實驗材料

一、儀器

無菌操作臺（造鑫，Taiwan）

細胞培養箱（Nuaire，USA）

光學顯微鏡（Motic，Japan）

離心機（Beckman）

細胞計數器（Haemocytometer；Boeco，Germany）

酸鹼值測定計（C831；Consort，UK）

微量天平（GR–200；A&D，Japan）

乾浴槽（Model 110001；購自 Boekel）

水浴槽（TKS，Taipei，Taiwan）

去離子水製造機（Minipore，USA）

超高速離心機（Himac CS 120GX）

蛋白質轉漬電泳套組（Bio–Rad，USA）

流式細胞儀（FACSCalibur，BD，USA）

影像分析儀器（AlphaImager^TM2200，USA）

Power supply（Hoefer，San Francisco，CA，USA）

ELISA reader（ANTHOS–2020，Salzbrug，Austria）

Vortex–genie 2（SCIENTIFIC INDUSTRIES，NY，USA）

SDS–PAGE 電泳槽套組（Bio–RAD，USA）

二、材料

細胞培養皿 (騰達行，Taiwan) 細胞培養盤 (騰達行，Taiwan) PVDF 轉漬膜 (Minipore，USA) 蓋玻片 (Kimble，USA)

載玻片 (Marriefeld，Germany) 冷凍管 (騰達行，Taiwan) 微量離心管 (季勗，Taiwan) 離心管 (季勗，Taiwan)

X–film （Kodak，Boston，MA，USA）

三、試劑

Acrylamide/Bis（Amresco，OH，USA）

Annexin V-FITC Apoptosis Detectopn Kit（BioVision，CA，USA）

APS (Ammonium persulfate；Amresco，OH，USA) Bradford reagent (Amresco，OH，USA)

Caspase 3 substrate reagent Kit（OncoImmunin，MD，USA）

DMSO (Dimethyl Sulfoxide，Sigma，MI，USA)

DMEM (Dulbeccco’s Modified Eagle’s Medium；GIBCO，USA)

ECL kit (Perkinelmer，Boston，MA，USA)

FBS (Fetal Bovine serum；Invitrogen，CA，USA) Glycine (Amresco，OH，USA)

Glyerol (Amresco，OH，USA)

Hydrochloric acid (RDH，SE，Germany) Methanol (景明化工，Taiwan)

Penicillin-Streptomycin (Invitrogen，CA，USA) PI (Propidium iodide；Invitrogen，CA，USA)

Protein assay-Dye reagent concentrate (Bio-Rad，MA，USA) Protein maker (Amersham，UK)

RNase A (Invitrogen，CA，USA)

SDS (Sodium dodecyl sulfate；Amresco，OH，USB) Sodium pyruvate (GIBCO，USA)

TBA (2-Thiobarbituric acid；Sigma，MI，USA) TCA (Trichloroacetic acid；Sigma，MI，USA) TEMED（Amresco，OH，USA）

Transfer Buffer（10X TG Buffer）（Amresco，OH，USA）

Tris (Amresco，OH，USA)

脫脂奶粉（安佳，New Zealand）

顯影劑（Kodak，Boston，MA，USA）

定影劑（Kodak，Boston，MA，USA）

第二節、研究設計

一、 藥物配製

將桑黃【圖28】子實體傘部，以 70 ％酒精冷泡 48 小時，取出 溶有桑黃之酒精，將酒精減壓濃縮至膏狀，再將膏狀物置烘箱中使其 烘至塊狀，將塊狀之桑黃研磨至粉狀，完成粗粹步驟。秤取桑黃粉末 32 mg，加入細胞培養等級之 DMSO （ Sigma 編號：D2438）溶解，

先配製好濃度32 mg/100μl 之 PM 溶液，作為平日儲存的 Stock 濃 度，實驗前新鮮配製成10、20、40、80 及 160 μg/ml 等濃度備用。

二、 細胞株培養

血管平滑細胞株 （購自財團法人食品工業發展研究所生物資源 保存與研究中心，生資中心編號：60127，細胞株名稱：A10）來自 胎鼠胸主動脈 ( the thoracic aorta of DB1X embryonic rat )，多應用於 血管平滑肌 ( vascular smooth muscle cells; VSMCs ) 實驗模型。

