 中可發現，木犀草素對肺纖維母細胞有生長抑制作用，而且有劑量依存效 應 (Figure 7)。25 μM 的木犀草素幾乎可完全地抑制細胞的生長；50 μM 的 木犀草素並不會對肺纖維母細胞造成傷害。
木犀草素除了能有效抑制肺纖維母細胞的生長，對纖維母細胞分化的 影響是進一步探討的重點。α-SMA 的表現增加是纖維母細胞分化的一項指 標，分化後的肌纖維母細胞 大量表現 α-SMA 以形成 stress fiber，分泌 ECM 的能力也增加。從細胞免疫螢光染色的照片中發現，肺纖維母細胞單 獨處理 TGF-β1 (5 ng/ml) 72小時後，α-SMA 大量表現且呈平行束狀排列；
前處理 25 μM 的木犀草素的細胞則可明顯抑制由 TGF-β1 刺激所造成的 α-SMA 大量表現 (Figure 8)。 Western blot 的 α-SMA 蛋白表現量數據也 再一次驗證此項觀察結果(Figure 9) ( p<0.01 vs. TGF-β1)。
TGF-β1 除了改變纖維母細胞的型態之外，還會促使細胞製造更多的細 胞間質蛋白，其中最主要的是 collagen I/III。從 Figure 9 western blot 的結 果顯示，單獨處理木犀草素已明顯減少肺纖維母細胞製造 collagen I ( p<0.01 vs. Veh)；單獨處理 TGF-β1 時 collagen I 被大量製造；細胞前處理木犀草素 則可抑制由 TGF-β1 刺激所造成的 collagen I 大量表現。Vimentin 是另一種 肌纖維母細胞 的指標蛋白，木犀草素單獨或與 TGF-β1合併處理細胞都可 抑制 vimentin 的表現 (Figure 9)。
Smads 蛋白家族是細胞內負責將 TGF-β1 刺激所產生的訊息傳遞至細胞 核的傳遞者，研究也顯示在BLM-induced 的肺纖維化組織有 Smads protein
訊息傳遞。Western blot 的結果顯示 (Figure 10)， TGF-β1 刺激 肺纖維母 細胞 20-30 分鐘，出現大量的 Smad3 磷酸化蛋白，細胞前處理 25 μM 的木 犀草素則可抑制由 TGF-β1 刺激所造成的 p-Smad3大量表現 ( p<0.05)；而細 胞前處理 TGF-β1 type 1 receptor kinase inhibitor (SB431542) 則完全地抑制 了 Smad3 的磷酸化 ( p<0.001)。 活化的 p-Smad3 (R-Smad) 必須與 Smad4 (Co-Smad4) 結合成 heterodimer，才能進核參與基因的調控，因此 Smad4 蛋 白的表現也會影響 TGF-β1的訊息傳遞。 Western Blot 的結果顯示(Figure 10)，細胞單獨 25 μM 的木犀草素就會抑制 Smad4 蛋白的表現 ( p<0.05 vs.
