一、觀察不同劑量小蘗鹼對肺癌細胞的影響：
為了探討小蘗鹼對肺癌細胞之生物效應，四株肺癌細胞 H1299、
H1299/p53、A549 以及 CH27 分別種植於 12 孔盤中，分別處理小蘗鹼 1 µM、10 µM 和 100 µM，於顯微鏡下進行觀察。在初期 12 小時內，鏡檢下 觀察並無明顯的差異性，但於給藥 24 小時後，處理組與控制組開始有生 長的速率的不同。48 小時的觀察，可明顯的看出處理組的細胞生長被抑制
（圖 4），但藥物對細胞並無毒殺的效應。到了 72 小時，處理小蘗鹼的細 胞生長抑制作用更趨明顯。然而，細胞仍無受藥物影響而致死的現象產 生，顯示再本實驗處理之濃度範圍內，小蘗鹼對肺癌細胞的影響，並不會 誘使細胞的凋亡或壞死，而是抑制細胞的分裂增殖。
二、不同劑量小蘗鹼的生長抑制效應：
由圖4 之結果顯示，小蘗鹼可抑制肺癌細胞增生，因此將四株肺癌細 胞種植於 12 孔盤中，分別於給藥後 12、24、48 和 72 小時後，利用血清 計數器計算出確實的細胞數目，而得一細胞生長的折線圖。由圖5 得知，
小蘗鹼對四株肺癌細胞均有顯著並相近的生長抑制作用，細胞在處理小蘗 鹼100 µM 的濃度下，經過 72 小時的培養，發現細胞的增殖現象完全的被 抑制下來，在10 µM 濃度下也約有 50 至 70％的抑制生長效果；至於在 1 µM 的情況下，只有約10％的抑制能力。由此可知，小蘗鹼抑制肺癌細胞生長 的作用呈現著劑量與時間依存性的關係，另一方面，由圖5 的數據可推論，
小蘗鹼為一抑制細胞增生的化合物，不具有細胞毒殺的作用。因即使在100 µM 的作用濃度下，生長曲線並無下降的趨勢而保持水平。因此，後續的 研究工作，我們以最有效濃度100 µM 的小蘗鹼來進行實驗。
三、小蘗鹼使細胞週期停滯於G1期：
過去的研究已明確的指出，細胞的增生與分裂遵循著一套規律的法 則，稱之為細胞週期。整個週期可分為 G1、S、G2及 M 期。由上述實驗 結果得知，小蘗鹼會抑制肺癌細胞的分裂增殖，此現象極有可能是透過阻 止細胞週期的進行。因此，利用流式細胞分析儀，分析小蘗鹼是否會影響 對肺癌細胞週期的進行。
由圖 6 結果顯示，小蘗鹼可使 H1299、H1299/p53、A549 以及 CH27 四株肺癌細胞 G1 期的細胞數目隨著處理時間明顯的增加，顯示小蘗鹼的 細胞生長抑制活性，似乎是使細胞無法進入 S 期，而停留在 G1期。其中 尤以 H1299 與 H1299/p53 兩株細胞最為明顯（表 3）。所以，往後的實驗 就以這兩株細胞來做進一步的探討與比較。
此外，整個分析圖示中並無所謂sub-G1 peak （亦稱 pre-G1 or apoptotic peak）的出現，進一步證實小蘗鹼並不會造成細胞的凋亡，而只有生長抑 制的作用。
四、小蘗鹼對細胞週期相關分子的調控：
一般而言，細胞週期的進行與否是靠著許多分子的參與，彼此間訊息 的傳遞環環相扣且錯綜複雜、有時因為一個分子表現量的差異，可能就產 稱截然不同的結果。因此，對於小蘗鹼所導致肺癌細胞週期停滯於G1期，
很有可能是小蘗鹼調控了與 G1 期相關分子的表現。所以下一步我們利用 西方墨點法技術，偵測 G1 期相關分子的蛋白表現量，同時也比較對於有 p53 表現的 H1299/p53 細胞株與沒有 p53 表現的 H1299 細胞株，處理小蘗 鹼後分子層次上之異同。
由於Cdks 以及 cyclins 為細胞週期進行的重要調節因子，首先檢測小 蘗鹼對它們的影響。如圖 7 所示，因小蘗鹼的影響在 G1期，因此檢測與 G2期相關的Cdk1 和 cyclin B 如預測的並無變化；而對於 G1期相關分子的
