以密閉式藻類毒性試驗方法評估二級、三級炔丙基醇類之毒性與結構–活性關係之研究

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩士論文

以密閉式藻類毒性試驗方法評估二級、三級炔丙

基醇類之毒性與結構–活性關係之研究

The Study of Toxicity Assessment of Secondary and

Tertiary Propargylic Alcohols Using a Closed-System

Algal Test and The Quantitative Structure-Activity

Relationships

研究生：范哲偉

指導教授：陳重元 博士

以密閉式藻類毒性試驗方法評估二級、三級炔丙基醇

類之毒性與結構–活性關係之研究

The Study of Toxicity Assessment of Secondary and Tertiary

Propargylic Alcohols Using a Closed-System Algal Test and

The Quantitative Structure-Activity Relationships

學生：范哲偉

Student：Je-Wei Fan

指導教授：陳重元

Adviser：Dr. Chung-Yuan Chen

國立交通大學

環境工程研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering College of Engineering

National Chiao Tung University In Partial Fulfillment of the Requirements

For a Degree of Master of Science

In

Environmental Engineering July 2008

以密閉式藻類毒性試驗方法評估二級、三級炔丙基醇類

之毒性與結構-活性關係之研究

學生：范哲偉 指導教授：陳重元

國立交通大學環境工程研究所

摘 要

本研究以藻類（Pseudokirchneriella subcapitata）利用 BOD 瓶進行一 密閉式系統之毒性試驗，使用溶氧變化量（△DO），藻細胞的數量變化 （Final yield），以及以藻類細胞密度變化量計算所得的生長率（Growth rate）三個終點，評估二級以及三級炔丙基醇類之毒性，藉由 Probit 模式求

出半致死濃度（50% Effect concentration，EC50）。以及利用物化參數 logP

以及Elumo值來評估這一類化學物質之QSAR。

本次實驗結果可發現三個參數中以Final yield 的敏感度是最高的，而

二級炔丙基醇類之毒性高低是和其炔基接的位置有一定的關聯性，三級 炔丙基醇類之毒性則與疏水性的高低有關：疏水性越高其毒性越強。在

與 其 他 物 種 敏 感 度 比 較 方 面 ， 敏 感 度 的 高 低 排 列 如 下 ：BOD-FY >

BOD-DO > Fathead minnow > BOD-GR >Tetrahymena Pyriformis。

在QSAR 的分析方面，二級炔丙基醇當中去除三個炔基接在一的位置

比EC10較能提供生物更嚴謹的保護標準。

The Study of Toxicity Assessment of Secondary and Tertiary

Propargylic Alcohols Using a Closed-System Algal Test and

The Quantitative Structure-Activity Relationships

Student: Je-Wei Fan Advisor: Chung-Yuan Chen

Institute of Environmental Engineering

National Chiao Tung University

Abstract

A closed-system algal toxicity test was applied to evaluate the toxicity of secondary and tertiary propargylic alcohols to Pseudokirchneriella subcapitata. The effects of propargylic alcohols were evaluated by three kinds of response endpoints, i.e., dissolved oxygen production, cell density, algal growth rate. Median effective concentraton (EC50) were estimated using the Probit model. The quantitative structure-activity relationships (QSARs) were established based on the 1-octanol/water partition coefficient (logP) and an electronic parameters-lowest unoccupied molecular orbit (Elumo).

The result shows that the highest sensitivity is cell density between three end points, and the toxicity of secondary and tertiary propargylic alcohols is correlation to the position of alkynyl and hydrophobicity, respectively. Compare with sensitivity for other species, BOD-FY > BOD-DO > Fathead minnow > BOD-GR > Tetrahymena Pyriformis。

good fit (R2 = 0.914~0.965). Moreover, a cut-off value approach is proposed to determine whether NOEC or EC10 should be chosen for estimating low toxic effects. The results indicate that NOEC offers better protection to test organisms than EC10.

Keywords: Pesudokirchneriella subcapitata, QSAR, Propargylic alcohols, Median effective concentration (EC50)

誌 謝

在交大就讀兩年的時間裡，終於順利的完成了碩士論文，而在一路上 非常感謝恩師 陳重元教授給我嚴格的指導與鼓勵，使我獲得許多專業上 的知識，以及努力不懈的態度。也很感謝交大環工所 林志高教授、清大 醫環系 董瑞安教授以及中山醫大職安系 趙木榮副教授在論文計畫書的 審核以及口試期間提供了許多寶貴的意見給我，使得本論文更加的完整以 及嚴謹。 在兩年的研究生涯裡，感謝學長 裕勝在研究上給我許多的教導，還 有學姊 詔棻以及另外兩位同學 冠良、俊竹在實驗上的指導與幫助，以及 在課業上所獲得的幫助；學弟妹 介華、欣妤、百珊雖然是新進成員，但 他們認真努力學習的態度使得實驗室的運作良好，這些都是使我論文能夠 順利完成的一大原因。也要謝謝其他研究室的同學 學詩、亮毅、靑洲、 偉志、棈榮、立偉以及清華大學的朋友 偉群、朝陽等等，時常在生活中 互相幫助、扶持，使得我的生活更加的多采多姿。 最重要的是感謝我的家人，他們在這兩年來對我的鼓勵以及支持，並 且提供我生活上許多的幫助，使得我能夠順利地完成研究所的學業，並且 使我對未來的方向更加的明確，特別謝謝你們！

目

錄

表次 頁次 中文摘要... I 英文摘要... III 誌 謝...V 目 錄...VII 表目錄...X 圖目錄... XI 第一章 前言... 1 1.1 研究緣起... 1 1.2 研究目的... 3 1.3 研究方法與架構... 4 第二章 文獻回顧... 6 2.1 毒性試驗物種... 6 2.2 試驗物種簡介... 6 2.3 藻類毒性試驗方式... 7 2.4 影響藻類毒性試驗的重要因子... 9 2.5 定量結構-反應關係（QSAR）... 12 2.5.1 QSAR簡介... 12

2.6.2 炔丙基醇之應用 ... 18 2.6.3 炔丙基醇之毒理特性 ... 18 2.6.4 炔丙基醇之QSAR... 21 第三章 基本理論... 22 3.1 毒性物質劑量-反應模式... 22 3.2 基本生長動力學... 23 3.3NOEC ... 24 3.3 平均中斷值（Cut-Off value）... 25 第四章 實驗設計與方法... 26 4.1 實驗設備... 26 4.2 試驗藻種... 32 4.3 培養基質的配製... 32 4.4 試驗毒物... 35 4.5 實驗前準備... 35 4.6 實驗步驟 ... 38 4.6.1 連續式母槽之培養 ... 38 4.6.2 藻類毒性試驗 ... 40 4.7 實驗數據之處理... 41 第五章 結果與討論... 42 5.1 藻類毒性試驗數據... 42 5.2EC10和NOEC值的比較... 55

5.3 急慢毒性比(Acute-Chronic Toxicity Ratio ; ACR)... 60

5.4 試驗物種數據收集與比較... 62

5.5QSAR分析... 70

5.5.1 利用QSAR預估急毒性... 70

第六章、結論與建議... 79

6.1 結論... 79

6.2 建議... 80

參考文獻... 81

表目錄

Table. 2.6.1 化合物之物理化學特性 ... 16

Table. 4.3.1 藻類營養基質之巨量營養組成份 ... 34

Table. 4.3.2 藻類營養基質之微量營養組成份 ... 34

Table. 4.5.1 電子計數器設定之條件 ... 37

Table. 5.1.1 The raw data of algal toxicity test about 4-hexyn-3-ol... 44

Table. 5.1.2 Median effective concentration values(EC50)based on three end-point... 45

Table. 5.2.1 The relationship of NOEC and EC10... 58

Table. 5.2.2 The important statistical parameters in three test end-points ... 59

Table. 5.3.1 The ACR values in three test end-points ... 61

Table. 5.4.1 Comparison of algal toxicity test results with other species... 64

Table. 5.5.1 log(1/EC50) value in three endpoints and log P、molecular weight、Elumo... 71

Table. 5.5.2 Used baseline toxicity predicted toxicity and residual between observed... 77

圖目錄

Fig. 1.3.1 研究架構流程圖 ... 5

Fig. 2.5.1 QSAR分類... 14

Fig. 2.6.1 炔丙基醇之基本結構 ... 15

Fig. 2.6.2 炔丙基醇前親電性之毒性作用機制 ... 19

Fig. 2.6.3 homopropargylic alcohol前親電性之作用機制... 20

Fig. 4.2.1 月芽藻圖鑑 ... 32

Fig. 4.6.1 連續式藻類培養裝置圖 ... 40

Fig. 5.1.1 The Dose-response Curve of 1-hexyn-3-ol ... 46

Fig. 5.1.2 The Dose-response Curve of 1-pentyn-3-ol ... 46

Fig. 5.1.3 The Dose-response Curve of 3-butyn-2-ol ... 47

Fig. 5.1.4 The Dose-response Curve of 3-hexyne-2,5-diol... 47

Fig. 5.1.5 The Dose-response Curve of 4-heptyn-2-ol ... 48

Fig. 5.1.6 The Dose-response Curve of 4-heptyn-3-ol ... 48

Fig. 5.1.7 The Dose-response Curve of 4-hexyn-3-ol ... 49

Fig. 5.1.8 The Dose-response Curve of 3-hexyn-2-ol ... 49

Fig. 5.1.9 The Dose-response Curve of 2-methyl-5-octyn-4-ol ... 50

Fig. 5.1.10 The Dose-response Curve of 5-methyl-1-hexyn-3-ol... 50

Fig. 5.1.11 The Dose-response Curve of 2-methyl-3-butyn-2-ol ... 51

Fig. 5.1.12 The Dose-response Curve of 3-methyl-1-pentyn-3-ol ... 51

Fig. 5.1.13 The Dose-response Curve of 1-ethynyl-1-cyclohexanol... 52

Fig. 5.1.14 The Dose-response Curve of 2,5-dimethy-3-hexyne-2,5-diol... 52

Fig. 5.1.15 The Dose-response Curve of 3,5-dimethyl-1-hexyn-3-ol ... 53

Fig. 5.1.16 The Dose-response Curve of 2-phenyl-3-butyn-2-ol ... 53

Fig. 5.1.17 The Dose-response Curve of 1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol ... 54

