小蘗鹼（berberine）為一發現極早的異奎啉類（isoquinoline）植物性 生物鹼，它的蹤跡遍存於眾多科屬的植物當中，而在這些植物當中有不少 為現今常用的中草藥，在過去已有不少學者從事小蘗鹼相關的藥理研究，
顯示其有抗菌和抗發炎等多項的藥理活性，近幾年來，亦有人將小蘗鹼應 用於癌症治療的研究當中，且認為具有發展為抗腫瘤藥的潛力，然其分子 作用機轉仍不甚明瞭，因此，本研究即針對小蘗鹼對非小細胞肺癌細胞的 作用，進行分子層次的探討。
在小蘗鹼處理的四株肺癌細胞–H1299、H1299/p53、A549 和 CH27，
都可見到趨勢類似的生長抑制效果（圖3），比較前人於胃癌細胞MGC-803
（61）
、食道癌細胞株（YES-1 to YES-6）（63）、血癌細胞K562（71）以及胃癌細 胞株MKN-74、乳癌細胞株 MCF-7 和 MDA-468、結腸癌細胞 HCT-116（62） 等處理小蘗鹼，均顯示出小蘗鹼的抗腫瘤活性是在於其能抑制細胞的生 長，同時可能伴隨著細胞凋亡的現象（61,68,72），然而，於本實驗中肺癌細胞 處理小蘗鹼並無凋亡的現象發生（圖6），有如此的相異點，我們認為應與 各細胞間的分子表現差異性有關，導致各細胞對藥物的敏感度及反應不盡 相同，除此之外，於細胞株MGC-803 和 YES-1 to YES-6 以及本實驗的四 株肺癌細胞處理小蘗鹼發現可使細胞週期停滯於 G0/G1 期，相反的，於 MKN-74 與 Balb/c 3T3 細胞株所看到的是 G2期的停止（62,70），顯示小蘗鹼 的抗腫瘤作用機轉可能決定於細胞株的種類。無論如何，由以上之研究結 果，我們可以確定的是小蘗鹼的抗腫瘤活性是透過影響細胞週期正常的運 行。
目前已知，細胞週期可分為 G1、S、G2、M 四個時期，當靜止期
（senescence）的細胞接受到 mitogen 的刺激時，細胞便會由 G0期進入G1
期，於細胞週期進行期間是受到許多分子的調控，在G1的早至中期，cyclin
D 與 Cdk 4/6 為主要的調控分子，其中 cyclin D 又可區分為 cyclin D1、cyclin D2及cyclin D3三個subtypes，而在 G1晚期或是在所謂的G1/S transition 時，
則是受到cyclin E 與 Cdk2 的調控（81）。此外，S 期是 cyclin A 與 Cdk2，G2/M 期則為cyclin B 與 Cdk1。然而，這些分子單獨存在時是無活性的，必須要 結 合 成 複 合 體 才 具 有 磷 酸 化 下 游 分 子 的 能 力 ， 即 形 成 cyclins- Cdks complexes，接著這些具活性的 complexes 就會去磷酸化 retinoblastoma preteins（Rb proteins），Rb proteins 又可分為 pRb1、pRb2/p130 和 p107 三 個，被磷酸化的 Rb proteins 會失去與 E2F proteins 結合的能力，而 E2F proteins 本身為 transcription factors，它們會調控許多進入 S 期所需的基因，
當其為自由態時，便可促使細胞週期的進行。
綜合本實驗中所有的數據，比較H1299 和 H1299/p53 兩株細胞於分子 層次上所受到小蘗鹼的影響，發現兩者所受調控之分子並無明顯的差異 性，而且H1299/p53 細胞株之 p53 蛋白表現量亦無變化，顯示 p53 蛋白在 小蘗鹼的作用機轉中不扮演重要的角色，所以，有無p53 表現並不影響小 蘗鹼的作用。
由圖6 的結果可清楚的看到，於小蘗鹼的處理下，pRb1 蛋白表現量無 任何的增減，然而，pRb2/p130 被磷酸化的程度明顯的降低，過去的研究 已指出，pRb1 對細胞週期的進行並不佔有決定性的位置，反而是 pRb2/p130 於G0以及G1的早期扮演著重要的角色，通常pRb2 /p130 是與 E2F protein 家族中的 E2F-4 結合在一起，形成的 complexes 會抑制 E2F-1 等轉錄因子
（transcription factors）的活性，必須等到 pRb2/p130 被 cyclin D- Cdk4/
complexes 磷酸化，E2F-4 與之脫離，E2F-1 的活性才會恢復而使細胞週期 進行（106）。因此，小蘗鹼所造成的細胞週期G1期停滯，應與其導致pRb2/p130 不被磷酸化有相當大的關聯性。然而，什麼樣的原因會使的pRb2/p130 磷 酸化減少，目前已知，G1期的cyclin D- Cdk 4/6 與 cyclin E-Cdk2 complexes 為磷酸化Rb proteins 的重要分子。
一般所知，Cdk2 用 SDS-PAGE 偵測會出現兩到三個 bands，通常跑的 比較慢的一到二個 bands 代表的是不活化型，也就是 Cdk2 於 Thr-14 或 Tyr-15 位置上被磷酸化，最下面的 band 為活化型，即 Thr-160 位置被接上 磷酸根，於圖5 中，Cdk2 的控制組均可清楚的看出兩到三個 bands，但在 給藥組雖只能看出最下面的活化型，其蛋白質表現量卻是隨著時間的增加 在減少著，同樣地，於圖10 激酶活性分析中，Cdk2 激酶活性也是受到抑 制的。另一方面，cyclin D3的表現量亦明顯的減少，過去文獻提及，比較 cyclin D1、cyclin D2與cyclin D3於許多細胞株的表現與功能，cyclin D2在 細胞株中不表現的機會較其他兩者為大，其次為cyclin D1，而cyclin D3則 是最廣泛表現的（107）。也因此有人認為這三個 cyclin D 的功能並不能完全 的互相取代，例如與cyclin D1相比，cyclin D3對於磷酸化pRb2/p130 有極 大的選擇性及專一性（108），而這樣的現象與本實驗中cyclin D3減少伴隨著 pRb2 磷酸化下降可相互呼應。此外，Cdk4 之蛋白質表現量與激酶活性亦 可見到減少的趨勢。
