結果討論

本研究主要以體外（in vitro）方式為主軸，實驗進行中將培養基 的血清濃度由原本的10 ％ 提高至 15 ％，主要是利用血清本身含有 生長因素可以促進細胞增生，模擬粥狀動脈血管疾病中平滑肌細胞增 生的狀態，進而探討給予桑黃（ Phellinus merrilli PM ）是否可誘導 增生的平滑肌細胞（A10）產生細胞凋亡的情形，進而減少細胞增殖。

一、桑黃對於平滑肌細胞存活率的影響

粥狀動脈硬化是一種慢性發炎伴隨著自由基傷害、脂質堆積與平 滑肌不正常細胞增生的血管性疾病，不正常的細胞增生就如同癌細胞 一樣。在本論文中，將增生的平滑肌細胞加入不同濃度的 Phellinus merrillii，經由細胞計數後發覺在 20μg/ml 的濃度下，培養 24 小時

開始即開始產生存活率下降、細胞數減少作用，且具有統計上的意義

（p＜0.05）【圖2】，此外在 20μg/ml 的濃度下培養 24 小時後，細胞 形態改變 (包括細胞皺縮、細胞質濃縮、細胞核型態改變)，因此認 為異常增生的平滑肌細胞給予桑黃後會造成其細胞凋亡。

文獻中有非常多的報告指出，真菌這種高等植物可以有效的抑制 腫瘤的增生，而它的效果大多是透過宿主的防衛功能增強來達到目 的。這種防衛功能的增強是因為高分子多醣體的影響。實驗結果發

現，靈芝可顯著促進抗體產生增強自然殺手細胞（NK Cell）之免疫 功能，同時證實口服、腹腔內注射與靜脈注射給藥都有效，而且呈現 良 好 的 劑 藥 反 應 （ dose-dependent manner ） 與 時 程 反 應

（time-dependent manner）關係（66）。靈芝也能促進造血功能及抑 制人血癌細胞（HL-60）增殖。由抗腫瘤有效成份分析結果證實，靈 芝這種防衛功能的增強，同樣也是一種叫高分子多醣體的關係。這種 成份可以增加抗體、誘導干擾素、增加自然殺細胞，自然而然的增強 宿主的免疫功能，抑制不正常的腫瘤細胞。最近實驗結果更發現靈芝 能激發人類巨噬細胞產生細胞激素。於誘導人血癌細胞（Leukemic U937）分化效應的實驗中發現靈芝能刺激人血液單核細胞（Blood Monouclear Cell）分沁細胞激素如 TNF-α、INF（interferon）、IL-1β 等明顯的抑制人血癌細胞（U973）分裂（Proliferation）並誘導其 分化（Differentiation）完全。而於靈芝抗肺癌實驗時發現靈芝能 有效延長肺癌動物存活時間與增加存活率。若與抗癌藥 Adriamycin、

Fluorouracil、Thioguanine、Methotrexate 、Paclitaxel 或人工 合成免疫功能增強劑 Imexon 合併使用更能有效的延長動物存活時間 達三倍於控制組並顯著地降低動物死亡率。因此靈芝有明顯增進抗腫 瘤免疫功能對腫瘤防治具有重大意義。除了我們對於靈芝於抑制癌症 方面的了解以外，其實其它蕈類對於癌症的預防以及治療有下列諸多

的研究。

而文獻中桑黃對癌症的影響，以體外 （ in vitro）方式中，

而與 Phellinus merrillii （PM）同屬不同種的桑黃，也具有相似 的效果，2005 年有研究指出不同種名之桑黃 Phellinus igniarius（PI）

萃取出的phelligridimer G 對於人類卵巢癌細胞 （ A2780 ）及人類 結腸癌細胞 （ HCT-8 ）皆有抑制作用（22）。同年也有研究指出 Phellinus igniarius 萃取出的 phelligridimer A 於 10.2 μM 可造成肝

