二、 材料
2.2 菌株
2.2.3 白色念珠菌
菌株(Strains) 基因型(Genotype) Reference
SC5314 Wild tpye Gillum et al.,
1984
BWP17 arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3 Wilson et al., 1999
BWP17/tetR-HIS1 arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3 ENO1/ENO1-tetR-ScHAP4AD-3xHA-CaHIS1
羅 秀 容 實 驗 室，國家衛生研 究 院 臨 床 研 究 組，未發表 HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 Lo et al., 1997 CSC106
CSC111 CSC119
rep3::ARG4/rep3::URA3
［parental strain: BWP17/tetR-HIS1］
紀 錦 昇 交 大 碩
［parental strain: BWP17］
紀 錦 昇 交 大 碩 士論文，楊昀良 實驗室，2004 WJC52 rep3/rep3::REP3-pGEM-HIS1
［parental strain: CSC80］ 本實驗 WJC53 rep3/rep3::REP3-pGEM-HIS1
［parental strain: CSC81］ 本實驗 WJC56 rep3/rep3::REP3-pGEM-HIS1
［parental strain: CSC101］ 本實驗 WJC18
WJC19 WJC21
rep4::ARG4/REP4
［parental strain: BWP17］ 本實驗 WJC24
WJC31
rep4::ARG4/rep4::URA3
［parental strain: WJC18］ 本實驗
WJC32
rep4::ARG4/rep4::URA3
ENO1/eno1::ENO1-tetR-ScHAP4-3xHA-HIS1
［parental strain: WJC24］
本實驗
WJC41
rep4::ARG4/rep4::URA3
ENO1/eno1::ENO1-tetR-ScHAP4-3xHA-HIS1
［parental strain: WJC31］
本實驗
WJC67 rep4/rep4::REP4-pGEM-HIS1
［parental strain: WJC24］ 本實驗 WJC73 rep4/rep4::REP4-pGEM-HIS1
［parental strain: WJC31］ 本實驗 WJC22
WJC23
rep4::ARG4/REP4
［parental strain: BWP17/tetR-HIS1］ 本實驗 WJC44 rep4::ARG4/ENO1::TR-ENO1-URA3
［parental strain: WJC22］ 本實驗 WJC48 rep4::ARG4/ENO1::TR-ENO1-URA3
［parental strain: WJC23］ 本實驗 WJC5
WJC8
rep5::ARG4/REP5
［parental strain: BWP17/tetR-HIS1］ 本實驗 WJC58 rep5::ARG4/ENO1::TR-ENO1-URA3
［parental strain: WJC5］ 本實驗 WJC63 rep5::ARG4/ENO1::TR-ENO1-URA3
［parental strain: WJC8］ 本實驗 2.3 引子
2.3.1 針對 REP3 單套基因置入補救(knockin)實驗所設計的引子
引子 序列(5' → 3' ) 位置
HJL504 CGGGATCCGTCACTGGATCTGGATCAAC orf19.3926:+1114~+1133 HJL505 CGGGATCCATAGTTCCATAGGCAGCCTC orf19.3929:+902 ~ +883 HJL508 CTGCACAGCATCACCTCG REP3:+1098 ~ +1081 HJL509 GTTGATTTGGCAACTCGC REP3: + 646 ~ + 629 HJL510 CAGTTTGGTAGCATCGTG REP3: + 180 ~ +163 HJL511 TCTACCAATTGCAATCTGCA REP3: -298 ~ -317 HJL512 ATCACTCCGCATGATCCA orf19.3929: + 280 ~+297 HJL513 GGTGCTGTTGATGCTCCA orf19.3929: + 718 ~+735
2.3.2 針對 REP4 基因破壞(knockout)、基因置入(knockin)以及四環黴素調控表現系統(Tet R regulatable system)所設計的引子
引子 序列(5' → 3' ) 位置
CGACGTT
C. albicans REP4:
-302~-233and ARG4
C .albicans REP4:
+873~+804 and URA3
HJL497
GACAAGGCTACCTGCAACAAGTGCCA ACACAAAACATCACTAACAATTCTTATT ATCCAAGAAACACATCGCTCGGAATT AACCCTCACT
C. albicans REP4:+101 ~ +170 and URA3
HJL506 CTCGGGATCCGGACTTGATTAAACGG
GTGC orf19.5019: +1860~+1879
HJL507 CACGGGATCCGAGTACCAGTTGGTAA
HJL596 CCTTCGCTGTCTTCTTCC pGEM-HIS1:3066 ~ 3049 HJL597 CCTTTCTGGTCTTTGTTCAAG REP4 : + 1134 ~ + 1114 HJL598 GCAGGTAGCCTTGTCTCA REP4 : + 115~ + 98 HJL599 CTTGTTGGCTGGAATTTGTGA REP4: - 461 ~ - 481 HJL600 GATGGTTCTGCAAGCATTAT orf19.5021: + 713~ +694
2.3.3 針對 REP5 基因破壞(knockout)以及四環黴素調控表現系統(Tet R regulatable system) 所設計的引子
C. albicans REP5: -272 ~ - 203 and ARG4
C. albicans REP5:+2350
~ + 2281 and ARG4
HJL481
TTGAACAACTGTCGGGAATCAAAAGATG GACAGATGGTATTTCATGGTCCCCATCAA GAATCCAAGGTCGGTTTTCCCAGTCAC GACGTT
C. albicans REP5: +170
~ +239 and URA3
◆AB BIODISK : Etest drug strips, amphotericin B (Cat.No.51002683), fluconazole(Cat.No.