所以推論，小蘗鹼所致之pRb2/p130 磷酸化減少應與 cyclin D3、Cdk2 和Cdk4 蛋白質表現量的降低，導致形成 cyclin D- Cdk 4/6 與 cyclin E-Cdk2 complexes 數量下降，以至於無足量具活性之蛋白質激酶去磷酸化 pRb2，
導致細胞週期受到抑制，停留在G1期。
事實上，除了上述的Cdks 及 cyclins 會直接去影響 Rb proteins 的磷酸 化外，CdkIs 亦會透過抑制 Cdk-cyclin complexes 活性，間接的去減少 Rb proteins 的磷酸化。CdkIs 可分為兩大家族–INK4 與 CIP/KIP 家族，INK4 家族主要對cyclin D- Cdk 4/6 complexes 有抑制活性，它們會與 cyclin D 競 爭Cdk4 跟 Cdk6 的結合區域，使 cyclin D 無法與 Cdk4 跟 Cdk6 形成有活 性的complexes，而 CIP/KIP 家族對於所有的 cyclin-Cdk complexes 均有抑 制作用，它們會藉由與Cdk-cyclin complexes 結合，使其活性消失（90）。由 圖8 結果，於小蘗鹼的作用下，INK4 家族的 p16INK4A以及CIP/KIP 家族的
p21CIP1/WAF1/sdi1
和p27KIP1蛋白質表現量均增加，由於CdkIs 表現量的增加通 常代表著Cdk-cyclin complexes 的活性會下降，這也與圖 10 中 Cdk2 和 Cdk4 蛋白質激酶活性的減少可以相互印證，顯示小蘗鹼的生長抑制作用，
p16INK4A、p21CIP1/WAF1/sdi1
和 p27KIP1亦參與其中，導致 pRb2/p130 磷酸化降 低。
另一方面，cyclin E 的表現量有增加的趨勢，一般而言，當細胞間密 度過大產生contact inhibition 時，cyclin E 表現才會大量上升，然而，當細 胞週期要由 G1進入 S 期時，cyclin E 的表現是要被抑制下來的，因在 G1 生長的調節亦與 MAPK（Mitogen-activated protein kinase）家族分子有相 關。於小蘗鹼的相關研究中，在小鼠巨噬細胞（mouse macrophages），小 蘗鹼可誘導p38 MAPK 的活化（42），一般認為，p38 MAPK 的活化與一些 cytokine 如 IL-12、IL-6 的生成有關，事實上有一些研究發現，p38 MAPK 的活化是會使 cyclin D1生成減少，導致細胞週期的停滯（98）。然而，在本
ERK（extracellular signal-regulated kinase）為 MAPK 家族另一成員， Ras/ERK 路徑持續不斷的活化時，是會造成 p21CIP1/WAF1/sdi1
於細胞中表現
至於亦為MAPK 家族中的 JNK（C-Jun N-terminal kinse），被認為與細 胞的生長、分化與凋亡有關，它的主要下游調控分子 c-Jun，為轉錄因子
（transcription factor）AP-1 重要的組成物，有文獻指出，c-Jun 的活化會使 細胞週期調控分子cyclin D1表現量上升（109），但會抑制p53 的表現量，因
而使 p21CIP1/WAF1/sdi1表現也下降。而在小蘗鹼處理下，JNK 磷酸化蛋白質 量無變化（圖9），其蛋白質激酶活性於24 小時為上升，接下來便下降（圖 10），但檢視 AP-1 與 DNA 結合能力發現為減少的（圖 11），因此，我們 認為整體 JNK 的活性應該是下降的。雖然於肺癌細胞中的 p21CIP1/WAF1/sdi1
表現量增加，可能與JNK 活性下降有關，然而，p53 與 cyclin D1表現量並 響，才導致AP-1 活性下降。除此之外，另一轉錄因子（transcription factor）
NF-κB 亦被認為與 MAPK 家族分子有關，NF-κB 可因 ERK 活性的上升而 使其活化，而在我們的結果當中，NF-κB 和 ERK 的活性雙雙都是減少的
（圖10、圖 11）。一般認為，NF-κB 的活化可使 cyclin D1表現量增加（110）， 並可能抑制p53 的功能或活性，使 p21CIP1/WAF1/sdi1
表現量減少（111），而使得 定性增加，所以cyclin D1才不受影響。另一方面，p21CIP1/WAF1/sdi1
和p16INK4A 亦會受AP-1 與 NF-κB 的影響，本實驗中這兩個 CdkIs 均有增加的趨勢，
因此，我們認為AP-1 和 NF-κB 可能也參與了 p21CIP1/WAF1/sdi1
和p16INK4A的 調控機制。