使用之培養基為 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 內含胎牛血 清 （ Fetal bovine serum ； FBS；一般培養使用 10 % FBS、實驗進 行時使用15 % FBS、同步化時使用 0 % FBS；血清購回後需先水浴 56℃加熱 30 分鐘後使用 ）、 HEPES Buffer Solution 使用劑量 1 %、

Strpotomycin/penicilline 使用劑量 1 %。

將存放血管平滑肌細胞的冷凍小管自液態氮中取出後插上浮

板，迅速放入 37℃ 水浴槽中使其快速解凍，將解凍之細胞懸浮液從 冷凍管中放入10 公分培養皿，並加入約10 ml 含10 %胎牛血清之培 養基，混合均勻後放入細胞培養箱 (37 ℃、95 ％ O2、5 ％CO2 ) 中 進行培養，每二至三天更換一次培養基。當細胞長約9分滿時，則進 行繼代培養。繼代時將舊的培養廢液抽吸乾淨，加入7 ml 1x PBS【表 2】緩衝液 ( pH:7.4 ) 清洗一次，加入Trypsin- EDTA 1ml incubate 2 分鐘，加入 1 ml 10% FBS- DMEM 2 ml 中和Trypsin-EDTA 作用,以 抽吸方式將細胞沖散，將培養皿液體吸換至離心管後加入10 % FBS- DMEM共10 ml，離心1200 rpm，5分鐘，計算細胞數目後進行日常分 盤或實驗用分盤。處理後再將細胞置於細胞培養箱 (37 ℃、95 ％ O2、 5％ CO2 ) 中進行培養。

三、 細胞週期同步化（synchronize）

將細胞分到實驗適合之dish或plates後 (例如：10cm dish 細胞數 目約1 x10⁶ cells/ well)，以含10 % 胎牛血清（FBS）的培養液培養細 胞，並在放入培養箱前稍微搖晃使細胞均勻分佈於dish上。待12～24 小時細胞適應環境並貼覆上 plates 穩定後吸去培養廢液，再以1x PBS緩衝液 （pH:7.4） 2 ml/well 小心清洗1 次，最後加入10 ml/well 的0 %胎牛血清培養液，經24小時後即完成細胞同步化步驟。

四、 細胞生長抑制試驗（cell count）

應用Trypen blue exclusion 實驗計數樣品中的細胞數，因活細胞 會排斥 trypan blue 染劑，僅死細胞會被染成藍色，因此計數亮色的 細胞數可相對得知其細胞存活率。

將細胞分盤至10 cm dish培養，種植細胞數約1×10⁶/dish，以15％

FBS DMEM1ml 培養24小時後，以1 x PBS 10ml 沖洗1次，加入 0﹪

FBS-DMEM 10 ml/dish同步化24小時，以含不同濃度藥物之培養基培 養至時間點，再將10 公分培養皿內之培養液吸去，以約10 ml 的1x PBS 緩衝液小心清洗細胞兩次後加入約1 ml 的1x trypsin-EDTA 置 入37 ℃培養箱內，待2 分鐘後取出。以輕拍培養皿底部的方式將細 胞完全脫離培養皿懸浮起來。加入1 ml 的培養液中和 trypsin-EDTA 活性，並用1 ml 的pipette 以緩慢來回抽吸方式將細胞打散。將打散 後之細胞換到15 ml 離心管中，並加入10 ml培養液稀釋混勻。如所含 細胞密度過高，則算出的數目誤差較大，需再加入更多的培養液稀 釋。取出100 μl 細胞懸浮液和10 μl typan-blue，在96-well內混合均 勻，共取2次。分別從混合液中各取出10 μl 的細胞懸浮液放在細胞計 數盤上下兩個凹槽上，利用蓋上蓋玻片時的虹吸作用將細胞均勻平均 分散於細胞計數區域。在顯微鏡下計數細胞數目(細胞顏色較亮者為 存活的細胞)並算出細胞計數盤內9大格中5格 (左上角及右上角區域) 之活細胞總數 ( N 值)。N 值除上10，再乘上1.1 （稀釋倍數）x10