51001088), itraconazole (Cat.No.51002588), ketoconazole (Cat.No.51002598), voriconazole (Cat.No.51003288), flucytosine (Cat.No.51001098)
◆Amersham Biosciences : rTaq DNA polymerase (Cat.No.27-0798-06)
◆BDH: 20 x SSC (Cat.No.443527N)
◆BIO-RAD: 50 x TAE (Cat.No.161-0773)
◆Difco laboratories:
Bacto agar (Cat.No.214040), LB agar (Cat.No.244520), yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat.No.291940), LB broth (Cat.No.244620), YPD broth (Cat.No.242820), BHI (Cat.No.0037-17)
◆Invitrogen: Agarose (Cat.No.15510-027), 1Kb plus DNA ladder (Cat.No.12308-011)
◆ JRH BIOSCIENCES : Fetal bovine serum (Cat.No.12003-500M)
◆NEB: Restriction Enzymes, AccI, Afl ,Ⅱ Bam HI, BsrGI, ClaI, EcoRI, EcoR , Ⅴ Hind , Ⅲ Kpn I, Pml I , SpeI , Sal I, , Sac ,Ⅱ , Xba I , XhoI, Alkaline phosphatase , Calf intestinal (CIP), Klenow , Vent DNA polymerase
◆Promega : T4 DNA ligase (Cat.No.M-1801)
◆Roche : PCR DIG Synthesis kit (Cat.No.1636090), DNA molecular – weight marker DIG
Ⅱ -labeled(Cat.No.1218590), Anti-DIG-AP(Cat.No.713023),CSPD(Cat.No.1655884), Blocking reagent (Cat.No.1096176), DIG Easy Hyb (Cat.No.1603558), Nylon Membranes, positively charged (Cat.No.1417240)
◆Sigma Chemical Co.:
Arginine(Cat.No.A-5131), Dithiothreitol(DTT)(Cat.No.D9779), Disodium ethylenediamine- tetraacetate(EDTA)(Cat.No.E-5134), Glassbeads(425 ~ 600µm)(Cat.No.G9268-500G), Histidine (Cat.No.H-8125), Lithium acetate (CH3COOLi) (Cat. No.L-6883), L-leucine (Cat.No.L-8000), Miconazole (Cat.No.M-3512), Polyethylene Glycol3350 (PEG3350) (Cat.No.P4338), Uracil (Cat.No.U-0750), Uridine (Cat.No. U-3003)
◆ E Merck. Germany:
Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) (Cat.No.113760.0100), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat.No.S26740), Ethanol (Cat.No.K33534874), Ethidium bromide (Cat.No. K27928515), Glucose (Cat.No.K33069537), N,N-dimethylformamide (Cat.No. K27226853), Isopropanol (Cat.No.K32632434), Potassium chloride (KCl) (Cat.No.K24252236), Sodium hydroxide (NaOH) (Cat.No.B886298), Sodium carbonate (Na2CO3) (Cat.No.A375692), Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-HCl) (Cat.No.8382T006), Sodium chloride (NaCl) (Cat.No.K29779304), Maleic acid (Cat.No.S27857), Tween 20 (Cat.No.P-1379), Triton X-100(Cat.No.K23841503)
◆USB: Glycerol (Cat.No.US16374)
2.5 緩衝溶液：
◆ 10 x TE buffer(pH 7.5 & pH 8.0):
100 mM Tris-HCl (pH 7.5& 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0)
◆ 50 % PEG3350:
200 g polyethyleneglycol3350 added ddH2O to 400 ml
◆ 40 % Dextrose:
40g Dextrose added ddH2O to 100 ml
◆ 1 M Lithium Acetate:
40.8 g Lithium Acetate added ddH2O to 400 ml
◆ Breaking buffer:
10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 %(w/v) SDS, 2 % (w/v) TritonX-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA
◆ Z buffer:
Na2HPO4‧7 H2O 16.1 g, NaH2PO4 H2O 5.5 g, KCl 0.75 g, MgSO4 7H2O 0.246 g, β-mercaptoethonol 2.7 ml added dd H2O to 1000 ml pH 7.0
