實驗方法與步驟

1. 細胞培養液的配製

將RPMI 1640 粉末先溶於約 9.5 公升 Mili-Q 去離子水中，加入 20 g 的NaHCO3，再用HCl 調整 pH 至 7.0~7.2 後以 Mili-Q 去離子水補足體 積至10 公升，然後以 0.22 µM 的過濾器過濾滅菌，最後儲存於 4˚C 冰 箱備用。

2. 完全培養液

每 500 毫 升 RPMI 1640 細 胞 培 養 液 添 加 100 IU 青 黴 素

（Penicillin ）、 100 μ g 鏈 黴 素 （ Streptomycin ）、 2 mM 麩 胺 酸

（L-glutamine）、100 μM 非必須胺基酸 （non-essential amino acid），

1mM 焦葡萄酸鈉（Sodium Pyruvate），最後加入 10％胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）即得。

3. 細胞株的培養

H1299、H1299/p53、A549 和 CH27 四種非小細胞肺癌細胞株，均 以RPMI 1640 完全培養液培養於 37℃、5％CO2的培養箱中；繼代培 養（subculture）時，先用 PBS（Phosphate-Buffered Saline）清洗 1 至

2 次，再以 TEG （0.05 mM trypsin、2.5 mM EDTA 和 2.8 mM glucose）

處理數分鐘，使細胞與培養皿底解離，最後分種於新的細胞培養皿中，

每一培養皿注入約7 毫升的細胞培養液，細胞培養液每兩天更換一次。

二、細胞數目的測定：

將培養於細胞培養皿的細胞經TEG 處理過後，以 3~5 毫升的培養液 將細胞打下來，使用血球計數器（hemocytometer）計算所有的細胞數目，

接著以每ml 有 3x10⁴個細胞分種於12 孔細胞培養盤中，每孔加入 1 毫升 細胞與培養液的混和液，均勻搖散細胞後，將細胞培養於37℃、5％CO2

的培養箱中，經 24 小時後給予各濃度藥物（1μM﹐10μM﹐100μM）

處理，再經12、24、48、72 小時後，以血球計數器計算各孔盤內的細胞 數，每一藥物濃度處理為三重覆。

三、流式細胞分析儀測定：^（62）

將細胞以每10 毫升有 4x10⁵個細胞種於10 公分的培養皿中，在藥物 分別處理 24、48、72 小時後，先以 PBS 清洗細胞，再將細胞用 TEG 處 理，用1 毫升 PBS 細胞打下來，置於 1.5 毫升的 eppendorf tube 中，再以 900 rpm 室溫下離心 5 分鐘，倒掉上清液，置於震盪器輕輕震盪，將 1 ml 的70％ EtOH/PBS 一滴一滴滴入 eppendorf tube 中，使細胞完全均勻分散 於70％ EtOH/PBS 中，即可置於 4˚C 冰箱保存。

待要分析前，將sample 以 900 rpm 在 4℃下離心 5 分鐘，倒掉上清液，

於避光條件下，每一個sample 重新分佈於 1 毫升 PI solution 中，置於 37

℃中作用30 分鐘，最後置於冰上，利用 Flow cytometer（FACScan）儀器 分析，所得之結果以ModFIT LT 2.0 軟體分析，加以量化之。

四、蛋白質定性與定量的分析：

1. 蛋白質的萃取（Protein Extraction）

將細胞用冰的PBS 洗二次後用刮棒刮下，於 4℃下 5000 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，加入適量的 RIPA buffer

〔50 mM Tris（pH 7.4）﹐150 mM NaCl﹐1 ﹪NP-40﹐0.25 ﹪Na Deoxycholate﹐5 mM EDTA (pH 8.0) ﹐1 mM EGTA (pH 8.0) ﹐* 1 mM DTT﹐*5 µg/ml Leupeptin﹐* 0.2 mM PMSF﹐* 5 µg/ml Aprotinin﹐* 1 mM Na Vanadate﹐* 1 mM NaF（* add before use）〕，將細胞pellet 均勻打散，

置於冰上作用20 分鐘，接著以超高速離心 55000 rpm、4℃、30 分鐘，

收集上清液，以Bradford 的方法測量蛋白質溶液，在波長 595 nm 下 的吸光值，換算成蛋白質濃度（μg/µl）〔以一系列已知濃度的BSA 做 成之stand curve 換算蛋白質濃度。以每個 eppendorf tube 50µg 的蛋白 質分裝並用RIPA buffer 調整成相同體積，接著再加入調整完體積的蛋 白質溶液1/3 量的 4X protein loading dye（8 % SDS﹐0.04 % Serva blue R-250﹐40 % glycerol﹐200 mM Tris pH 6.8﹐10 % 2-mercaptoethanol ），