Fig. 5.4.3 Relationship between BOD-test and Fathead minnow data ... 68 Fig. 5.4.4 Relationship between BOD-test and Cilliate data...68 Fig. 5.5.1 QSAR analysis of the eight tertiary propargylic alcohols ... 75 Fig. 5.5.2 Correlation between Baseline and propargyl alcohols based on DO、

第一章 前言

1.1 研究緣起

由於工商業的發達，使得人們滿足了物質的享受，但每年大量的使用 化學物質及新化合物的合成製造，迫使我們急需要了解化學物質對於排放 水體的危害，是否會造成水體生物的威脅。然而傳統的水質標準像是生物 需氧量（BOD）、化學需氧量（COD）等等，不見得能夠達到保護水體生 物的要求，所以許多先進的國家除了訂定傳統水質標準外，同時對放流水 毒性訂定放流水生物毒性規範，來彌補傳統水質參數不足。 藻類位於食物鏈的最底層，是重要的生產者，若是藻類受到影響则會 導致其他的生物產生一些生理變化，且藻類的毒性試驗具備了簡單、敏感 性高、再現性高等等的優點，故基於上述的理由，本實驗使用浮游植物— 月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata）為試驗物種，研究其對於毒性物 質之涵容能力。 傳統上藻類毒性試驗的標準方法中，大多是批次式開放培養的系統 作為實驗方法，在此方法中由於為開放式，若測試物質為具揮發性的， 則會因為揮發性的影響而導致低估其毒性的結果。基於上述的缺點，本研 究使用 BOD 瓶來造成一完整的密閉環境系統，評估具有揮發性的物質並 以藻類溶氧變化量（△DO）、細胞密度做為試驗終點，了解其毒性物質對 於藻類的影響。 由於化學物質不斷的推陳出新，我們不可能一一的研究各種化學物

質，故QSAR（Quantitative Structure Activity Relationship）則為毒物學家

常常使用的一個很好的模式。QSAR 為化學物質的物化特性或分子結構的

參數和化學物質的生物毒性進行統計迴歸分析。藉由QSAR 我們可以預測

醫藥中，目前在許多國家中已經把此類的物質歸類為列管物質，但目前對 於這一類的物質來說，水體生物之毒性數據是相當缺乏的，以及其對於 QSAR 的研究也是相當稀少的，因此有更進一步對於此類化學物質做探討 的必要，更突顯了本研究之重要性。

1.2 研究目的

一、利用連續式培養技術，配合 BOD 瓶進行密閉式藻類毒性試驗，並以 溶氧以及細胞密度為試驗終點，探討一系列的二級以及三級炔丙基醇 類之毒性，並以Probit 模式計算出 EC50值。 二、討論此次研究中試驗結果所得到的NOEC 以及 EC10，分析何者能對環 境生物提供較好的保護。 三、將本篇藻類的數據，和其它學者使用不同方法、不同物種所做出來的 數據做比較，並討論其敏感性及替代物種之研究。

四、利用化合物之LogP 以及 Elumo值，對化合物進行QSAR 之分析，並討

1.3 研究方法與架構

實驗首先是由參考文獻中收集相關資料及數據，經確定實驗毒物之 後，將所選定之毒性物質之物化資料及研究文獻進行更進一步之整理， 再建構實驗目的、實驗方法及實驗結果分析以完成毒性實驗。 本研究是以密閉式藻類毒性實驗，採連續培養、批次實驗之方式進 行，再將實驗結果之數據以 Probit 模式分析求得 EC50值及劑量反應曲線 （dose-response curve）。最終再將實驗所得之結果進行更進一步之討論並 提出本研究之結論。 整體實驗過程之架構如圖1.3.1 所示：

Fig. 1.3.1 研究架構流程圖 參考資料與文獻收集 毒性物質資料的彙整 建立方法及分析方式 實驗數據整理與分析 實驗的結果與討論 物化資料之整理 研究文獻之收集 藻類毒性試驗 TOC 的定量 進行密閉式毒性試驗 利用Probit 模式計算出 EC50 決定毒性試驗的物質

第二章

文獻回顧

2.1 毒性試驗物種

毒性試驗物種的選擇方面，一般來說考慮的大部分都是容易取得、容 易觀察、生長期短、可以大量生長、培養簡單、具有地區代表性等。在 現今標準試驗方法中，使用的毒性試驗物種種類很多，常見的包含了細 菌（Madsen and Rasmussen, 1996; Xu and Nirmalakhandan, 1998）、藻類 （Rojickova et al., 1998; Clarkson et al., 1998; Herman et al., 1990）、魚類 （Slabbert and Venter, 1999; Zaho et al., 1998）、水蚤（Baun et al., 1998; Rose et al., 1998）等。 然而，本研究選取藻類做毒性試驗物種原因如下： （1） 藻類在水生生態系統中是主要的生產者，且其處於食物鏈底部，若 其遭受到毒性化學物質的危害，則會對水生系統之營養層級造成很 大的影響（Geis et al., 2000）。 （2） 藻類的培養以及取得是比其他物種還要容易的，且所需要的成本較 低，並可快速進行試驗，可以節省更多的時間與成本。 （3） 相對於魚類及無脊椎動物試驗，藻類試驗有較佳的敏感度及較優的 再現性。 （4） 在毒性試驗過程中，由於藻類繁衍迅速，故試驗時間雖短，卻已歷 經數個生命週期，因此試驗較不會受生物處於幼年期或衰老期之影 響。

2.2 試驗物種簡介

由於在自然水體中的藻類有相當多的種類，標準方法中的試驗藻種 也列出許多種，本實驗所使用的月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata） 屬於綠藻（Chlorophceae），其特色為單細胞成群但不糾結且不能移動， 一般細胞體積為 40-60 µm3。其體型成半月型。此類的藻類較其他微生物

試驗來的敏感（Rojickova and Marsalek, 1999），這也是本研究選取此類藻 類做實驗的主要原因之一。月芽澡一旦生長條件不適或遭受毒性物質危 害時，其顏色會由原先的綠色轉為微黃色，因此很容易於培養中觀察。 且細胞變肥厚且半月型彎曲程度會變小，以顆粒記數器觀察其粒徑的分 佈變化也可發現大粒徑的藻類分佈變多，而小顆粒的藻類分佈相對減 少。

2.3 藻類毒性試驗方式

藻類毒性試驗可以依照培養方式分為批次式和連續式兩種。目前 OECD（Organization for Economic Cooperation and Development, 1984）、 USEPA （ United States Environmental Protection Agency, 1996） 、 ISO （International Organization for Standardization, 1987）、ASTM（American Society for Testing and Materials, 1994）及 APHA（American Public Health Association，1995）等機構公告的都屬於批次式試驗方法。

批次式的培養在整個實驗中的一開始即加入飽和的基質，而在整個 過程中不會加入新鮮基質，且藻類之代謝物也沒有流出，實驗期間藻類 經歷了完整的成長週期，遲滯期（lag phase）、指數生長期（exponential phase）、穩定期（stationary phase）及死亡期（death phase）。而其標準試

驗 方 法 可 採 用 U.S. EPA 所 制 定 之 “Fresh Algal Acute Toxicity Test”

（1996）。批次式藻類毒性試驗具有技術簡便、成本低、樣品處理量大、 實驗數據取得容易等優點，因此經常被採用。不過以批次式培養方式進 行實驗，仍然存在許多缺點。例如在批次式系統中，為了確保藻類生 長，大多使用高於自然水體甚多的營養鹽濃度，根據 Chen et.al., (1989) 的理論，如此將會影響藻類對毒性物質的容忍度，亦會造成 pH 的改變， 也無法反應自然水體真實狀況。其次，批次式培養因為無新鮮基質的加

響。另外，批次式毒性試驗結果是具有再現性不佳之缺點的。 連續式的培養為新鮮基質的不斷流入，而代謝物不斷流出的方法， 使得藻類保持在最佳的狀態，營養鹽也因為維持在低濃度流入的情況 下，而使得更能模擬真實水體的情況。但連續式的培養需要一段相當的 時間使得系統達成平衡，且每進行完實驗即需重新培養，相當的耗費人 力、物力及時間，所以目前尚未有標準的試驗方法建立。

Chen and Lin,（1997）所發展出的連續式藻類毒性試驗是以 Chemostat 為基礎之試驗。此試驗方法是使用四公升的母槽，以連續式的藻類培養 技術來培養藻類，當系統達到穩定狀況時，即可取出藻液進行毒性實 驗，也因為毒性試驗的藻液是另外取出，而不是直接在母槽中進行，母 槽不會被毒物污染，沒有一般連續式試驗方法需要等待系統回復穩定而 耗時的情況發生，使得實驗頻率能夠大幅的增加，並將毒性試驗時間縮 短為 48 小時，大大增加試驗的頻率，也因而改善批次式培養中藻類代謝 物之累積，並更能模擬自然水體之環境。

