影響藻類毒性試驗的重要因子

進行實驗時，不同的操作參數都將影響實驗結果，在進行毒性試驗 之前，我們必須對各種參數加以嚴格的控制，並了解各參數對於藻類毒 性試驗之影響為何。在本實驗進行的同時，有以下參數列入考慮：

pH 值的控制

在自然界中，藻類會因為光和作用的原因而使得 pH 在一天中就產生 很大的變化，若是不對pH 加以控制而允許 pH 之變動，可能會降低毒性試 驗的再現性，也因此不容易預測在一特定 pH 值之下試驗毒物對藻類所造 成的毒性。因此標準藻類毒性試驗皆傾向其 pH 值維持在固定。不同的標 準方法對於pH 的變化皆有則不同之規定，如 U.S.EPA 要求最終之 pH 需 在8.5 之下，OECD 則規定 pH 的變化不可超過一個單位; ISO 則要求 pH 的變化不可超過 1.5 的單位。欲減少 pH 值之改變，大致的方法有下列幾

本研究依據早期之藻類毒性研究方法（林國清，1997）於進行毒性試 驗前，將pH 控制於 7.50 左右，使其減少 pH 變化所造成之可能誤差性。

試驗時間

毒性試驗的敏感性及數據結果皆易受試驗時間之長短而有所影響，

當試驗時間過長時，會導致BOD bottle 內之營養鹽不足進而影響控制組之 生長，使得處理組與控制組於最終產量的差距漸漸縮小，另一方面，過 長的試驗時間亦會使得毒性的反應消失。本試驗依據早期之密閉式藻類 毒性試驗方法（林國清，1997），試驗時間為 48 小時。

光照

光照的強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率之不 同（Nyholm and Kallqvist, 1989）。不同標準方法有些許的差異，良好的混 合可以減少自身遮蔽的現象，以避免因為與光源的距離不同而造成光照 強度之差異。為了模擬真實的自然環境，另有一種光照方式為光暗交替 循環的方式，雖然此方式較接近真實環境，但因為此光暗交替會使細胞 同步分裂，而使細胞體積的變化更加複雜，無法以細胞數目代替生物質 量。若是試驗生物能在連續光照的情況下生長良好，則其對毒性試驗的 結果與光暗交替循環的方式並不會有太大的差異產生。

本 研 究 依 照 U.S.EPA （ 1996 ） 標 準 方 法 針 對 Pseudokirchneriella

subcapitata 的規定，於連續式培養和批次試驗中所選擇的光照的強度為 64.5 ± 10% μEm^-2s^-1（4300 lux），且以連讀式的光照來排除光暗交替循環 式的光照所導致的藻類生物質量變異的缺點。

溫度與植種數量

當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長溫度 後即迅速下降。本研究採用 U.S. EPA 建議的 24℃環境下來培養藻類及進 行實驗，整個培養及試驗過程中，溫度之變化不可大於2℃。

在批次式的藻類毒性試驗中，藻液初始細胞密度的不同會對整個實驗

的結果產生影響。若在實驗開始時加入過量的藻液，使得藻類細胞大量的 生長，將使代謝物大量累積且迅速消耗營養鹽及碳源而使得 pH 值增加進 而影響到毒性試驗的結果。Lin（2001）針對不同試驗時間和不同初始植種 密度進行敏感度和變異性的分析，發現生物毒性試驗隨著時間增加，其敏 感度提高而C.V.值減少；而隨著初始植種密度減少，其敏感度提高但 C.V.

值亦提高。考量實驗的變異性以及敏感度，本實驗選定藻類初始細胞密度 為1.5×10⁴ cells/ml。

試驗用培養基

測試時使用之培養基對於藻類毒性試驗之影響極大（Chen et al., 1994），其主要之影響因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽 離子。一般為使試驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微量 元素，於試驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，如 ISO（1987）於培 養基中加入 78µg/L 的 EDTA 螯合劑。但是，因為螯合劑的加入會影響毒 性試驗之結果，尤其是進行重金屬對藻類之毒性影響試驗時（Sorvari and Sillanp, 1996），因此，1996 年 U.S. EPA（1996）建議在培養藻液時可加 入固定量之螯合劑於培養基中，但在進行藻類毒性試驗時，則不加入任 何之螯合劑。Lin（2001）以初始細胞密度為 10⁵ cells/ml，毒性物質為重金 屬鋅，毒性試驗時間為12 小時，分別對營養基質中 EDTA 含量為 0（0﹪

EDTA）及 300 µg/l（100﹪EDTA）進行毒性試驗。結果正如預期中，加入 EDTA 會因為其和重金屬之螯合作用而降低重金屬對藻類之影響，進而降 低了敏感度。因此本研究於試驗時亦不加EDTA。

為了解HCO3-對於毒性試驗之影響，Lin（2001）進行兩組試驗。一組 初始細胞密度為 10⁵ cells/ml，毒性試驗時間為 12 小時，毒性物質為重金 屬鋅及鎘的條件下，分別進行營養基質採用原U.S. EPA 營養基質（HCO3

-加倍後對毒性試驗敏感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其毒 性反應造成太大之影響。

藻類生長量測方法

在進行藻類毒性試驗時，我們必須要有一個能夠正確的反應出藻類 生長情況之方法。一般藻類生長情況之參數有下列幾種：細胞密度、細 胞總體積、乾重、葉綠素、活體內螢光值、營養基濁度、產氧量、ATP 及 DNA 等等之參數。研究人員可以基於其實驗室之器材設備、實驗條件 下 之 可 行 性 以 及 研 究 題 目 等 相 關 因 素 來 決 定 其 所 要 使 用 之 實 驗 參數

（Rehnberg et al., 1982）。

一般藻類毒性試驗之標準方法皆是於試驗終點時，測量藻類的生物 質量。而量測生物質量最直接的方法就是量測生物之乾重，但是直接測 量生物乾重之方法，非常之耗時費力，所以利用電子顆粒計數器、光學 顆粒計數器等之間接量測生物質量的方法漸漸的將直接測量生物質量之 法取而代之，這些方法不僅簡單、快速，所需的藻液量亦少，且與生物 乾重間有良好的相關性。此外溶氧測定也擁有成本低廉、試驗時間短等 優點。

故本研究是以測量藻類之細胞密度以及溶氧之變化當作觀測終點，

以電子顆粒計數器測量細胞密度，溶氧測定儀測量藻液中溶氧量之變化 量，並藉由Probit 模式將實驗結果轉變成藻類生長抑制率及斜率。