癌細胞50% 的致死率（21）。而 Phellinus linteus （PL）文獻指出其 可抑制多種癌症細胞，並造成細胞凋亡的發生，包含黑色素瘤細胞

（ B16BL6 ）、結腸癌細胞（ SW480 ）等，無論是無論體內（in vivo）

或體外的方式（in vitro）（35、37、38、39、40），並且細胞內機制可 能包含活化ERK、p38、NF-κB 所造成（39、43）或是活化 cytochrome c 及抑制 Bcl-2 所造成（38）。Phellins givus（PG）有關的研究也指出 其可造成人類胃癌細胞（TMK-1）proliferation 的減少及 Apoptosis 的 發生，並可抑制 MCA-102 細胞生長，並在體內（in vivo）的實驗中 發現PG 可造成腫瘤體積變小（27、37）。Phellinus rimosus（PR）相 關的研究也指出其可造成淋巴癌細胞及肝癌細胞發生抑制的情形

（41、42）。

二、桑黃誘導平滑肌細胞產生細胞凋亡

為了要了解 PM 誘發 A10 細胞生長抑制的可能基轉，我門進一 步研究PM 是否會誘發細胞凋亡的產生。因此使用流式細胞儀及螢光 顯 微 鏡 偵 測 細 胞 凋 亡 早 期 變 化 ， 卽 細 胞 膜 上 磷 脂 質 絲 氨 酸

（ Phosphatidyl Serine；PS ）的外露；健康的細胞膜具不對稱性，磷 脂質絲氨酸只存在於細胞內膜層而不外露，並且在晚期時會有細胞膜 不完整與 DNA 斷裂的情形，因此在本論文中使用 Annexin V 及 Propidium iodide 進行雙染，其中 Annexin V 會與翻轉至膜外的磷脂質 絲氨酸特異性結合，而發出綠色螢光，另外晚期Propidium iodide 會 與斷裂的DNA 結合。所以早期的凋亡只有 PS 翻轉只表現 Annexin V 的綠色螢光，而晚期的細胞凋亡則除了 PS 翻轉表現的綠色螢光外，

還有細胞膜不完整所以Propidium iodide 會進到細胞中與 DNA 結合發 出紅色螢光。而本論文還使用MC540 與 Propidium iodide 進行雙染，

其中MC540 與 Annexin V 為相同作用。在實驗結果中，藉由流式細 胞儀得知，在平滑肌細胞中給予桑黃可以增加凋亡細胞的百分比（p

＜3 個不同時間點的百分比將之列出來並且註明其 p value 統計）【圖 10、11、12】，且在螢光顯微鏡的使用下，看到只有在給予桑黃情形 下，在細胞核才會出現紅色螢光，而細胞膜才會產生綠色螢光【圖 13】。因此我們可以推論給予桑黃後，會造成增生的平滑肌細胞走向 細胞凋亡。

相關聞文獻提及，醫藥蘑菇Ganoderma lucidum (G. lucidum) 在東 方社會被使用為癌症的預防。其中高分子多醣體乃為一免疫促進劑試 教為人所知的一部份，事實上，其它主要組成部分包括三萜類。在此 篇報告中,作者了解從G. lucidum萃取出三萜類的萃取物WEES-G6對 於癌症的作用。發現WEES-G6可以抑制人類的hepatoma Huh-7 細胞 成長, 而且，其不會抑制正常人肝臟細胞株。WEES-G6藉著活化JNK 和p38 MAP kinases，降低protein kinase C，可以致延長細胞周期的G2 期，在正常肝臟細胞沒有了這些現像。磨菇多聚糖，從Phellinus linteus

之水層萃取物有抗腫瘤和免疫調節的物質，特別是,酸性多聚糖

(aPL)。aPL於動物體內顯著誘導NO之產生。藉由NO之產生，aPL增 加B16細胞的死亡率。這些結果建議, PL刺激NO產生為tumoricidal，

並且過程也使PL導致它的治療作用的機制（67）。由Phellinus linteus 分 離 出 來 的protein-bound 多 聚 糖 細 胞 毒 素 抑 制 人 類 結 腸 癌 細 胞 SW480的擴散和增殖。流式細胞儀分析表示, PL促進細胞的凋亡，並 且其sub-G1和G2/M兩者階段的細胞數目都有增加的情形產生，細胞 的凋亡和成長抑制可能與Bcl-2的減退, 細胞色素c釋放的增加聯繫在 一起,和減少了cyclin B1表現有關。這些結果建議, PL可以有抗腫瘤作 用。從Phellinus linteus分離出來之proteoglycan (PG)可以因為活化 CD11c+CD8+DC 以 及 type-1 helper T 細 胞 ， 進 而 抑 制