Chen and Huang,（2000）利用連續式的培養方法結合了 BOD 瓶發展 48 小時的批次式 BOD 瓶藻類毒性試驗，將藻類、營養基質和試驗毒物加 入300mL 的 BOD 瓶，然後蓋子密封做密閉式毒性試驗，讓藻類與毒性物 質接觸 48 小時後，由觀測終點量測實驗組與控制組（不加毒物）的抑制 情形並進行比較分析。在操作更加簡單，時間與成本的耗費也大幅減 少，且可處理較大量的樣品數、實驗數據取得容易，所以相對了提高實 驗的再現性。 因此本研究是結合了上述兩種方法，也就是”連續式藻液的培養配合 批次式毒性試驗”之方式。 目前的標準方法皆屬於開放式系統（Open System），此開放式系統在 進行實驗時以激烈的搖晃震盪以利氣體交換、提供碳源。此類標準方法 應用在揮發性有機物時，容易隨著時間的增長而使得揮發性有機物因為 揮發而降低了濃度，因而低估了毒性。

有鑑於此，有學者採用以密閉式的系統來進行揮發性物質的毒性試 驗。 密閉式系統中又可分為含上方空間（head space）的密閉式系統以及不 含上方空間的完全密閉式系統兩類。比較上述兩種方法以及開放式系 統，學者Mayer et al.,（2000）提到完全密閉式系統中藻類抑制率最多可達 84%，而留有 head space 的密閉系統以及開放式系統中藻類抑制率最高僅 達到19%以及 14%，有機物因為揮發而降低對藻類的敏感度之現象極為明 顯。實驗結果證明不含 headspace 之完全密閉式系統是評估揮發性有機物

毒性最佳的選擇。因此本實驗以BOD 瓶進行完全密閉不留任何 head space

之密閉式藻類毒性試驗，以期有效的降低有機物揮發性所產生之實驗誤 差，求得到更精準之試驗數據。

2.4 影響藻類毒性試驗的重要因子

進行實驗時，不同的操作參數都將影響實驗結果，在進行毒性試驗 之前，我們必須對各種參數加以嚴格的控制，並了解各參數對於藻類毒 性試驗之影響為何。在本實驗進行的同時，有以下參數列入考慮： pH 值的控制 在自然界中，藻類會因為光和作用的原因而使得 pH 在一天中就產生 很大的變化，若是不對pH 加以控制而允許 pH 之變動，可能會降低毒性試 驗的再現性，也因此不容易預測在一特定 pH 值之下試驗毒物對藻類所造 成的毒性。因此標準藻類毒性試驗皆傾向其 pH 值維持在固定。不同的標 準方法對於pH 的變化皆有則不同之規定，如 U.S.EPA 要求最終之 pH 需 在8.5 之下，OECD 則規定 pH 的變化不可超過一個單位; ISO 則要求 pH 的變化不可超過 1.5 的單位。欲減少 pH 值之改變，大致的方法有下列幾

本研究依據早期之藻類毒性研究方法（林國清，1997）於進行毒性試 驗前，將pH 控制於 7.50 左右，使其減少 pH 變化所造成之可能誤差性。 試驗時間 毒性試驗的敏感性及數據結果皆易受試驗時間之長短而有所影響， 當試驗時間過長時，會導致BOD bottle 內之營養鹽不足進而影響控制組之 生長，使得處理組與控制組於最終產量的差距漸漸縮小，另一方面，過 長的試驗時間亦會使得毒性的反應消失。本試驗依據早期之密閉式藻類 毒性試驗方法（林國清，1997），試驗時間為 48 小時。 光照 光照的強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率之不

同（Nyholm and Kallqvist, 1989）。不同標準方法有些許的差異，良好的混 合可以減少自身遮蔽的現象，以避免因為與光源的距離不同而造成光照 強度之差異。為了模擬真實的自然環境，另有一種光照方式為光暗交替 循環的方式，雖然此方式較接近真實環境，但因為此光暗交替會使細胞 同步分裂，而使細胞體積的變化更加複雜，無法以細胞數目代替生物質 量。若是試驗生物能在連續光照的情況下生長良好，則其對毒性試驗的 結果與光暗交替循環的方式並不會有太大的差異產生。 本 研 究 依 照 U.S.EPA （ 1996 ） 標 準 方 法 針 對 Pseudokirchneriella subcapitata 的規定，於連續式培養和批次試驗中所選擇的光照的強度為 64.5 ± 10% μEm-2s-1（4300 lux），且以連讀式的光照來排除光暗交替循環 式的光照所導致的藻類生物質量變異的缺點。 溫度與植種數量 當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長溫度 後即迅速下降。本研究採用 U.S. EPA 建議的 24℃環境下來培養藻類及進 行實驗，整個培養及試驗過程中，溫度之變化不可大於2℃。 在批次式的藻類毒性試驗中，藻液初始細胞密度的不同會對整個實驗

的結果產生影響。若在實驗開始時加入過量的藻液，使得藻類細胞大量的 生長，將使代謝物大量累積且迅速消耗營養鹽及碳源而使得 pH 值增加進 而影響到毒性試驗的結果。Lin（2001）針對不同試驗時間和不同初始植種 密度進行敏感度和變異性的分析，發現生物毒性試驗隨著時間增加，其敏 感度提高而C.V.值減少；而隨著初始植種密度減少，其敏感度提高但 C.V. 值亦提高。考量實驗的變異性以及敏感度，本實驗選定藻類初始細胞密度 為1.5×104 cells/ml。 試驗用培養基 測試時使用之培養基對於藻類毒性試驗之影響極大（Chen et al., 1994），其主要之影響因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽 離子。一般為使試驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微量 元素，於試驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，如 ISO（1987）於培 養基中加入 78µg/L 的 EDTA 螯合劑。但是，因為螯合劑的加入會影響毒 性試驗之結果，尤其是進行重金屬對藻類之毒性影響試驗時（Sorvari and Sillanp, 1996），因此，1996 年 U.S. EPA（1996）建議在培養藻液時可加 入固定量之螯合劑於培養基中，但在進行藻類毒性試驗時，則不加入任 何之螯合劑。Lin（2001）以初始細胞密度為 105 cells/ml，毒性物質為重金 屬鋅，毒性試驗時間為12 小時，分別對營養基質中 EDTA 含量為 0（0﹪ EDTA）及 300 µg/l（100﹪EDTA）進行毒性試驗。結果正如預期中，加入 EDTA 會因為其和重金屬之螯合作用而降低重金屬對藻類之影響，進而降 低了敏感度。因此本研究於試驗時亦不加EDTA。 為了解HCO3-對於毒性試驗之影響，Lin（2001）進行兩組試驗。一組 初始細胞密度為 105 cells/ml，毒性試驗時間為 12 小時，毒性物質為重金

-加倍後對毒性試驗敏感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其毒 性反應造成太大之影響。 藻類生長量測方法 在進行藻類毒性試驗時，我們必須要有一個能夠正確的反應出藻類 生長情況之方法。一般藻類生長情況之參數有下列幾種：細胞密度、細 胞總體積、乾重、葉綠素、活體內螢光值、營養基濁度、產氧量、ATP 及 DNA 等等之參數。研究人員可以基於其實驗室之器材設備、實驗條件 下 之 可 行 性 以 及 研 究 題 目 等 相 關 因 素 來 決 定 其 所 要 使 用 之 實 驗 參數 （Rehnberg et al., 1982）。 一般藻類毒性試驗之標準方法皆是於試驗終點時，測量藻類的生物 質量。而量測生物質量最直接的方法就是量測生物之乾重，但是直接測 量生物乾重之方法，非常之耗時費力，所以利用電子顆粒計數器、光學 顆粒計數器等之間接量測生物質量的方法漸漸的將直接測量生物質量之 法取而代之，這些方法不僅簡單、快速，所需的藻液量亦少，且與生物 乾重間有良好的相關性。此外溶氧測定也擁有成本低廉、試驗時間短等 優點。 故本研究是以測量藻類之細胞密度以及溶氧之變化當作觀測終點， 以電子顆粒計數器測量細胞密度，溶氧測定儀測量藻液中溶氧量之變化 量，並藉由Probit 模式將實驗結果轉變成藻類生長抑制率及斜率。

2.5 定量結構-反應關係（QSAR）

2.5.1 QSAR 簡介 每年皆有大量的化學物質不斷的產生，我們不可能一一的去對其做 毒性試驗，來評估其環境風險，因為這樣會浪費時間及金錢。

QSAR（quantitative structure-activity relationship）是以有機物的物性、 化性及結構間的性質與毒性建立起之統計關係，毒物學學者可由化學物

之物化性質預測其毒性，在環境影響評估方面，QSAR 是很重要的預測工 具。

QSAR 應用的歷史，我們可追溯 Rabuteau 在 1870 年時將青蛙浸泡在 含乙基、丁基、以及戊基醇的毒性試驗中。然而 Overton（1899，1901） 這位學者證明了對於許多非電解質的有基化合物中，毒性以及水油分配 係數 （oil/water partition coefficient）會有規律性，並且是行麻醉性的作用