◆ Maleic acid buffer:
0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3 % Tween 20 (pH 7.5)
◆ Blocking solution:
1 % (W/V) blocking reagent dissolved in maleic acid buffer
◆ Detection buffer
0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl (pH 9.5)
◆ Denaturation Solution:
0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
◆ Neutralization Solution:
1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5)
2.6 培養液和培養基製備：
◆ BHI broth: (Difco, Cat.No. 0037-17)
33.7 % Calf brain infusion solids, 13.5 % Beef heart infusion solids, 27 % Proteose peptone, 5.4 % Glucose, 13.5 %Sodium chloride, 6.7 % Disodium phosphate
◆ LB(Lucia-Bertni) broth: (Difco, Cat.No. 244620) 1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1% NaCl
◆ LB/ ampicillin broth:
1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl, 50 µg/ml ampicillin
◆ SD broth: (Difco, Cat.No. 291940)
0.67 % Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose
◆ YPD borth: (Difco, Cat.No. 242820)
2 % Bacto-peptone, 1 % yeast extract, 2 % dextrose
◆ LB/ ampicillin agar:
1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl, 1.5% agar , 50 µg/ml ampicillin
◆ SD(Synthetic Dextrose) agar: Non-selective agar
0.67 % Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose, 2% agar
Amino acid Concentration L-Adenine (Sigma A-9126) 20 mg/L L-Arginine-HCl (Sigma A-5131) 20 mg/L L-Histidine-HCl (Sigma H-9511) 20 mg/L
L-Uracil (Sigma U- 0750) 20 mg/L Uridine (Sigma U- 3003) 80 mg/L
配置含有營養缺陷菌株所需之 SD 培養基時，需外加上述濃度之胺基酸，以 SD/Histidine agar 為例：
0.67 % Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose, 2 %agar, 20 mg/L Histidine-HCl
其餘含有特定胺基酸之SD agar 配置方法依此類推
◆ YPD/Uridine agar:
2 % Bacto-peptone, 1 % yeast extract, 2 % dextrose, 80 mg/L Uridine 2.7 濾紙：(β-gal colony-lift filter assay 實驗所需)
◆ S&S(Schleicher & Schuell) #576 filter (90mm) REF. NO.: 311409
LOT.: BG0470-1
◆ S&S(Schleicher & Schuell) #593 filter (90mm) REF. NO.: 10314509
LOT.: CJ1016-1 2.8 儀器設備：
程式溫度控制儀 PTC-200 (MJ Research) 迴轉式震盪培養箱 (TKS)
落地型高速離心機 J2-MC (Beckman) 桌上型高速冷凍離心機 (Heraeus)
桌上型低速冷凍離心機 ( SORVALL RT7)
微量高速離心機 DENVILLE 260D (DENVILLE SCIENTIFIC INC) 電子天平 AT261 DeltaRange (METTLER TOLEDO)
GG4002-S (METTLER TOLEDO) 加熱攪拌器 (CORNING)
酸鹼度計微電腦自動溫度 (HANNA instruments) 單槽乾浴器 (Violet Bio Sciences, Inc.)
恆溫水浴器 (CHERNG HUEI Co.)
試管震盪器Vortex-2 genie (Scientific Industry)
全光域多功能分析系統 (Molecular Devices) 倒立顯微鏡 (OLYMPUS)
數位相機COOLPIX 990 (Nikon)
基因脈衝儀 GENE PULSER (BIOⅡ -RAD) 往覆式細菌接種套組(Cathra)
電泳影像擷取分析系統 (Alpha Innotech Corporation) TurboBlotter system (Schleicher & Schuell)
水平式電泳槽 SUB-CELL GT ( BIO- RAD) 紫外光接合器 UV crosslinker (Stratagene) 玻璃雙門 4 ºC 冷凍櫃(LEVEL)
-30 ºC 直立式雙門冷凍櫃 (SANYO) -80 ºC 超低溫冷凍櫃 UltimaⅡ(REVCO)
三、方法
3.1 DNA 方法
使用 Qiagen Inc 之產品 QIAprep spin miniprep kit (Cat.No. 27106)並依照其說明書，
萃取出大腸桿菌內之質體DNA。利用 Qiagen Inc 之產品 QIAprep gel extraction kit (Cat.