以95℃乾浴加熱變性 10 分鐘後，即可置於-80℃中保存。

2. 聚丙烯醯胺膠體電泳法（SDS-PAGE Assay）

將蛋白質依分子量分離利用 SDS-PAGE，首先配製 1.5 mm 厚的 discontinuous acrylamide gel，gel 分上下兩層，下層 separating gel 其 acrylamide 的百分比視分析蛋白質分子量而定，上層的 stacking gel 則含4 % acrylamide。配製完成的膠體放置於電泳槽內，加入電泳緩衝 液（running buffer：25 mM Tris﹐192 mM glycine﹐0.1% SDS）。接著 將萃取出的蛋白質與4X protein loading dye 混合液再以 95℃乾浴 加 熱變性10 分鐘，冰浴冷卻後離心。將各 sample 及標示標準分子量的 Multimaker 依序注入膠體的孔槽中，通以電壓 80 Volt.，待樣品通過

stacking gel 後電壓調整為 100 Volt.，當 serva blue R-250 的 dye 跑到 膠片底部或視其需要，即可將電源關閉。

3. 西方轉漬法（Western blot ）^（90）

將PVDF membrane 浸於 methanol 數秒後以 Milli-Q 水浸濕，接著 裁好的濾紙與membrane 先浸泡在 transfer buffer （50 mM Tris﹐40 mM glycine﹐0.375 % SDS﹐pH 9.0-9.4；20 % methanol ）中。裁下電泳膠 中所要轉漬的區域後，亦浸泡於transfer buffer 中。轉印石墨板之正極 板以transfer buffer 潤濕後，依序重疊平鋪 4 張濾紙、membrane、gel、

4 張濾紙，最後蓋上以 transfer buffer 潤濕的負極石磨板，設定電流（電 流＝濾紙面積 × 9/7 × 疊數），通電流經 1 小時又 10 分鐘後將 membrane 取出，浸泡於 5 ﹪non-fat milk/TBST 中，於室溫下搖晃至 少30 分鐘。以 TBST buffer（24.22 g Tris﹐87.75 g NaCl﹐10 ml Tween 20﹐加水調到 1L ）清洗 membrane 10 分鐘三次，加入一級抗體，並 置於4℃下作用 overnight。

隔日先以TBST buffer 清洗 membrane 10 分鐘三次，加入二級抗 體，使其在室溫下搖晃作用1 小時之後，再用 TBST buffer 清洗 10 分 鐘 三 次 ， 接 著 在 暗 房 中 將 membrane 與 ECL （ enhanced chemi-luminescence）反應後，裝於透明塑膠袋內並置於壓片夾中，以 X-ray film 感光顯影，再以自動沖片機沖片。

五、蛋白質激酶活性分析（Kinase Activity Assay）^（99）

將細胞用冰的PBS 洗二次後用刮棒刮下，於 4℃下 5000 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，加入適量的 lysis buffer

（RIPA buffer：Tris buffer＝1:1﹐*200 µM PMSF﹐*20 µl/ml Leupeptin﹐

*1 mM NaF﹐*1 mM Sodium Vanadate）（*add before used），依照上述萃取

蛋白質的步驟，取定量蛋白質（250-350μg）以 Tris buffer 調整體積到 250 或 300 μl。蛋白質溶液加入 4 μl 的 antibody 以及 30 μl protein A sepharose 後，在 4℃冰箱內旋轉作用 over night。

次日混合液以7000 rpm 4℃離心 10 分鐘，吸掉上清液後，再加入 400 μl buffer Ι 〔20 mM Tris （pH 7.4）﹐0.5 M NaCl〕 清洗 3 次，接著 buffer ΙΙ 〔20 mM Tris （pH 7.4）﹐0.5M DTT﹐20 µg/ml Leupeptin, 20μM PMSF﹐

1 mM Sodium Vanadate﹐1 mM NaF〕 清洗 1 次，每次清洗於 4℃下以 7000 rpm 離心 5 分鐘，完成後吸掉上清液。

接著每管sample 加入 15μl reaction mixture 〔50 mM Tris （pH 7.4）﹐

10 mM MgCl2﹐0.5mM DTT﹐5μM ATP﹐1μg /μl Histone H1 、 RB protein、MBP or c-Jun ﹐2μCi γ-32p ATP〕 在 37℃作用 20 分鐘之後，