機制。此種現象 Mayer（1899）以及 Baum（1899）這兩位學者也相繼的

發現了，然而這些研究使得以 logP 參數使用在 QSAR 的模式上，提供了

一個有力的基礎（Lipnick et al., 1987）。

依據 McFarland（1970）的理論，化合物的毒性是因為毒性進入生物

相的穿透力以及毒物和反應位置的相互作用而產生。

Log(toxicity)-1 = A [log(penetration)] + B [log(interaction)] + C

其中penetration 最常使用的參數為 logP，而 interaction 則為許多不同

的親電性參數，像是pKa 以及分子軌域能量（Ehomo和Elumo）參數等等。

2.5.2 QSAR 的分類

早期QSAR 的發展上是先將化合物進行分類，也就是一個 QSAR 的模

型只能建立一系列相同或相類似化合物的毒性。但後來發現利用化合物

毒性作用機制所建立的 QSAR 模式是較適當的（Mekenyan and Veith,

1993）。 Russom（ 1997 ） 將 有 機 物 分 成 圖 一 的 毒 性 機 制 ， 可 分 為 一 般 的 （General）和特異的（Specific）兩大類型。一般性主要指化合物並非以特 定位置對生物體造成攻擊，而是與生物體之細胞膜進行反應；特異性會 作用在細胞的特定位置上或抑制特定的反應。而一般性又可稱為麻醉 性，特異性又可稱為反應性。

Fig. 2.5.1 QSAR 分類

麻醉性的作用機制又可分為極性（Polar）以及非極性（Non-Polar）兩 種，屬於一種可逆的毒性。非極性麻醉物質的毒性大小可以和辛醇-水分

配系數得到很好的線性關係，因此Schultz（1998）將非極性麻醉物質所造

成的毒性，與log P 所得的回歸關係定義為基線毒性（Baseline toxicity），

認為其毒性低於極性麻醉性的物質，然而三級炔丙基醇類就屬於非極性 麻醉性之物質（Veith et al., 1989; Lipnick et al., 1987; Veith et al., 1983）。 Verhaar（1992）認為極性與非極性麻醉效應的差異在於氫鍵鍵結提供酸性 的強弱不同，極性麻醉性之化合物通常比非極性麻醉性活潑。 而反應性的物質不但具有麻醉效應的毒性外，其官能基和生物體內所 產生之化學變化為主要之毒性來源，此類化合物的官能基具有親電性， 此種親電性會與生物體內的酵素、硫基、氨基等等產生種種的反應，包 括取代、錯合、產生鍵結等等（Joop et al., 1990），使得物質傳遞以及養 分吸收等路徑受到破壞，屬於一種不可逆的毒性，二級炔丙基醇則屬於 這一類（Veith et al., 1989）。

Mode of toxic action

Narcosis (General) Reactive (Specific)

Non-polar Narcosis polar Narcosis Ester Narcosis Oxidative Phosphorylation uncouplers Respiratory inhibitors Electrophiles/ proelectrophiles Acetycholinester inhibitors

2.6 毒性物質－炔丙基醇介紹

炔丙基醇是接有三鍵的醇類，其化學結構如下圖所示： Fig. 2.6.1 炔丙基醇之基本結構 本研究是針對二級以及三級炔丙基醇及其衍生物做探討。 2.6.1 炔丙基醇的來源及物化特性 炔丙基醇的來源很多炔丙基醇是一種微黃色近似無色透明液體，具 有天竺葵氣味，能與水，苯，氯仿，二氯乙烷，乙醇，乙醚互溶，微溶 於四氯化碳，不與脂肪族碳氫化合物互溶。本研究所選取的化合物皆具 有揮發性，且化學結構組成相當簡單，僅有碳、氫、氧三個元素，但高 濃度之炔丙基醇對於眼睛、皮膚、黏膜以及呼吸道會有刺激的作用。然 而，其來源有很多，它可由乙炔及甲醇催化加成而產生，抗結合藥乙胺 丁醇的原料，有機合成的中間體，除草劑等等。其物化特性如表 2.6.1 所 示：

Table. 2.6.1 化合物之物理化學特性

化合物名稱 化學式 CAS NO. 分子量 溶解性 logP 蒸氣壓 亨利常數 結構式

Secondary propargylic alcohols

3-hexyn-2-ol C6H10O 109-50-2 98.15 3.80E+04 1.2 0.138 6.93E-07

1-hexyn-3ol C6H10O 0105-31-7 98.15 3.80E+04 1.2 0.219 1.37E-06

1-pentyn-3-ol C5H8O 4187-86-4 84.12 1.59E+05 0.67 0.712 1.04E-06

3-butyn-2-ol C4H6O 65337-13-5 70.1 4.415 E+005 0.14 1.9 7.8 E-007

4-heptyn-2-ol C7H12O 19781-81-8 112.17 1.724 E+004 1.18 0.04 9.2 E-007

4-heptyn-3-ol C7H12O 32398-69-9 112.17 1.73

4-hexyn-3-ol C6H10O 20739-59-7 98.15 1.2

2-methyl-5-octyn-4-ol C9H16O 60657-70-7 140.23 2.66

3-hexyne-2,5-diol C6H10O2 3031-66-1 114.15 1.28E+05 -0.1 0.0023 2.53E-08

Table. 2.6.1 化合物之物理化學特性（續）

化合物名稱 化學式 _{CAS NO. 分子量 溶解性 logP 蒸氣壓 亨利常數} 結構式

Tertiary propargylic alcohols

2-methyl-3-butyn-2-ol C5H8O 115-19-5 84.12 1.00E+06 0.28 2.13 3.91E-06

3-methyl-1-pentyn-3-ol C6H10O 77-75-8 98.15 9.90E+04 1.07 0.7 6.85E-06

1-ethynyl-1-cyclohexanol C8H12O 78-27-3 124.18 1.04E+04 1.66 1.77E-02 1.07E-06

2,5-dimethyl-3-hexyne-2,5-diol C8H14O2 142-30-3 142.2 1.67E+04 0.69 1.30E-03 4.47E-08

3,5-dimethyl-1-hexyn-3-ol C8H14O 107-54-0 126.2 8112 2 0.113 2.42E-06

2-phenyl-3-butyn-2-ol C10H10O 127-66-2 146.19 9380 1.68 1.73E-03 6.30E-08

1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol C15H12O 3923-52-2 208.26 2.71

3,4-dimethyl-1-pentyn-3-ol C7H12O 1482-15-1 112.17 2.40E+04 1.26 0.436 1.83E-06

2.6.2 炔丙基醇之應用 炔丙基醇的應用有很多。在醫藥行業中，炔丙基醇是合成磷霉素 鈉，磷霉素鈣，磺胺嘧啶的重要中間體，也用於生產丙烯醛，丙烯醇， 維生素 A 等醫藥產品，在農業行業中，炔丙基醇主要是應用在合成克顢 特農業中，有許多國家每年對於炔丙基醇這一類的物質需求量相當的 大，例如中國，每年用在醫藥及農藥行業中炔丙基醇的需求量就在 1200 公噸以上。 炔丙基醇也可應用於電鍍行業中，由於炔丙基醇的衍生物具有良好 的整平性和光亮性，在鍍鎳的過程中，可作為一種優良的鍍鎳快光劑使 用，在電鍍行業中使用相當廣泛。炔丙基醇也是重要的除鏽劑，能抑止 乙酸、磷酸、硫酸、鹽酸等對鐵、銅、鎳等金屬的腐蝕，被廣泛應用在 鋼鐵行業中。炔丙基醇還可應用於石油的開採，還可用作溶劑、穩定 劑、除草劑、殺菌劑等等。

2.6.3 炔丙基醇之毒理特性 二級炔丙基醇被分類為反應性裏的前親電性，而三級炔丙基醇被分 類為麻醉性。前親電性的物質會因為生物反應（bioreactivity）的作用而變 成軟親電性（Bearden and Schultz, 1997）。此類化合物的毒性是因為它會 經過一種藉由醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的酵素使得化合物 的結構代謝轉換為α，β–不飽和之代謝物，此代謝物為 ＂Michael-type acceptors＂（Mekenyan et al., 1993），之後會經由Michael reaction 的作用

機制被一些生物大分子或是親核基攻擊，如：–SH，–NH2，–NH，–OH基

Fig. 2.6.2 炔丙基醇前親電性之毒性作用機制 本研究所選取的二級炔丙基醇中，有一些分子結構是帶有亞甲基的 （homo），homopropargylic alcohol這類的物質雖然不會發生醇脫氫酶的氧 化作用，但它會經過一些烯醇化（enolization）作用以及互變異構化 （tautomerization）作用變為丙二烯之後，再被一些親核基或是大分子攻 擊，然後再經由互變異構化的作用形成一不可逆之加合物（irreversibly bound adduct），使毒性變高。如圖2.6.3所示（Veith et al., 1989）。

Fig. 2.6.3 homopropargylic alcohol 前親電性之作用機制

三級炔丙基醇被分類為麻醉性，此類的化合物在文獻上是較為不毒的 （Veith et al., 1983; Lipnick et al., 1987; Veith et al., 1989）。過去有學者已 經證明了三級的炔丙醇類是可以當做魚類以及水蚤的麻醉劑（Howlandr and Schoettger, 1969; Gannonj and Gannons, 1975）。縱使他們的毒性不高， 但高劑量的三級炔丙基醇還是會導致死亡的。

Veith（1989）使用fathead minnow為試驗物種，針對四個二級以及七 個三級炔丙基醇類做毒性試驗，文獻指出二級的炔丙基醇類其Te（Excess

toxicity：LC50predicted/LC50observed）值是134~383倍，且這類的化合物會造成

魚 類 產 生 脊 椎 側 彎 ， 水 腫 ， 痙 攣 等 等 的 現 象 ， 其 中 最 毒 的 物 質 為 1-octyn-3-ol，其EC50值為0.413mg/L。而對於三級炔丙基醇來說，其Te值的 範圍為0.7~3.8倍，而最毒的化學物質為1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol，其EC50 值為11.1mg/L。 Schultz（2004）使用了纖毛蟲為毒性試驗物種，針對一連串的脂肪醇 做毒性試驗。其中也包括了17種二級炔丙基醇類以及五種三級炔丙基醇

