實驗步驟

4.6.1 連續式母槽之培養

本實驗選擇以連續式母槽培養方法配合批次式藻類毒性試驗，以下 將介紹連續式母槽培養之方法與步驟。

1 連續式藻類培養之步驟如下：

(1) 接種環以酒精燈滅菌後，刮取固態培養基上之藻種些許，將其放入 250ml 錐形瓶中加入基質（含 100﹪EDTA）至 100ml，錐形瓶瓶口封 上滅菌紗布後放到震盪器上震盪以活化藻類。

(2) 當 250ml 錐形瓶中之瓶藻類生長至一定大小(顏色明顯變綠)時，將之 倒入1000 ml 錐形瓶中加入 900ml 基質培養。

(3) 當 1000 ml 錐形瓶中之藻類生長至一定數目時即可將之到入 5 公升之 連續式培養母槽中，並加入3 公升之基質。通常 2~3 天後藻細胞數目 達到一定數目後即可開始入流新鮮基質。

(4) 每日皆需配製約 1~2 公升新鮮之基質（含 10﹪EDTA）以提供藻類充 足 之 養 份 ， 確 實 測 量 溢 流 率 以 調 整 pump 進流速度至液流率為 1000ml/day 為準，並每日量測連續式培養母槽中藻細胞之細胞密度

（Cell Density）、平均細胞體積（Mean Cell Volume）以了解藻類之 生長情況。

(5) 當母槽之 Cell Density 達到 1.7~2.2 ×10⁶ cells/ml，MCV 值達到 39~46 時即可自母槽取出藻液開始進行毒性試驗。

2. 藻類培養環境設計如下：

5 公升之連續式培養母槽及裝營養基質之廣口瓶、無菌膠管等經過清 洗、殺菌之後，置於24 ± 1℃之溫度控制室中，並將連續式培養母槽放置 在磁石攪拌器上連續攪拌，攪拌具有混合和避免藻類沈澱之功能，能使 藻液和加入之營養鹽以及曝氣之氣體均勻的混合。連續式培養母槽所需 之燈光由一方照射，使用白冷光燈，其光照強度為 4300 ± 10％ lux。本 實驗中，連續式培養母槽之曝氣設備所提供之曝氣量為250 ml/min，且空 氣進入母槽之前先經洗滌瓶和空氣濾膜，以去除空氣中之雜質，並藉此 濕潤空氣。

Fig. 4.6.1 連續式藻類培養裝置圖

4.6.2 藻類毒性試驗

當母槽之Cell Density 達到 1.7~2.2 ×10⁶ cells/ml，MCV 值達到 39~46 時，就可以做密閉式藻類毒性試驗。首先必須配置稀釋水，接下來以二 氧化碳（CO2）及氮氣（N2）之混合氣進行曝氣約十五分鐘，曝氣步驟可 以降低營養基質中之溶氧值使初始溶氧降低至1.0 mg/l 上下並增加其 CO2

濃度。並且由母槽所測得之藻細胞數換算得到欲使每個 BOD 瓶初始細胞 密度為 1.5 ×10⁴ cells/ml 所需加之藻液量，隨後自培養母槽中取出適量之 藻液，分別加入各個 BOD 瓶內。隨後加入曝氣好之純水，然後逐瓶加入 所需之營養基質和不同體積的毒性物質以達到所需的濃度。之後一一測 量每個BOD 瓶之初始溶氧值並紀錄之，BOD 瓶測完溶氧後以瓶蓋進密封 以達到水封之目的，然後將BOD 瓶置於震盪器上震盪 48 小時。實驗條件

控制在溫度24 ± 1℃，光照來自於上方平行照射，強度為 4300 ± 10％ lux 之白冷光燈，震盪頻率為 100rpm。於 48 個小時後 BOD 瓶自震盪器上取 下，隨後量測各個BOD 瓶中之最終溶氧值（Final DO，DOf）。由最終溶 氧值減掉初始溶氧值可得到一溶氧差，為淨溶氧值（△DO）。測完溶氧後 接著利用顆粒計數器測量每個 BOD 瓶的藻類細胞密度。透過劑量反應關 係模式之分析可以得到以淨溶氧差值（△DO）以及藻細胞密度為試驗終點 之EC50值，並可以得到毒性物質與藻類之劑量反應關係圖。

每一化合物至少做兩次以上的試驗，第一次會先做 range finding，找 出其可能的濃度抑制範圍，接著才做確定試驗。而每一組試驗中做七個 濃度，包含控制組就有八瓶，每一濃度做三重複，而控制組是不加任何 毒性物質的。