（細胞懸浮液總量）x 10⁴ 即可得細胞總數目 ( cells/10ml )。

五、 DNA 抽取與電泳分析

將 A10 細胞同步化並給予藥物 PI（20、40 及 80 μg/ml）後，

於 48 小時後，使用 trypsin-EDTA 將細胞收起，以 DNA ladder kit

（GeneMark，Atlanta，USA）將細胞中的 DNA 抽出，並將 DNA 暫 放置於冰上，再取Agarose 粉末與 1x TAE 溶液放入血清瓶中，以微 波每次30 秒加熱致澄清為止。將滾燙的液態膠倒入 50ml 離心管中，

以手觸摸離心管外壁帶膠體溫度約降至50^oC 左右後加入 EtBr ( 量為 1μl/10ml Gel )，混合均勻。將膠體緩慢倒入造膠台中，並以 tip 將膠 上的氣泡趕走。待膠硬化後，加入 300~35 ml 的 1x TAE 溶液當作 Running buffer。Loading 6~10ul 的 DNA Marker 【表 4】，再 Loading sample ( DNA 與 6x Loadong buffer 以 5:1 之比例混勻 )。最後設定 100V、30 分鐘為跑膠條件。

六、 細胞凋亡偵測試驗

1、使用 MC540 及 propidium iodide 進行偵測

首先將 MC540 溶在 50％ EtOH 中，配製成濃度為 1mg/ml 之溶 液，而propidium iodide 則溶在 PBS 中，配製成濃度為 5ug/ml 之溶液 備用。將 A10 細胞同步化 （ 24 小時）並給予藥物 PM（20、40 及 80μg/ml）後，於 24、48 及 72 小時後，使用 trypsin-EDTA 將細胞收

起，再加入 0.375 ml 之 10﹪FBS-DMEM，接著分別加入 125 ul 的 propidium iodide （ 濃度為 5ug/ml ），及2.5 ul 的 MC540 （ 濃度為 1mg/ml ），混合均勻，靜待約1 分鐘後，上機使用流式細胞儀 （ flow cytometer ） 檢測凋亡細胞的比率。

2、使用 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 進行偵測

將 A10 細胞同步化並給予藥物 PM （20、40 及 80 μg/ml ）48 小時後，使用 trypsin-EDTA 將細胞收起，加入 500 ul 的 Binding Buffer，再加入 5 ul 的 Annexin V-FITC 及 5 ul 的 propidium iodide，

避光靜置於室溫中5 分鐘，混合後放於載玻片上，蓋上蓋玻片，使用 螢光顯微鏡進行凋亡細胞之檢測。當被Annexin V-FITC 染到將呈現 綠色螢光，而被propidium iodide 染到將呈現紅色螢光。

七、 西方墨點法 （ Western blot ） 偵測相關蛋白變化 1、細胞蛋白質抽取

將培養於10cm dish 的細胞取出，加入 5 ml 1x PBS 沖洗 2 次，

加入500 μl 的 lysis buffer 反應 3 分鐘，使用細胞刮杓將細胞刮下並 將細胞液體收集至微量離心管放入乾浴加溫器內加溫 （ 95℃、5 分 鐘 ），隨即放置於冰上30 秒以上，4℃離心 （ 13000 rpm、10 分鐘 ）， 取上清液，進行蛋白質定量或冰存於 -20℃。

2、蛋白質定量

使用 Bradford 製作蛋白質檢量線【表 3】，Bradford 為蛋白質染 劑，有毒性，使用時需戴手套。加入染劑混合均勻後需反應5 分鐘在 測吸光值 。吸光值測定時每個樣本數需 3 重複，使其數值穩定。以 測定出來的標準品吸光質與蛋白質濃度畫出檢量線，並求出趨勢線方 程式即R²值。R²值需 > 0.99 以上的準確度。算出蛋白質檢量線並求 出趨勢線方程式，經帶入測得之吸光值 ( y )，則可求出蛋白質濃度 ( μg/ml )。

樣品蛋白質濃度測定時，取10 μl 的樣品與 790 μl 的 DDW 混合，

再加入200 μl 的 Bradford 染劑，均勻混合 5 分鐘後以 O.D 590 測定吸 光值。將樣品吸光值 ( y ) 帶入算出趨勢線方程式，則可算出樣品蛋 白質濃度 ( x )。

3、蛋白質電泳（ SDS-PAGE ）

組合鑄膠檯，注入DDW 確定無滲漏之情形，依照下列配方先配 製 12％ 下層膠。下層膠注入造膠檯內約八分滿，剩餘的空間先用 DDW 填滿去除上面的氣泡並壓平膠之上緣，等待凝固約 30 分鐘，