類 。 結 果 發 現 最 毒 的 毒 性 試 驗 化 合 物 為1-hexyn-3-ol ， 其 EC50值 為 21.47mg/L。最不毒的化學物質為2,5-dimethyl-3-hexyne-2,5-diol，其EC50值 為5406.29mg/L。 相同的結果也發生在Dowson（1990）所做的實驗中，它選取了14種炔 丙基醇類對於非洲蛙做其胚胎以及幼體的毒性試驗，結果發現被分類為前 親電性的炔丙基醇類會造成胚胎之致突變性，而麻醉性的炔丙基醇類則不 會。 2.6.4 炔丙基醇之 QSAR 由於三級之炔丙基醇為麻醉性的物質，所以此類的化合物用logP 對於 毒性是能得到很好的回歸效果（Veith et al., 1983）。但若是像二級炔丙醇 這類會經由生物活化的作用而變成軟親電性的物質，則我們必須加一些分 子參數去做回歸（Mekenyan et al., 1997）。Bearden（1997）這位學者使用 了纖毛蟲（Tetrahymena）以及魚類（fathead minnow）去做毒性試驗，並 且發現不管對於哪個物種而言，前親電性的物質若單單由logP 去對毒性做

回歸的話，其回歸的效果都是不好的（Tetrahymena：r2 = 0.57 ，fathead

minnow ： r2 = 0.06 ） 。 但 在 他 加 入 一 個 空 間 性 參 數 Snav（average

superdelocalizability）之後，發現不管對於哪一種物種來說，其回歸效果都

是增加許多的（Tetrahymena：r2 = 0.71，fathead minnow：r2 = 0.84）。Schultz

（2004）選取了一系列的二級炔丙基醇對纖毛蟲做毒性試驗，發現其回歸

效果也很不好（r2 = 0.339），然而，他也建議對於這類的化學物質，是應

第三章

基本理論

3.1 毒性物質劑量-反應模式

當試驗物種受到毒性物質的抑制而造成 50%抑制或死亡，稱為 EC50

（Effect Concentration）或 LC50（Lethal Concentration）。而試驗物種受到

毒性物質的抑制所造成的抑制或死亡之百分率，隨著毒性物質濃度成S 型 劑量反應關係曲線，利用數學轉換模式將S 型曲線轉為直線，以方便求得 EC50或EC10，便稱為劑量反應關係模式。 一般較為常見的毒性物質劑量-反應模式為 Probit， Probit 是假設受生 物對毒性物質容忍度成對數常態分布（log-normal distribution )。因此以常 態分佈函數來表示毒物對生物抑制率P 對毒物濃度（劑量）Z 的濃度（劑 量）反應曲線。在Probit 轉換式中，毒性物質之 S 型濃度反應曲線先轉換

成NED（Normal Equivalent Deviation）scale 之直線，其中 50 ﹪抑制率（P）

對應至NED scale 上時為 0，而 84.1﹪則對應為 1，而 NED scale 的座標值

加上5 即為 Probit 座標之概率單位 Y 值（Y＝NED + 5），當 Y＝5 時表示

一半的測試生物受到毒性物質抑制，此時對應的毒物濃度就是EC50。Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下： Y=A+BlogZ (1) P=0.5[1+erf((Y − 5) 2 )] (2) 其中Y 為 Probit 單位，A、B 為劑量-反應曲線之截距與斜率，Z 為毒性 物質劑量濃度（單位：mg/l），P 為測試物種對毒性物質之反應率（如 死亡率等，單位：%），erf 為 error fuction。

3.2 基本生長動力學

在批次式藻類培養中，單細胞藻類的生長通常依循簡單的一階動力 學： dt dX ＝ µX 其中，X 為生物質量（一般以乾重或是細胞數表示之）；µ為比生長 率；t 為時間。影響生長率之因子有光照、溫度、營養鹽及碳源之供應， 如果光照、營養鹽或碳源受到限制，則藻類之基本生長模式將由指數型 態變成直線型態。 在連續式藻類培養中，當系統達到一平衡（Steady State）時： 一、由反應槽中生物質量之平衡可得下列式子： dt dX ＝ µX－DX ＝（µ－D）X 其中，D 為稀釋率（day-1）即入流量與反應槽體積之比值，當系統達 到平衡穩定狀態時， dt dX ＝ 0 則µ ＝ D 此表示當反應槽達到平衡穩定狀態時，反應槽內生物之比生長率等於 該系統之稀釋率。 二、由反應槽內之基質平衡可得下式： dt dS ＝ DS0－DS－µ（ Y X ） 其中，S0為入流基質濃度（mg/l）；S 為系統達平衡穩定狀態時，限制

當系統達平衡時， dt dS ＝ 0 則D（S0－S）＝ µ（ Y X ） 又µ ＝ D 所以X ＝ Y（S0－S） 再由Mood’s equation，µ ＝

₍

₎

S Ks S µ + max 及µ ＝ D 所以S ＝

₍

₎

D µ KsD − max 其中，µ為比生長率；µmax為最大比生長率；Ks 為飽和常數（比生長 率為最大比生長率一半時之基質濃度）。 最後可得 X ＝ Y

₍

₎

_⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎣ ⎡ − − D µ KsD S max 0 由此是可知當反應槽達平衡穩定狀態時，其生物量可由稀釋率及進流 基質濃度來控制。

3.3 NOEC

另一個判斷毒性反應的指標為「未造成生物產生明顯毒性反應的最高 濃度」（no observed effect concentration, NOEC）即代表毒性物質對受測物

的無影響之濃度。為了計算NOEC 值，One-sample t test 以及 Dunnett’s test

是常用以跟控制組比較的統計方法。本實驗所進行的One-sample t test 主

要根據所有實驗控制組的溶氧變化量和細胞密度增加量的平均值加減三

倍標準偏差值定義出上下控制範圍決定NOEC 值，而 Dunnett’s test 則觀察

3.3

平均中斷值（Cut-Off value）

為了了解毒物在低濃度下分析方式結果（模式迴歸分析及統計分析）

的差異及找出較適的水體保護指標，本研究中分別比較兩種指標NOEC 及

EC10值，並利用平均中斷值（cut-off value）作為選擇 NOEC 或 EC10的客

觀參考點。中斷值與一組試驗的組內變異之平方根成正比，因此組內變異

較小的精確試驗有較小的平均中斷值，由於中斷值的濃度大於NOEC 而小

於LOEC，故中斷值亦指出 NOEC 所能達到之保護程度的極限，其計算公

式如下：

cut-off value (% reduction)= − ×100= × 1 + 1 ×100

ni nc Sw Xc T Xc Xi Xc

T：查表所得（以 one-tail Dunnett’s test 在顯著程度為 5％之表格）

Xc 為控制組之平均值，Xi為處理組之平均

Sw：組內變異之平方根

第四章

實驗設計與方法

4.1 實驗設備

1. 恆溫無塵室 恆溫無塵室大小約為五坪，其溫度控制在24 ± l℃，保持恆溫，藻類 培養、試驗皆在此溫控室內進行。 2. 水質 實驗中清洗容器、器具之二次清洗水及藥品配製用水皆為自來水依次 經過過濾、離子交換、蒸餾然後再經超過濾（Milli-Qplus）處理之去 離子水。使用時需確定水質之比電阻≧18.2 Megaohm才可開始使用。 3. 批次式培養器皿 以批次方式培養液態藻類時所使用之容器為125ml，Erlnmeyer 之三角 錐瓶。 4. 培養裝置 培養裝置為自行裝配之培養箱，台面可依所需而更改、拆換，以角鋼 為架構主體，長 ×寬 ×高為 135 ×110 ×135cm，頂面履以 120cm 長之 白色螢光燈管 8 支，並設有迴轉式振盪混合器（FIRSTEK 公司，型 號S103)，搖動速度可大於 100 rpm，其台面共有 112 個位置。培養設 備置於恆溫室內，控制溫度在24 ± l ℃。作為藻類批次式培養與毒性 試驗之用。

5. 瓶塞 使用脫脂棉加上消毒紗布，每次使用前需先經過滅菌斧殺菌。 6. 連續式培養母槽 連續式培養之母槽使用體積5 公升，直徑為 18cm 之玻璃容器。於體 積4 公升處開口做為溢流口，並且於體積 2 公升處開一口做為取樣之 用。母槽上方亦有兩開口，一作為營養基質流入口、另一作為空氣進 流用。 7. 電磁攪拌器 其作用為使藻液與進流之營養基質、空氣混合均勻，並且避免藻類之 沉澱。 8. 蠕動幫浦

蠕動幫浦使用Masterflex 公司，型號 7533-70 pump drive 及 7518-10

pump head 之定量幫浦，作為輸送營養基質到連續式培養母槽之動 力，並可控制其流量。

9. 幫浦管

幫浦管使用 Materflex 公司，型號 H-96400-14。輸送管為矽膠材質，

11. 氣體流量計 其 功 用 在 量 測 曝 氣 氣 體 之 流 量 ， 本 實 驗 母 槽 之 曝 器 量 控 制 在 250ml/min。 12. 空氣洗滌器 洗滌器的功用在去除曝氣氣體中的雜質，並可以藉此濕潤氣體，增加 氣體之溶解。 13. 庫德式電子顆粒計數器二代

