將 REP3 單套基因置入 rep3/rep3 同型缺陷突變株後，對於抗真菌藥物之敏感性

由於REP3 基因在啤酒酵母(S. cerevisiae)中過量表現時可增加 CDR1p-lacZ 活性大約 四倍(紀錦昇，交大碩士論文，2004)，故推測 REP3 基因可能為排藥幫浦(drug efflux)CDR1 之活化子(activator)且和白色念珠菌之抗藥性有關。為了釐清 REP3 基因在白色念珠菌中 所扮演的角色，故以同源重組置換方式(homologous recombination)破壞 REP3 基因，之 後於抗真菌藥物試驗(Etest)中發現，和野生菌株 SC5314 相比，rep3/rep3 同型缺陷突變 株對於三種azoles 類藥物 fluconazole、itraconazole 及 voriconazole 具有較高之敏感性(紀 錦昇，交大碩士論文，2004)。

為了證實此藥物敏感性之改變的確是由於 REP3 基因破壞後所造成而不是其他因素 (例如因白色念珠菌轉形所造成之染色體突變)，故將 REP3 單套基因重新置入 rep3/rep3 同 型 缺 陷 突 變 株 內 ， 後 於 抗 真 菌 藥 物 試 驗(Etest)中發現(圖三之一及三之二)，於 fluconazole 及 voriconazole 作用下，野生型 SC5314、rep3/rep3 同型缺陷突變株及

rep3/rep3::REP3 單套基因置入株的 MIC 值大致相同，沒有太大的差異，但觀察抑菌圈 內菌落生長情形後發現：和野生型 SC5314 及 rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株相 比 ，rep3/rep3 同 型 缺 陷 突 變 株 抑 菌 圈 內 菌 數 最 少， 圈 內 看 起 來 較 乾 淨 透 明 ； 而 rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株圈內菌數較 rep3/rep3 同型缺陷突變株多，抑菌圈 內呈現模糊不透明狀，而野生型SC5314 抑菌圈內菌數居冠，幾乎呈現完全不透明現象。

故由此實驗結果可知，REP3 基因的確和白色念珠菌之抗藥性有關，且為對 azoles 類藥 物之專一性影響。

4.3 rep3/rep3 同型缺陷突變株於 agar dilution assay 中對於 miconazole 之敏感性有提高 之現象

本研究先前所進行的 library screening 實驗中，在以 azoles 類藥物 miconazole 誘導 下，篩選出五個能在啤酒酵母中增加β-galactosidase 活性之基因(紀錦昇，交大碩士論文，

2004)。為了瞭解 rep3/rep3 同型缺陷突變株對於 miconazole 之敏感性是否具有差異現 象，又因尚未具有miconazole 這一類的藥物試片可供抗真菌藥物試驗(Etest)利用，故改 採agar dilution assay，並於不同濃度之 miconazole 誘導下觀察 rep3/rep3 同型缺陷突變株 之藥物敏感性。

由圖四結果可知，於 miconazole 1~ 3 µg/ml 之作用濃度下，野生菌株 SC5314 可生 長至第4 點(千倍稀釋點；10¹ cells)，但於第 4 點時已有明顯之抑制現象；rep3/rep3 同型 缺陷突變株(CSC106)於第 2 點時(十倍稀釋點；10³ cells)便有明顯的抑制現象；而 rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株(WJC52)約可生長至第 2、3 點間，但於第 3 點(百 倍稀釋點；10² cells)時已有明顯的抑制情況產生。而正對照組 cdr1/cdr1 同型缺陷突變 株(DSY448)，在 miconazole 1 ~ 2 µg/ml 之作用濃度下雖可長至第 2 點，但和 rep3/rep3 同型缺陷突變株相比，其被miconazole 抑制現象更為明顯。在 miconazole 3 µg/ml 之作 用濃度下，cdr1/cdr1 同型缺陷突變株(DSY448)於第一點(菌落數為 10⁴ cells)已有明顯的 抑制現象產生。

4.4 REP3 基因突變株不會影響在 37 ºC 及加入胎牛血清培養中芽管的生成

為了要了解 REP3 基因突變後，在誘發菌絲生長之環境中(37 ºC 高溫培養及加入胎 牛血清)會不會影響芽管生成，故取 rep3/rep3 同型缺陷突變株(CSC106)及 REP3 單套基 因置入補救株(WJC52)進行芽管試驗。本實驗以野生菌株 SC5314 及雙基因突變破壞株