加入4X protein loading dye 在 95℃下加熱變性 15 分鐘，將 sample 離心 後，注入12.5 % SDS-PAGE gel 進行蛋白質電泳，待 Serva blue R-250 的 dye 跑到膠片底部，即可將電源關閉。依照西方轉漬法的步驟，將蛋白質 轉印到PVDF membrane 後，將 membrane 裝於透明塑膠袋內並置於片夾 中，在暗房中以X-ray film 直接感光顯影，再以自動沖片機沖片。

六、Gel Retardation Assay（Gel Shift Assay）：^（108） 1. 細胞核的萃取

將細胞用冰的PBS 洗二次後刮下，在 4℃下 10000 rpm 離心 5 分 鐘，倒掉上清液並用棉棒將多餘的水吸乾，加入適當的Buffer 1 （ 50 mMTris-HCl/pH7.5﹐4 mM EDTA/pH8.0﹐2 mM EGTA ﹐ddH2O） 混 合均勻，置於冰上作用 20 分鐘後，將細胞混和液以 Trypan blue

（0.4W/V）染色，看細胞膜是否有破裂，鏡檢下當 Trypan blue 可染入 細胞質中，即表示細胞膜已有破裂，接著在4℃下 10000 rpm 離心 20

分鐘，倒掉上清液，再加入適量 Tortex Buffer（ddH2O﹐20 mM Hepes/pH7.9﹐350 mM NaCl﹐20％ Glycerol﹐1％ NP-40﹐5 mM MgCl2﹐ 0.5 mM EDTA/pH8.0﹐0.1 mM EGTA﹐*0.5 mM DTT﹐*0.1％ PMSF﹐

*1％ Aprotinin）（*add before use） 混合均勻，置於 4℃冰箱旋轉 over night。

隔日在4℃下 13000 rpm 離心 15 分鐘，收集上清液，以 Bradford 的方法測量蛋白質溶液，在波長 595 nm 下的吸光值，換算成蛋白質 濃度（μg/µL），以每個 eppendorf tube 10 µg 的蛋白質分裝，置於-80

℃保存。

2. Biotin probe 的配置

將互補的 DNA （biotin-AP-1 or biotin-NFκB-1） 單股加在一起，

以ddH2O 配置成 5 pmole 的濃度，在 37℃下作用 1 小時，然後置於室 溫下2 小時即得。

3. 反應與跑電泳

先將 6％的 native acrylamide gel 〔ddH2O 7.33 mL, 5x TBE buffer 2.5 ml, 30％Acrylamide/bis （29:1）2.52 ml﹐10％APS 125μl﹐TEMED 25μl〕，以 1x TBE buffer 作為 running buffer，在 12℃冷循環分析條件 下，用每片gel 20 mA 預跑（pre-run）1 個小時。接著將萃取出的核蛋 白，每個sample 加入 2μl 的 buffer D （ddH2O﹐20 mM Hepes/pH7.9﹐

20％ glycerol﹐100 mM KCl﹐0.5 mM EDTA/pH8.0﹐20％ NP-40﹐*2 mM DTT﹐*0.1％ PMSF ） （*add before use）及 4μl 的 buffer F（ddH2O﹐

20％ Ficoll 400﹐100 mM Hepes/pH7.9﹐300 mM KCl﹐*10 mM DTT﹐

*0.1％ PMSF） （*add before use）以及 5μl 的 biotin-probe，然後在 30℃下作用 30 分鐘，完後加入作用完 sample 五分之一體積的 6x sample buffer （ddH2O 0.3 ml, 100％ glycerol 0.5 ml﹐5x TBE Buffer 0.2 ml﹐

Xylene cyanol），接著將 sample 注入膠體的孔槽中，在 12℃下以每片

gel 30 mA 跑膠，待大約 2 小時後，6x sample buffer 跑到膠體的最底端 即可。下一步便利用上述西方轉漬的方法，以 0.5x TBE buffer 作為 transfer buffer，150 mA 下 1 個小時 transfer 到 NC membrane 上，然後 將membrane 用 UV light 照射，接下來用 5％ non-fat milk/1x TBS 室 溫下blocking 30 分鐘，再用 1x TBS 清洗 membrane 5 分鐘 4 次，接著 將 membrane 浸泡於 1:20000 的 0.5μg/μl Streptavin-Horseradish Peroxidase conjugate in 1x TBS，在 4℃下 overnight。

次日，將 membrane 以 1x TBS 清洗 5 分鐘 4 次，接著在室溫下在 membrane 上加入 SuperSignal Substrate 作用 5 分鐘，然後將 membrane 裝於透明塑膠袋內並置於片夾中，在暗房中以X-ray film 直接感光顯 影，再以自動沖片機沖片。