功用為計數藻類細胞數。使用 Coulter Electronincs 公司之 Coulter

Counter，型號為 MULTISIZER II，並以 5.06µm 標準顆粒乳液來校

正。配有50 及 100µm 孔徑之玻璃管。本實驗使用 100µm 孔徑之玻璃 管，量測之顆粒直徑範圍為2µm~60µm 14. 電腦及分析軟體 使用中央處理器為P-166 之桌上性電腦，視窗 98（Windows98 Se）之 程式並配合電子顆粒計數器所需之軟體（Multisizer Accucomp V. 2.01） 來進行顆粒計數之分析。使用時可直接將電子顆粒計數器之數值輸送 至電腦中進行分析。 15. BOD 瓶 呼吸毒性試驗時使用之玻璃器皿。使用體積300ml，直徑 8cm 之 BOD 玻璃瓶。上頭開口處有玻璃瓶塞，使其可以利用水封之形式，避免外 界氣體、物質等進入，而減少干擾。整個系統為一個封閉式系統。

16. 光度測定計

使用TOPCON 產牌，型號 IM-2D，單位為 lux。

17. pH 測定儀

使用Suntex 公司，型號 SP-7 之 pH 測定儀。其精確度為 ± 0.01。

18. 溶氧測定儀

美國 YSI 公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI 5100，附有

Model 5010 溶氧測定探頭（BOD Probe），其探頭部分裝有電動攪拌

器，可以對樣品進行攪拌。溶氧量測定範圍為0.0~60.0mg/L，精準度 為 ± 0.1%。 19. 曝氣用氣體鋼瓶 使用含 0.5%CO2 之高壓氮氣鋼瓶，氮氣之純度達 99.9%，總氣體體 積為6m3。用於降低營養基質中之溶氧值，並確保能提供足夠之碳源。 鋼瓶上備有一流量計，曝氣時之曝器流量控制在600ml/min。 20. 純水曝氣設備 曝氣設備使用體積 10 公升之德國製下口瓶，。開口處嵌入一矽膠塞 和玻璃管，玻璃管一頭接氣體鋼瓶，一頭接沸石並伸入純水筒底部 曝氣，在純水筒開口處附近開一小洞以平衡壓力，曝氣完成後關緊

21. 無菌操作台

使用造鑫公司製造的Laminar Flow 操作台，內設有紫外光殺菌，以防

止植種過程及配製營養鹽時受到污染。

22. 抽器幫浦

使用SINKU KIKO 公司，型號 ULVACG-5 及 G-50 之幫浦。用於過濾

營養基質及 ISOTON II 之用。 23. 冰箱 使用Whirpool 之冰箱，其功用為維持藻種、藥品及營養鹽於 4℃之下， 以保存之。 24. 滅菌斧 使用HIRAYAMA 公司，型號 HA-300M 之滅菌釜，最大壓力可達 1.9 kg/cm2，容積為0.0521m3。使用時條件設定為高溫（121 ℃）高壓（l.l kg/cm2）來進行滅菌，每次對實驗器皿進行滅菌的時間設定為 15 分 鐘。 25. 烘箱 使用Memmet 公司之烘箱，做為烘乾玻璃器皿用。使用時溫度設為 52 ± 1℃，每次操作時間為 2 小時。 26. 分析天秤 量測藥品用，產牌Precisa 205A，精確度至 0.01mg。

27. 定量吸管 使用 SOCOREX 公司，可調式移液器，容量為 100～1000µl 及 0.1～5 ml 兩種。 28. 濾膜 使用之濾膜分成兩種，過濾營養基質時使用 Gelman Science 九型號 66191 之 0.45µm 濾膜，過濾 Isoton II 時使用 60301 之 0.2µm 濾膜。 29. UV 紫外光燈

使用8 watt 長型紫外線燈 with J138 Stand，可切換 365/302/254 三段波

長，以便針對不同之PAHs 光解所需之特定 UV-A 或 UV-B 波長進行

照射，型號 UVLMS-38，115V/60Hz。

30. 紫外線強度測定儀

使 用UVP 公 司 生 產 的 UVX Radiometer ， 測 定 強 度 範 圍 0~20

Mw/cmP2P，有三種切換sensor，分別UVX-25、UVX-31 及UVX-36。

31. 總有機碳（TOC）分析儀

4.2 試驗藻種

本 研 究 中 ， 採 用 植 物 性 浮 游 生 物 ， 月 芽 藻 （ Pseudokirchneriella

subcapitata）。Pseudokirchneriella subcapitata 屬於綠藻綱（Chlorophceae）

其 特 徵 為 單 細 胞 、 成 群 體 但 不 糾 結 、 不 能 移 動 ， 一 般 細 胞 體 積 為

40-60µm3，其體型呈半月型。此藻種之使用極為廣泛，例如 U.S. EPA、

ISO、OECD 及 APHA 等單位之藻類毒性試驗法，皆使用此藻種為標準

試驗物種之一。實驗藻種購自於University of Texas, Austin。

Fig. 4.2.1 月芽藻圖鑑

4.3 培養基質的配製

本研究所使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組成，配 製方法如下： 將下列 (1) ~ (7) 的貯備液（Stock Solution）各加 1 ml 至含 900 ml 去 離子水中，再稀釋 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營 養基質之pH 值調至 7.50 ± 0.10。

(1)硝酸鈉貯備液：溶解 12.750 g NaNO3於500 ml 去離子水。 (2)氯化鎂貯備液：溶解 6.082 g MgC12．6H2O 於 500 ml 去離子水。 (3)氯化鈣貯備液：溶解 2.205 g CaCl2．2H2O 於 500 ml 去離子水。 (4)微營養鹽貯備液：溶解下列所有藥品於 500 ml 去離子水。 92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12．6H2O 207.690 mg MnCl2．4H2O 3.630 mg Na2MoO4．2H2O 1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2．2H2O 79.880 mg FeC13．6H2O 150 mg Na2EDTA．2H2O (5)硫酸鎂貯備液：溶解 7.35 g MgSO4．7H2O 於 500 ml 去離子水中。 (6)磷酸氫二鉀貯備液：溶解 0.522 g K2HPO4 於 500 ml 去離子水中。 (7)碳酸氫鈉貯備液：溶解 7.5 g NaHCO3於500 ml 去離子水中。 其中微營養鹽貯備液中，EDTA 分別有 100%、10%及 0%三種。100%是使 用於活化藻類時，而在連續式母槽中培養藻類時使用 10%，進行實驗時 則使用不含EDTA 之貯備液。最後配成之營養基質，所含巨量及微量營養 素濃度列於表 4.3.1 及表 4.3.2。營養基質的滅菌是以 0.45 μm 的濾膜過 濾，過濾滅菌後的營養基質須保存在 4℃且置於陰暗無光線照射處，以免

Table. 4.3.1 藻類營養基質之巨量營養組成份 濃度 各元素實際濃度 化合物 (mg/l) 元素 (mg/l) N 4.2 C 2.14 NaNO3 NaHCO3 25.5 15.0 Na 11.0 P 0.186 K2HPO4 1.04 K 0.649 MgSO4-7H2O 14.7 S 1.91 MgCl2 5.7 Mg 2.9 CaCl2-2H2O 4.41 Ca 1.20 Table. 4.3.2 藻類營養基質之微量營養組成份 濃度 各元素實際濃度 化合物 (µg/L) 元素 (µg/L) H3BO3 186 B 32.5 MnCl2 264 Mn 115 ZnCl2 3.27 Zn 1.57 CoCl2 0.780 Co 0.354 CuCl2 0.009 Cu 0.04 Na2MoO4-2H2O 7.26 Mo 2.88 FeCl3 96.0 Fe 30.0 Na2EDTA-2H2O 300

4.4 試驗毒物

本研究是選取 18 種二級以及三級炔丙基醇類做密閉式藻類毒性試 驗，由於 1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol 此類化合物的溶解性較低，故在配置 貯備液時是需要添加溶劑的（DMSO）。而此類的物質是具有揮發性的， 所以貯備液的配置過程中是使用 BOD 瓶來配置，使得毒性化學物質在整 個試驗中都能達到密閉式的效果，降低揮發性對於實驗準確度的影響。 其物化特性可參見表2.6.1。

4.5 實驗前準備

1. 玻璃器皿 玻璃器皿使用前需先用不含磷之清潔劑浸泡、清洗，然後以自來水沖 洗5 至 6 次，接下來則用 10﹪之鹽酸（HCl）浸泡最少一個小時，之後再 以自來水沖洗 5 至 6 次後，再以去離子水沖洗 3 至 4 次，至入烘箱中以 52℃之溫度烘乾。使用前需在其開口處封上鋁箔，置入滅菌斧中，以 1.1Kg/cm2、121℃的條件滅菌 15 分鐘（定量瓶於泡酸液清洗完後，置於 架上陰乾即可）。 2. 藻類之培養及保存 開始時先進行固態培養基的培養，固態培養基組成和液態培養基相 同但加1 % 之洋菜膠（Agar），通常可保存約 6 個月（在 4 ℃下）。藻類 每四個星期移植至新的培養皿以保持菌種的健康。另外也做液態培養基 的培養，通常可保存4 個星期（4 ℃下），四個星期後繼續做移植以保存