Veh)；合併 TGF-β1時亦可降低由 TGF-β1刺激所造成的 Smad4 過度表現 ( p<0.01 vs. TGF-β1)。 SB431542 對 TGF-β1刺激所造成的 Smad4 過度表 現沒有影響。 綜合以上結果得知，透過抑制 Smad3 磷酸化和減少 Smad4
的表現而阻斷 TGF-β1 訊息傳遞，可能是木犀草素抑制肺纖維母細胞生長、
分化和分泌 ECM 的分子機轉之一。
四、木犀草素抑制肺上皮細胞株 A549 進行 EMT
如前述，肺上皮細胞在肺纖維化的過程中也扮演重要角色，除了會分 泌與纖維化有關的物質和 ECM components之外，肺上皮細胞在 TGF-β1 刺激下具有 epithelial-mesenchymal transition (EMT) 的能力，會從上皮細胞 轉變為具肌纖維母細胞 phenotype 的細胞。接著我們也將探討木犀草素對 TGF-β1- induced EMT 的作用。如 Figure 11 A 所示，正常的 A549 細胞 具 有 上 皮 細 胞 的 形 狀 (cobblestone epithelial morphology) 及 cell-cell adhesion，免疫螢光染色可發現在細胞膜附近有明顯的 epithelial marker (E-cadherin)表現，在TGF-β1 刺激 48小時後，細胞形狀明顯改變，變成 mesenchymal-like 的梭狀細胞，cell-cell adhesion 消失，E-cadherin 分解到 細胞質中，木犀草素對這些改變有明顯的抑制作用。 Western blot 的結果
顯示(Figure 11B)，A549 細胞單獨處理 TGF-β1 48小時後，epithelial marker (E-cadherin) 表現減少；mesenchymal phenotypic markers (fibronectin 和 vimentin) 明 顯 增 加 ， 表 示 A549 細 胞 在 TGF-β1 刺 激 下 進 行 epithelial-mesenchymal transition。木犀草素對這些改變有明顯的抑制作用 (除了vimentin之外)。綜合以上結果得知，透過抑制 EMT 而減少肌纖維母 細胞的分布，可能是木犀草素抗纖維化作用的機轉之一。
Part B 木犀草素對於肺泡巨噬細胞的免疫調控
一、木犀草素對細胞存活率之影響
MH-S 和 RAW 264.7 細胞分別以不同濃度 (5、10、25、50 μM) 的木 犀草素處理，經 24 小時後，以 Trypsin 染色及 MTT 法偵測木犀草素對 細胞是否有毒性，結果發現 50 μM 以下的藥物濃度均不會造成細胞毒性 (Figure 12)。
二、木犀草素對 LPS 刺激巨噬細胞產生促發炎細胞激素及發炎物質的影響
TNF-α 和 IL-6 等促發炎細胞激素 (Proinflammatory cytokines) 在發炎 過程中扮演重要角色，因此我們首先探討木犀草素是否對 LPS 刺激巨噬細 胞產生 TNF-α 和 IL-6 有抑制效果。如 Figure 13 所示，RAW 264.7 和 MH-S 細胞單獨處理 LPS (100 ng/ml) 造成細胞激素大量釋出，而細胞前處理木犀 草 素 (5-25 μM) 以 濃 度 依 存 性 的 方 式 抑 制 LPS 刺 激 細 胞 生 成 TNF-α (Figure 13Α) 和 IL-6 (Figure 13B)。 在 NO 和 PGE2的實驗結果也有 相同的趨勢(Figure 14)，但因細胞種類不同略有差異，在 RAW 264.7 細胞 觀察到木犀草素 5 μM 對 NO 即有明顯的抑制 (50%)(Figure 14A)；而在 MH-S 細胞，木犀草素 5 μM 對 PGE
三、木犀草素對 iNOS 和 COX-2 的蛋白質的調控
為了探究木犀草素對 LPS 刺激巨噬細胞產生 NO 和 PGE2 是否與 iNOS 和 COX-2 二種催化酵素有關，接著以 western blot 來分析木犀草素 對 iNOS 和 COX-2 蛋白的表現。在未加 LPS 刺激及單獨處理木犀草素 的細胞中偵測不到 iNOS 和 COX-2 蛋白的表現。LPS (100 ng/ml) 刺激 8 小時後，iNOS 和 COX-2 蛋白開始有表現，到 14 小時達高峰 (Figure 15)。木犀草素 (25 μM) 在這二株巨噬細胞皆可顯著地抑制由 LPS 刺激所
為了探究木犀草素對 LPS 刺激巨噬細胞產生 NO 和 PGE2 是否與 iNOS 和 COX-2 二種催化酵素有關，接著以 western blot 來分析木犀草素 對 iNOS 和 COX-2 蛋白的表現。在未加 LPS 刺激及單獨處理木犀草素 的細胞中偵測不到 iNOS 和 COX-2 蛋白的表現。LPS (100 ng/ml) 刺激 8 小時後，iNOS 和 COX-2 蛋白開始有表現，到 14 小時達高峰 (Figure 15)。木犀草素 (25 μM) 在這二株巨噬細胞皆可顯著地抑制由 LPS 刺激所