造上層膠，TEMED 則須等下層膠凝固後將 DDW 倒出後加入，下層 膠凝固後，注入上層膠，插入 comb 等待凝固約 30 分鐘將 comb 取 出後先用DDW 清洗 well，將膠檯放入電泳槽內裝滿 Running buffer，

將 loading sample 先加熱 （ 95℃、5 分鐘 ）立即放置於冰上冷卻 30 秒以上，將 Marker （ 5～10μl ）和 sample （ 10 μl ）loading 到 well 內，利用 100V 跑電泳約 2 個半小時，取出下層膠準備進行

4、西方墨點法（Western blot）

PVDF membrane 需先用 Methanol 潤濕 30 秒，將下層膠自水龍頭 下取去下，並將膠體放至轉漬夾上其順序如下：

正極（＋）

負極（－）

將轉漬夾合上放入Transfer box 蓋上蓋子放置冰桶中並加滿冰塊，放 入4℃冰箱內，Transfer 條件設定 60 valtage，轉印時間 2 小時，將轉 印後的PVDF membrane 放入 5 % fat-free milk 室溫 bloclking 2 小 時，0.1 % PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次，把 membrane 放入含有一級 抗體的小盒內，4℃冰箱搖晃至隔天。接著取出 membrane 放入 0.1 % PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次，將 membrane 放入含有二級抗體，室溫 搖盪1 小時，取出 membrane 放入 0.1 % PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次 後進行暗房底片顯影。

5、暗房底片顯影（壓片）

白底網夾 海綿 Filter paper

PVDF membrane 膠體(gel) Filter paper

海綿 黑底網夾

準備用物：dropper、cassete、鑷子、感光底片、剪刀、透明膠片、

ECL kit、Developer、Fixer，先將 membrane 浸泡於 ECL （比例為 1:1 ）混合液中約 30 秒，將 membrane （正面朝上）放置於透明膠 固定好，剪適當大小的底片，曝光時間依membrane 上冷光亮度決定，

數秒至1 小時，曝光後用顯影劑及定影劑洗底片，後將底片風乾保存 並進行分析。

第三節、統計方法

實驗結果以 SPSS 軟體之單因子變異數分析（one way ANOVA）

計算分析。數據結果以 mean ± SE 表示各項值。（圖中＊表示與 15%

FBS-DMEM 相比，P＜0.05）。

第三章、實驗結果

第一節、PM 對 A10 細胞型態的影響

A10 細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，給予不同濃度的 PM

（20、40 及 80 μg/ml），放入培養箱培養時間分別為 24、48 及 72 小時。藉由倒立光學顯微鏡，放大倍率40 倍觀看細胞型態上之變化。

發現給予PM （ 24 及 48 小時 ），濃度 20、40 及 80 μg/ml 時，細 胞型態上呈現較不規則且偏圓形，與正常A10 細胞之紡垂狀不同【圖 6、圖 7】。而在PM （ 72 小時 ） 時，濃度 10、20、40 及 80 μg/ml 時，細胞型態上呈現較不規則【圖8】。

第二節、PM 對 A10 細胞存活率的影響

A10 細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，給予不同濃度的 PM

（10、20、40 及 80 μg/ml），放入培養箱培養時間分別為 12、24、

48 與 72 小時。藉由 trypan blue 染劑進行細胞計數 （ cell count ） 而判定細胞存活率之高低。結果顯示，不同濃度之 PM 於 A10 細胞 12 小時並無明顯抑制細胞生長【圖 1】；將時間增加至 24、48 小時後，

濃度 20（p＜0.05）、40（p＜0.05）及 80（p＜0.05） μg/ml 有抑制 細胞生長情形【圖 2、圖 3】；於 72 小時之作用時間點，發現 10（p

＜0.05）、20（p＜0.05）、40（p＜0.05）及 80（p＜0.05） μg/ml 濃 度之PM 皆會對 A10 細胞產生抑制的作用【圖 4、圖 5】。

第三節、PM 對 A10 細胞是否造成細胞凋亡之現象

一、以DNA 裂解方式探討

A10 細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，給予不同濃度的 PM

A10 細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，給予不同濃度的 PM