3. ISOTON II 之配製及電子顆粒計數器之操作 ISOTON II 之作用主要是作為電子顆粒計數器之導電溶液，也就是 說，電子顆粒計數器中所用之溶液皆為ISOTON II。ISOTON II 的配製比 例為1 公升的超純水中加入 10g 氯化鈉（NaCl），攪拌使其混合均勻，然 後以電導計測量其導電度，所需要之導電度為17mmho。若是導電度低於 17mmho，則再慢慢加入氯化鈉，攪拌均勻，直到導電度為 17mmho；相 反的，如果導電度超過了17mmho，則慢慢加入超純水，攪拌均勻，直到 導電度降至17mmho。待導電度達 17mmho 後再以 0.2µm 之濾膜過濾此溶 液，其濾液即是我們所要之 ISOTON II 溶液 ，以顆粒計數器量測到之食 鹽顆粒數空白值須小於200。

電子顆粒計數法及操作原理

:

電子顆粒計數器在使用前須先暖機約半小時以使機器內之管路可抽 至真空狀態，使用前後皆須流洗管路，並補充上方之300ml ISOTON 抽取 溶液。在電子顆粒計數器內有一根玻璃管，操作中需浸入含有Isoton 稀釋 樣品的燒杯中。而在玻璃管近底端的側面具有半透膜的精密小圓孔，用以 吸取水樣。在玻璃管內外各有一電極片通以直流電，當水樣中所含之顆粒 經過圓孔時，會暫時性地干擾到電流，其干擾正比於每個顆粒的大小。所 產生的電阻則由示波器的波峰顯示，其高度正比於顆粒的多少，個別的脈 衝數由電子數位器直接記錄顯示。而水樣在量測的過程須加以攪拌以使顆 粒 均 勻 分 佈 。 電 子 顆 粒 計 數 法 適 用 於 單 顆 粒 藻 類 之 計 數 ， 如 Pseudokirchneriella subcapitata。電子顆粒計數器主要條件設定如下表 4.4。本實驗採用 50μm 孔徑之毛細玻璃管，其設定之量測粒徑上下限為 2.622μm 至 30μm。量測時，所取之藻液量依生長情形而定，若藻液色澤 較深時則取1 ml，若藻液色澤較淺則取 5 ml，放入 50 ml 之量瓶內，再加

入Isoton 至 50 ml 。將之倒入燒杯，放進顆粒計數器內量測。以顯示之讀

數值扣除空白顆粒數之數值（純 Isoton 之背景值），連續三次其值相差在

2 % 者之平均值為量測值。

Table. 4.5.1 電子計數器設定之條件

項 目 數 值

滿刻度電流量 (Full scale) 10mA

極性 (Polarity) +

電流 (Currents , I) 100

粒度下限 (Diameter Lower Threshold , Tl) 2.622µm

粒度上限 (Diameter Lower Threshold , Tu) 30µm

脈衝衰減倍率 (Attenuation , A) 1

脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1

警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF

分析量 500µL 4. 盤面光度之調整 使用單面為白色亮面具反射光線效果之木板和錫箔紙，組裝於震盪 器四周，調整木板大小及形狀，使整個震盪器盤面之光度落在64.5 ± 10﹪ μEm-2s-1 之範圍內，以減少實驗之誤差。 5. 溶氧測定儀之校正

濃度之抑制率。使用溶氧測定儀之前須先將其偵測頭以去離子水沖洗充 分濕潤後，放置一段時間觀測其在空氣中之飽和溶氧量是否為8.5 mg/L 上 下，若其值相去甚遠則需進行校正，校正方法為將電極置於 2.5 公分左右 水量之BOD 瓶（可視同 100％溼度），轉鈕至校正鍵，輸入校正值（100 ％ ） ， 確 認 後 轉 回 一 般 測 定 鍵 ， 連 續反 覆 校 正 三 次 。 每 月 定 期 更換 CLARK-TYPE 薄膜與 3M 氯化鉀電解質；若有必要時，需以亞硫酸鈉 30 ％將 PROBE 表面清洗乾淨，不要殘留任何化學物質，而得 0％之 DO 溶 液，進行零點校正。

4.6 實驗步驟

4.6.1 連續式母槽之培養 本實驗選擇以連續式母槽培養方法配合批次式藻類毒性試驗，以下 將介紹連續式母槽培養之方法與步驟。 1 連續式藻類培養之步驟如下： (1) 接種環以酒精燈滅菌後，刮取固態培養基上之藻種些許，將其放入 250ml 錐形瓶中加入基質（含 100﹪EDTA）至 100ml，錐形瓶瓶口封 上滅菌紗布後放到震盪器上震盪以活化藻類。 (2) 當 250ml 錐形瓶中之瓶藻類生長至一定大小(顏色明顯變綠)時，將之 倒入1000 ml 錐形瓶中加入 900ml 基質培養。

(3) 當 1000 ml 錐形瓶中之藻類生長至一定數目時即可將之到入 5 公升之 連續式培養母槽中，並加入3 公升之基質。通常 2~3 天後藻細胞數目 達到一定數目後即可開始入流新鮮基質。 (4) 每日皆需配製約 1~2 公升新鮮之基質（含 10﹪EDTA）以提供藻類充 足 之 養 份 ， 確 實 測 量 溢 流 率 以 調 整 pump 進流速度至液流率為 1000ml/day 為準，並每日量測連續式培養母槽中藻細胞之細胞密度 （Cell Density）、平均細胞體積（Mean Cell Volume）以了解藻類之 生長情況。

(5) 當母槽之 Cell Density 達到 1.7~2.2 ×106 cells/ml，MCV 值達到 39~46

時即可自母槽取出藻液開始進行毒性試驗。 2. 藻類培養環境設計如下： 5 公升之連續式培養母槽及裝營養基質之廣口瓶、無菌膠管等經過清 洗、殺菌之後，置於24 ± 1℃之溫度控制室中，並將連續式培養母槽放置 在磁石攪拌器上連續攪拌，攪拌具有混合和避免藻類沈澱之功能，能使 藻液和加入之營養鹽以及曝氣之氣體均勻的混合。連續式培養母槽所需 之燈光由一方照射，使用白冷光燈，其光照強度為 4300 ± 10％ lux。本 實驗中，連續式培養母槽之曝氣設備所提供之曝氣量為250 ml/min，且空 氣進入母槽之前先經洗滌瓶和空氣濾膜，以去除空氣中之雜質，並藉此 濕潤空氣。

Fig. 4.6.1 連續式藻類培養裝置圖

4.6.2 藻類毒性試驗

當母槽之Cell Density 達到 1.7~2.2 ×106 cells/ml，MCV 值達到 39~46

時，就可以做密閉式藻類毒性試驗。首先必須配置稀釋水，接下來以二 氧化碳（CO2）及氮氣（N2）之混合氣進行曝氣約十五分鐘，曝氣步驟可 以降低營養基質中之溶氧值使初始溶氧降低至1.0 mg/l 上下並增加其 CO2 濃度。並且由母槽所測得之藻細胞數換算得到欲使每個 BOD 瓶初始細胞 密度為 1.5 ×104 cells/ml 所需加之藻液量，隨後自培養母槽中取出適量之 藻液，分別加入各個 BOD 瓶內。隨後加入曝氣好之純水，然後逐瓶加入 所需之營養基質和不同體積的毒性物質以達到所需的濃度。之後一一測 量每個BOD 瓶之初始溶氧值並紀錄之，BOD 瓶測完溶氧後以瓶蓋進密封 以達到水封之目的，然後將BOD 瓶置於震盪器上震盪 48 小時。實驗條件

控制在溫度24 ± 1℃，光照來自於上方平行照射，強度為 4300 ± 10％ lux

之白冷光燈，震盪頻率為 100rpm。於 48 個小時後 BOD 瓶自震盪器上取

下，隨後量測各個BOD 瓶中之最終溶氧值（Final DO，DOf）。由最終溶

氧值減掉初始溶氧值可得到一溶氧差，為淨溶氧值（△DO）。測完溶氧後 接著利用顆粒計數器測量每個 BOD 瓶的藻類細胞密度。透過劑量反應關 係模式之分析可以得到以淨溶氧差值（△DO）以及藻細胞密度為試驗終點 之EC50值，並可以得到毒性物質與藻類之劑量反應關係圖。 每一化合物至少做兩次以上的試驗，第一次會先做 range finding，找 出其可能的濃度抑制範圍，接著才做確定試驗。而每一組試驗中做七個 濃度，包含控制組就有八瓶，每一濃度做三重複，而控制組是不加任何 毒性物質的。

4.7 實驗數據之處理

實驗前會把貯備液先經由 TOC 做濃度之定量，並且將實驗所測出之 各參數值（如淨生長細胞數及淨產氧量）與對應之有機物濃度帶入模式 （Probit）中計算，得到其劑量-反應曲線及 EC50值；並且由圖中求得生長 曲線之斜率，作為日後討論。

第五章

結果與討論

5.1 藻類毒性試驗數據

本研究是選用總共18 個二級以及三級炔丙基醇進行 BOD 瓶密閉系統 藻類毒性試驗，分別在實驗前後測溶氧量及細胞密度，作為反應終點； 並且利用Probit 模式所求得之數據，來計算其 EC50值以及劑量反應曲線。 表 5.1.1 為以 4-heptyn-3-ol 為測試毒物之毒性試驗原始數據，所呈現

的為試驗三重複下的平均值，Initial DO、Final DO 及 Final cells 之測定是 藉由溶氧測定儀及顆粒計數器所分析而得，再進一步進行轉換以得知三