(cph1/cph1 efg1/efg1) HLC54 作為正負對照。將菌落接種於含 10 %胎牛血清之 Brain Heart Infusion 液態培養液中，於 37 ºC 反應三小時進行芽管試驗。圖五的結果顯示在含有胎 牛 血 清 之 狀 況 中 ， 野 生 菌 株 SC5314 、 CSC106 (rep3::ARG4/rep3::URA3) 、 WJC52 (rep3/rep3::REP3) 皆可發現芽管形成，而雙基因突變株 HLC54 則無芽管之形成。由此 結果可知，在本實驗的條件下REP3 基因並不會影響白色念珠菌之形態改變。

◆ REP4 基因相關研究

4.5 利用 β-galactosidase filter assay 確認活化 CDR1 啟動子的 open reading frame (ORF)

本研究先前在azoles 類藥物 miconazole 的誘導下進行 library screening 實驗，篩選 出五個能在啤酒酵母中增加β-galactosidase 活性之基因 (紀錦昇，交大碩士論文，2004)。

其中一個library clone 為 C19。C19 具有兩個 ORFs - orf19.5019 和 orf 19.5020，為了確 認影響 CDR1p-lacZ 活性的為何者，遂利用限制酵素分別加以破壞，之後將所得的建構 物(constructs)轉形至含有 348CDR1p-lacZ 質體之啤酒酵母內，後利用 β-galactosidase filter assay 確認影響 CDR1 啟動子之 open reading frame。

圖六為 β-galactosidase filter assay 的結果。圖六(A)為質體建構示意圖。編號 1 為正 對照組，含CaNDT80，為已知能活化 CDR1p-lacZ 之正向調控基因；編號 2 ~ 4 為 C19(內 含 orf19.5019 和 orf19.5020)；編號 5 和 9 為負對照組，內含空的載體；編號 6 ~ 8 為 c19.5020，只含 orf19.5020 之載體；編號 10 ~ 12 為 orf19.5019，只含 orf19.5019 之載體。

由圖六(B)得知，含有 orf19.5020 質體之轉形株其菌落顏色為藍色，此結果和經 C19 轉 形後所得菌落類似。而orf19.5019 質體轉形後所得菌落顏色為白色，此結果和負對照組 之顏色類似。正對照組，含有 CaNDT80 之轉形株的藍色深度大於 orf19.5020。故，由 此結果可知，orf19.5020 能夠和 CDR1 起動子作用，活化 lacZ 基因的表現，因而造成菌 落具有呈色反應；而orf19.5019 無法和 CDR1 啟動子作用，故無法活化 lacZ 基因表現，

使得菌落不具有呈色能力。綜合以上結果得知，orf19.5020 才是真正能夠和 CDR1 起動 子作用，活化其後報導基因 lacZ 表現之 ORF，故將此 ORF 命名為 REP4，用以代表 Regulator of Efflux Pump 4。

4.6 建構 REP4 基因異型缺陷突變株與同型缺陷突變株

由之前的研究得知，在啤酒酵母 2B/int5314CDR1p-lacZ 中，REP4 基因能夠提高

β-galactosidase 活性約 5.5 倍。後於啤酒酵母中發現，過量表現 REP4 基因時，對於抗真 菌藥物amphotericin B 和 ketoconazole 之敏感性有提高之現象(紀錦昇，交大碩士論文，

2004)。上述研究都是在啤酒酵母中進行，由於 REP4 為白色念珠菌之基因，為了瞭解其 功能，故採用同源重組置換方式(圖七)，利用帶有 REP4 同源片段(5'端和 3'端各 70 個鹼 基對)的特殊引子進行聚合酶連鎖反應，將此同源片段分別連接至篩選標誌 ARG4 和 URA3 兩側，之後將此建構好之聚合酶連鎖反應產物轉形至白色念珠菌 BWP17 以及 BWP17 /tetR-HIS1 中，得到 REP4 基因的異型缺陷突變株與同型缺陷突變株。

4.6.1 建構 REP4 基因異型缺陷突變株

利用引子 HJL495 與 HJL496 進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 ARG4 與 REP4 同源序列的聚合酶連鎖反應片段，將此片段轉形至白色念珠菌 BWP17 與 BWP17/

tetR-HIS1 後分別得到 4 個與 2 個轉形株。接著萃取出轉形株之染色體 DNA，並利用引 子HJL468 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應，如圖八之(A)所示，如果 ARG4 已成功地置 換掉第一個REP4 allele，經過聚合酶連鎖反應後可得兩片段，一為含有篩選標誌 ARG4 之3.7 kb DNA 片段，另一片段為含有另一股 REP4 allele 之 2.6 kb DNA 片段。由圖八之 (B)可知，轉形至 BWP17 與 BWP17/tetR-HIS1 所得到的轉形株皆已成功地置換掉第一個 REP4 allele，且由正對照組結果得知，所有的轉形株內尚存在著另一股 REP4 allele。