調控，小蘗鹼在兩株細胞上均造成 G1早至中期的 Cdk4 和 cyclin D3以及 G1晚期相關的Cdk2 表現量減少，此外，G1晚期另一相關分子cyclin E 則 有增加的趨勢，至於Cdk6、cyclin A、cyclin D1與cyclin D2這些分子則無 變化。
另一方面，探討抑制細胞週期進行的CdkIs，發現在小蘗鹼的作用下，
INK4 家族的 p16 與 CIP/KIP 家族的 p21 及 p27，於兩株細胞的表現量均 有明顯的增加，而p15 並不受影響（圖 8）。除此之外，H1299/p53 細胞的 p53 表現量不受調控，同時 H1299 則如預期的偵測不到 p53 表現。另外，
在Rb protein 家族中的 pRb1 並沒有顯著變化，但是在 pRb2 /p130 蛋白質 表現方面，兩株細胞都可以清楚的看出於給藥組細胞內pRb2 /p130 蛋白質 磷酸化之程度較低，蛋白質在電泳膠上跑的比較快。而未處理之控制組細 胞中pRb2 /p130 蛋白質明顯被磷酸化，蛋白質在膠體上移動較慢。
五、小蘗鹼調控MAPK 家族分子的活性：
過去的文獻報導指出， MAPK 家族分子參與細胞的生長、分化與死 亡等生命現象之調控，因此，本實驗將探討小蘗鹼是否也藉由調控MAPK 家族分子去影響細胞的生長，利用西方墨點法技術偵測蛋白質表現量之變 化。由圖9 的結果得知，於兩株細胞中，ERK、JNK 與 p38 MAPK 三者在 總蛋白質量的表現均無明顯的變化，然而在 ERK 的磷酸化蛋白質表現量 是減少的，但 p38 MAPK 磷酸化蛋白之表現量則顯著增加，至於 JNK 其 磷酸化蛋白質未見有明顯的變化。
六、小蘗鹼對蛋白質激酶活性的影響：
由以上的實驗結果，許多蛋白質均受到小蘗鹼的調控，其中不乏具有 激酶活性的蛋白質，由於僅靠蛋白質量增減以及磷酸化的有無並不能完全 代表其活性的消長，因此下一步驟便去測定G1期分子Cdk2、Cdk4 和 Cdk6
與MAPK 家族分子蛋白質激酶活性，是否也隨著蛋白質量的改變而產生變 化。
由圖 10 可明顯的看出，Cdk2、Cdk4 以 ERK 及蛋白質激酶活性與蛋 白質表現量趨勢相同，均有減少的現象，至於 Cdk6 無論於蛋白質激酶活 性或表現量上都沒有太大的變化，然而，p38 MAPK 激酶活性卻是減少的，
與其磷酸化蛋白表現量的趨勢相反，此外，JNK 磷酸化蛋白質雖無明顯的 變化，但其激酶活性於 24 小時處理組為增加的，可是到了 48 和 72 小時 卻反而下降。
七、小蘗鹼對AP-1 與 NF-κB 活性的影響：
文獻報導指出，轉錄因子（transcription factors）亦會直接或間接的去 調控細胞週期的進行。其中AP-1 與 NF-κB 是目前已知與細胞生長、凋亡 以及癌化有極大的關連的轉錄因子，其中JNK 下游分子中的 c-Jun 為 AP-1 主要組成分子之一，而過去已有研究指出，小蘗鹼可能會抑制 AP-1 的活 性（69）。接著我們利用Gel Retardation Assay，測定小蘗鹼是否會影響 AP-1 與 NF-κB 和其認知的 DNA 序列結合的能力。一般認為，AP-1 與 NF-κB 如可結合到 DNA 序列上，則可使其調控的下游分子表現量上升，進而影 響一些生物現象。
由圖11 之結果可知，於兩株肺癌細胞中 AP-1 或 NF-κB 與 DNA 序列 結合的能力均明顯的減少。顯示小蘗鹼可能會透過降低AP-1 與 NF-κB 與 DNA 結合活性，進而抑制下游分子的表現，此現象可能牽涉小蘗鹼的生長 抑制作用。