種end-point 之抑制率（Inhibition rate; IR）。μspecific、μrelative及抑制率為利

用公式所計算出來之值。由表中可知當濃度越大時其抑制率也會相對的 提高，且當濃度最小時（1.48mg/L），三種反應終點之抑制率為其負值。 其主要因素為藻類對其毒性呈現毒物興奮效應（Hormesis），即毒物激活 了體內細胞的修復和維護系統，使得當毒物若為低劑量時，則會幫助藻 細胞的生長。 將抑制率與濃度帶入Probit 模式中，求得劑量與反應曲線之截距（A） 與斜率（B），則可畫出劑量與反應曲線如圖 5.1.1~圖 5.1.18。可藉由這些 圖當中來檢視試驗是否精確且嚴謹。 表5.1.2 為不同反應終點利用 Probit 模式所求得各化合物之 EC50值、 95%信賴區間、劑量反應曲線之截距（A）與斜率（B）。可由表中發現對 於炔丙基醇此類的化合物，利用藻類為毒性試驗物種，其細胞密度（Final yield）為最敏感的反應終點，而最不敏感的為生長率（Growth rate）。 由實驗結果可發現，單看二級炔丙基醇的話，其EC50值的範圍分別為

（1-pentyn-3-ol）至 64.08mg/L（4-heptyn-2-ol）（Final yield）、0.954mg/L （1-pentyn-3-ol）至 218.7mg/L（4-heptyn-2-ol）（Growth rate）。且其炔 基接在碳一的位置時（1-hexyn-3-ol、1-pentyn-3-ol、5-methyl-1-hexyn-3-ol） 其 毒 性 是 會 比 炔 基 接 在 碳 三 的 位 置 是 還 要 強 的 （3-butyn-2-ol 、 3-hexyne-2,5-diol、3-hexyn-2-ol），炔基接在碳三的位置其毒性也是比接在 碳四的位置還要強的，並且不管在哪個反應終點都得到相似的結果，但炔 基接在碳五的位置（2-methyl-5-octyn-4-ol）時，毒性是比 4-heptyn-2-ol 以 及4-heptyn-3-ol 兩個還要強的，但是是比 4-hexyn-3-ol 還要弱的。也就是 說對於密閉式藻類毒性試驗評估二級炔丙基醇的實驗當中，我們可以發現 其毒性會隨著炔基接的位置的變化而有一定的規律。其中二級炔丙基醇中

最毒的化合物為1-pentyn-3-ol（EC50：0.515mg/L based on final yield），在

文獻上可發現此化合物對於纖毛蟲之 EC50 為 1273mg/L（Shultz et al.,

2004），其間相差了 2472.25 倍，推斷為此化合物對於藻類具有較高的選 擇性，使得其毒性會比纖毛蟲強很多倍，而至於更精確的原因，則需要做 更進一步的研究。

對 於 三 級 炔 丙 基 醇 類 來 說 其 EC50 值 的 範 圍 分 別 為 10.07mg/L

（1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol）至 3078mg/L （2-methyl-3-butyn-2-ol）（DO）、

7.214mg/L（1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol）至 1465mg/L（2-methyl-3-butyn-2-ol）

（Final yield ） 、 27.26mg/L （ 1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol ） 至 4568mg/L

（2-methyl-3-butyn-2-ol）（Growth rate）。且其毒性的高低和化合物的親 疏水性有相當大的關係，由結果可發現，對於三級炔丙基醇類的化合物來 說，當化合物越疏水時，其毒性就越強，且不論是以哪個終點來比較，都 發現相同的結果。觀察此類的化合物之毒性與分子量的結果發現，除了

Table. 5.1.1 The raw data of algal toxicity test about 4-hexyn-3-ol

Conc Initial DO Final DO Final cells Delta DO IR IR IR mg/L mg/L mg/L cells/ml mg/L μspecific μrelative ( growth rate) (Biomass) (DO) Control 1.510 7.033 2.526E+05 5.523 1.412 1 0 0 0 94.61 2.120 2.663 2.960E+04 0.543 0.324 0.229 0.759 0.939 0.902 47.30 1.637 2.670 3.843E+04 1.033 0.465 0.329 0.667 0.901 0.813 23.65 1.480 3.850 4.960E+04 2.370 0.590 0.418 0.576 0.854 0.571 11.83 1.410 5.497 9.883E+04 4.087 0.934 0.662 0.332 0.647 0.260 5.910 1.413 6.013 1.540E+05 4.600 1.164 0.825 0.175 0.415 0.167 2.960 1.290 6.167 2.169E+05 4.877 1.335 0.946 0.054 0.150 0.117 1.480 1.567 8.147 2.651E+05 6.580 1.436 1.017 -0.017 -0.053 -0.191

Table. 5.1.2 Median effective concentration values(EC50)based on three end-point

based on △DO based on Final yield based on Growth rate

Toxicants _{EC50 95%C.I. α β EC50 95%C.I. α β EC50 95%C.I. α β}

Secondary propargylic alcohols

1-hexyn-3-ol 2.711 1.682-4.544 4.562 1.012 1.710 1.391-2.073 4.620 1.632 5.870 4.210-8.137 4.057 1.227 1-pentyn-3-ol 0.743 0.544-0.941 5.228 1.569 0.515 0.298-0.722 5.658 1.950 0.954 0.611-1.368 5.025 1.699 3-butyn-2-ol 8.267 6.862-10.01 4.098 0.983 3.591 2.307-5.262 4.520 0.864 40.44 31.14-54.58 3.900 0.685 3-hexyne-2,5-diol 6.086 4.734-8.004 4.349 0.833 1.390 1.082-1.793 4.851 1.044 9.483 7.660-11.97 4.127 0.894 4-heptyn-2-ol 93.83 78.48-113.2 2.523 1.256 64.08 54.25-75.72 2.352 1.465 218.7 172.9-295.5 1.660 1.428 4-heptyn-3-ol 85.74 76.85-95.61 1.823 1.643 40.90 32.95-50.86 1.299 2.296 95.98 67.24-132.6 1.721 1.654 4-hexyn-3-ol 19.28 15.24~24.79 2.599 1.868 8.038 6.389-9.839 3.311 1.866 23.29 18.10-29.77 3.085 1.401 3-hexyn-2-ol 16.26 13.31-20.12 3.283 1.418 5.769 4.406-7.470 3.792 1.587 21.86 16.35-29.76 3.401 1.194 2-methyl-5-octyn-4-ol 37.92 30.22-50.69 2.193 1.778 17.67 14.08-22.86 2.879 1.701 40.01 30.34-56.11 1.773 2.014 5-methyl-1-hexyn-3-ol 5.582 2.506-27.15 4.325 0.904 3.208 2.164-5.015 4.459 1.069 14.00 8.381-25.24 3.750 1.091

Tertiary propargylic alcohols

2-methyl-3-butyn-2-ol 3078 2634-3659 0.721 1.640 1464 1286-1664 0.742 1.814 4568 4014-5303 0.865 1.603 3-methyl-1-pentyn-3-ol 815.8 712.4-938.3 0.480 1.553 355.9 294.3-425.9 0.012 1.955 945.9 747.8-1219 0.507 1.851 1-ethynyl-1-cyclohexanol 126.4 89.28-180.3 2.533 1.174 72.56 56.89-91.16 2.624 1.277 305.4 230.3-437.6 1.858 1.264 2,5-dimethyl-3-hexyne-2,5-diol 1020 752.1-2746.4 1.235 1.252 530.2 403.8-726.5 1.497 1.286 2099 1543-3340 0.887 1.238 3,5-dimethyl-1-hexyne-3-ol 136.8 95.86-213.4 2.101 1.357 50.69 40.70-62.83 2.649 1.379 198.4 151.1-272.3 1.786 1.399 2-Phenyl-3-butyn-2-ol 137.3 108.4-174.4 0.326 2.491 111.6 69.69-219.6 1.038 1.935 233.0 174.2-306.8 0.549 1.880 1,1-diphenyl-2-propyn-1-ol 10.07 9.001-11.29 3.662 1.334 7.214 6.477-8.024 3.723 1.489 27.26 23.79-31.71 3.089 1.331 3,4-dimethyl-1-pentyn-3-ol 132.4 94.03-203.0 2.796 1.039 84.68 75.12-95.67 2.408 1.344 352.3 304.8-416.1 1.855 1.235

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 1-hexyn-3-ol conc. (mg/L) Inhibition Rate DO. data

Final Yield. data Growth Rate. data

Fig. 5.1.1 The Dose-response Curve of 1-hexyn-3-ol

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1-pentyn-3-ol conc. (mg/L) Inhibition Rate DO. data Final Yield. data Growth Rate. data

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.10 10.00 1000.00 100000.00 3-butyn-2-ol conc. (mg/L) Inhibition Ra te DO. data

Final Yield. data Growth Rate. data

Fig. 5.1.3 The Dose-response Curve of 3-butyn-2-ol

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.0 0 10000. 00 3-hexyne-2,5-diol conc. (mg/L) Inhibition Rate DO. data

Final Yield. data Growth Rate. data

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 10000.0 0 4-heptyn-2-ol conc. (mg/L) Inhib ition Rate DO. data Final Yield. data Growth Rate. data

Fig. 5.1.5 The Dose-response Curve of 4-heptyn-2-ol

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.0 0 10000. 00 4-heptyn-3-ol conc. (mg/L) Inhibition Rate DO. data

Final Yield. data Growth Rate. data

-0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 4-hexyn-3-ol conc. (mg/L) Inhibition Rate DO. data Final Yield. data Growth Rate. data

Fig. 5.1.7 The Dose-response Curve of 4-hexyn-3-ol

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 10000.0 0 3-hexyn-2-ol conc. (mg/L) Inhib ition Rate DO. data Final Yield. data Growth Rate. data