4.6.2 建構 REP4 基因同型缺陷突變株

利用引子HJL496 與 HJL497 進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 URA3 與 REP4 同源序列的聚合酶連鎖反應片段，將此片段轉形至白色念珠菌 BWP17 與 BWP17/

tetR-HIS1 後分別得到 2 個與 0 個轉形株。之後再萃取出轉形株之染色體 DNA，並利用 引子HJL133、HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應。如圖九之(A)所示，如果 URA3 已成功地置換掉第二個REP4 allele，利用引子 HJL133 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應，

可得一大小約2.2 kb 之 DNA 片段。另外，同時以引子 HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連 鎖反應，再次確認已置換成功的ARG4 篩選標誌，可得一大小約 1.5 kb 之 DNA 片段。

由圖九之(B)可知，轉形至 BWP17 後所得到的 2 個轉形株皆已成功地置換掉第二個 REP4 allele，且第一個 REP4 allele 確實已成功地被置換成篩選標誌 ARG4。後將兩個 rep4/rep4 同型缺陷突變株分別命名為WJC24 與 WJC31。

4.7 建構四環黴素調控表現系統(Tetracycline-regulatable expression system, TR system ; Nakayama et al., 2000)過度表現 REP4 基因

欲研究一特定基因之功能，除了直接將其破壞，觀察缺少此基因時有無表型之改 變；也可予以過度表現，查看基因表現量是否會影響特定表型之變化。四環黴素調控表 現系統主要是利用一可被doxycycline調控之TR啟動子達成基因調控之目的。此系統有兩 個重要的元素：一為TR啟動子，內含tet O序列；另一則為TR transactivator(tet R)，此為 doxycycline結合之主要部份。在沒有doxycycline之環境下，TR transactivator (Tet R)會與 TR啟動子中的tet O 結合，促使欲研究基因大量表現；但是當生長環境中含有doxycycline 時，doxycycline會和Tet R結合，抑制Tet R與 tet O結合，而使基因不表現，此系統即是 利用此原理達成基因調控。

四環黴素調控表現系統建構法如圖十所示。將一含有目標基因同源序列與TR啟動子 和篩選標誌URA3之DNA片段，轉形至含有目標基因異型缺陷突變株之白色念珠菌內，

利用TR啟動子替換目標基因啟動子，達成調控目標基因之目的。利用上述方式，將含有 TR啟動子之DNA片段轉形至WJC22和WJC23(BWP17/tetR-HIS1/REP4/rep4::ARG4)後，

各得到11個與6個轉形株，隨後分別萃取數個轉形株之染色體DNA，並利用聚合酶連鎖 反應確認是否已成功地置入TR啟動子。如圖十一之(A)所示，如果已成功地將TR啟動子 置入REP4/rep4異型缺陷突變株內，利用引子HJL199及HJL506進行聚合酶連鎖反應後，

可得到約2.1 kb的聚合酶連鎖反應產物。圖十一之(B)顯示，由WJC22及WJC23所得到的 轉形株萃取出之染色體DNA，經過聚合酶連鎖反應後，皆可得到和預期大小相符合的2.1 kb DNA片段。

4.8 建構rep4/rep4::REP4單套基因置入補救株

由於rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 在藥物敏感性試驗(Etest)中的表型 有些許改變(圖十四)，在 fluconazole 作用下，雖然 rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 及 WJC31 和野生菌株 SC5314 相比 MIC 值不變，但是和野生型 SC5314 相比，WJC24 抑

菌圈內菌數較多，看起來較模糊；而 WJC31 抑菌圈內菌數較少，顯得較乾淨。而在

itraconazole 作用下，野生型 SC5314 的 MIC 值約為 0.032 µg/ml，而 WJC24 的 MIC 值 約為0.125 µg/ml，WJC31 的 MIC 值約為 0.023 µg/ml。為了確定此現象之真實性，故將 REP4 單套基因重新置入 WJC24 與 WJC31 中(示意圖參見圖十二)，查看表型之變化能 否回復。方法為將含有 REP4 單套基因和篩選標誌 HIS1 基因之質體 pWJB43 轉形至

rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 內，利用同源重組置換產生單套基因置入 補救株。萃取所得菌落之染色體 DNA，進行聚合酶連鎖反應，確認 REP4 單套基因是 否已成功地置入。圖十三之(A)顯示，若經轉形成功得到含 REP4 單套基因置入，以引

rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 內，利用同源重組置換產生單套基因置入 補救株。萃取所得菌落之染色體 DNA，進行聚合酶連鎖反應，確認 REP4 單套基因是 否已成功地置入。圖十三之(A)顯示，若經轉形成功得到含 REP4 單套基因置入，以引