MCA-102-tumor-bearing 癌症的成長（68）。從Phellinus linteus的果 實或菌絲體水層萃取物有抗腫瘤和免疫調節的活性（69）。從Phellinus linteus被分離出來之酸性多聚糖(aPL)可以刺激增殖T淋巴細胞和B細 胞之活化,和抑制腫瘤成長和轉移（70）。據早先報導, 從Phellinus linteus多聚糖PL刺激了細胞調節和體液免疫。PL單獨增大延長了 B16F10變種老鼠的生存率,抑制腫瘤生長在NCI- H23-變種的裸體老 鼠,和減少了B16F10 肺黑瘤轉移率。Adriamycin顯著地抑制了腫瘤成 長,但輕微地抑制了轉移。PL和adriamycin的組合式療法更有效在抑制 腫瘤成長,但不是轉移。PL沒有誘導直接毒性在癌細胞裡,這是免疫化 學療法的特性。總而言之, PL也使用在癌症的免疫化學療法由於它的 有效的活力在腫瘤成長和轉移通過患者的免疫效力沒有毒力（71）。

關於Phellinus gilvus (P.G.)在黑色素瘤方面，其抽出物PG抑制B16F10 黑 色 素 瘤 細 胞 株 的 增 殖 並 且 造 成 其 細 胞 凋 亡 （72 ） 。 Polypore macrofungus, Phellinus rimosus (Berk) Pilat.之乙酸乙酯、甲醇和含水萃 取物對於Dalton,slymphoma腹水(DLA)及Ehrlich,s腹水癌(EAC)細胞株 具有細胞毒性和抗癌活性。研究結果推論，對這個蘑菇的潛在的用途 作為抗癌症使用，也有學者發現Phellinus linteus的抽出物可以抑制血 管新生，並有抗氧化的作用。在以上諸多對於靈芝以及桑黃的研究 中，我們可以發現蕈菇類在癌症方面的研究非常的豐富，那麼到底桑

黃對於異常增生的平滑肌細胞影響為何呢，是我們研究的重點。

三、桑黃誘導平滑肌細胞走向凋亡的路徑

細胞凋亡的程式進行可藉由外在途徑，例如：Fas / Fas ligand、

死 亡 接 受 器 ； 或 內 在 途 徑 ， 例 如 ，Bax / Bcl-2、粒線體釋放 出 cytochrome C 等調控，最後皆會活化 caspase 3 表現進行細胞凋亡。

血管平滑肌細胞凋亡參與粥狀動脈硬化行程過程即包括此二條途 徑。文獻指出Shear stree 引起血管平滑肌細胞凋亡是經由 Fas / Fas ligand 途徑（60）；Chae 等人也在2004年研究報告指出， Nitric oxide 也會引起大鼠血管平滑肌細胞進行凋亡，而這個機制是經由短暫的 cytochrome C，活化 caspase-3 及 Bax / Bcl-2的表現所引起的（61）。

在本實驗中，為了探討細胞在凋亡過程中的機制，運用了西方墨點法 的方式，找出參與其中的相關蛋白，發現當中有一些相關的蛋白有表 現增加的情形，綜合文獻可能推論為p38蛋白活化後造成 p53 蛋白的 表現量增加，進一步促進下游凋亡相關基因的轉錄如：pro- apoptosis Bax protein、Fas / CD95 ligand，使胞內的 Death domain 改變並與 pro-caspase-8（或-10）結合，形成DISC（death-inducing signaling complex），進而激活 caspase-8（-10），引起Caspase 級聯反應，最 後降解結構蛋白和功能蛋白引起細胞凋亡，並活化下游p21使細胞週 期停滯造成細胞無法proliferation。也或者 p38 活化後造成MAPK級

聯反應而造成細胞凋亡（45、46、60、61）。但在本實驗中有增加表 現的蛋白有p38、p53、Fas、Bax、caspase 3、p21等蛋白，因此顯示 細胞凋亡所走的路徑可能為， p38 造成 p53 蛋白表現增加，進而使 得下游的 p21 也被活化，且與凋亡相關的蛋白如 Fas、Bax，最後活 化 caspase 3 而使細胞凋亡。這顯示由PI所誘導的細胞凋亡路徑中，

所參與的可能角色包含了 Extrinsic pathway 及 Intrinsic pathway。