No. 28706)並依照其說明書，萃取出洋菜膠內之 DNA 片段。
3.1.1 DNA 的連接反應(Ligation)
將載體 DNA (vector DNA)與欲連接的 DNA 片段 (insert DNA) 以適當的限制酵素處 理後，取莫爾濃度比為1:3 或 1:1 之載體 DNA 與欲連接的 DNA 片段，加入總反應體積 10 µl，內含 1 unit 的 T4 DNA ligase 之反應液中，於 4 ºC 進行連接反應至隔天。
3.1.2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction)
本實驗聚合酶連鎖反應主要之模板為質體DNA 或白色念珠菌之染色體 DNA，利用 所設計的引子夾出並放大所需之DNA 片段。將下列物質混合於 0.5 ml 微量離心管內：
總體積50 µl 的反應液中包含 5 µl 的 10 x PCR buffer、1 unit rTag Polymerase(5 unit /1µl)、200 µM dNTP、primer F 和 primer R 約 0.2 ~ 1.0 µM、模板 DNA(白色念珠菌染色 體DNA 約 0.1 ~ 1 µg，質體 DNA 約 1ng)，無菌二次水。反應步驟為: (1)94 ºC，5 分鐘 (2)94 ºC，40 秒 (3)50 ºC ~ 60 ºC，30 秒(依引子 Tm 值減 2 ºC) (4)72 ºC，1~3 分鐘 (5)重複(2) ~ (4)步驟 34 次反應 (6)72 ºC，10 分鐘 (7) 4 ºC 停止反應。
3.2 利用電穿透法(Electroporation)進行大腸桿菌的轉形(Transformation) 勝任細胞的製備:
將 DH5α 或 JM109 接種於 5 ml LB 培養液中，於 37 ºC 培養箱中以 150 rpm 震盪隔 夜培養。將隔夜培養之菌液加入1 L 新鮮的 LB 培養液中，放入 37 ºC 培養箱中以 150 rpm 震盪培養至 OD600至0.4 ~ 0.7 左右。將菌液放置冰上 15 ~ 30 分鐘後轉移至 4 個欲先 冷卻之500 ml 離心瓶中，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，以 200 ml/each bottole 冰的無菌二次水沖洗細胞後，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，
以50 ml/each bottole 冰的無菌二次水沖洗細胞後，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心
地去掉濾液，以10 ml/each bottole 冰的 10 % glycerol 懸浮細胞，將細胞轉移至 50 ml 離 心管後以5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，以 2 ml/each tube 冰的 10 % glycerol 懸浮細胞。以每管80 µl 細胞量分裝至 1.5 ml 離心管後放入-80 ºC 冰箱保存。.
大腸桿菌電穿透法:
於-80 ºC 冰箱取出勝任細胞(competent cells)(DH5α 或 JM109)置於冰上解凍。在 80 µl 的勝任細胞中加入0.1 ~ 1 µg 的質體 DNA，輕輕混合均勻後將此 cell/DNA 混合物加入 預先冷卻的0.2 ml electroporation cuvette 中，輕拍管壁使樣本集中於底部。將 BioRAD Gene Pulse 設定在 25 µF 和 2.45 kV，並將 pulse controller 設定在 200 Ω。以拭紙擦去 electroporation cuvette 管壁外的水氣，將 cuvette 放入 slide 中，並將 slide 推入 chamber 內直到cuvette 確實緊密位於 chamber 中，同時按壓機器左側的兩個紅色 Pulse 按扭直到 聽到嗶嗶聲。取出cuvette 後以回溫之 1 ml SOC 培養液懸浮細胞，將細胞轉移至先前 1.5 ml 離心管，放入 37 ºC 培養箱內以 150 rpm 水平震盪一小時。一小時後取出離心管 於桌上型離心機中以3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉大多數濾液，留下約 100 µl 的培養液 重新懸浮細胞。取100 µl 的細胞均勻塗抹至 LB amp 培養基上並於 37 ºC 培養箱內培養 12 至 18 小時。
3.3 將質體 DNA 轉形至啤酒酵母中(LioAc method)
將啤酒酵母細胞培養在 3 ml 選擇性培養液中，於 30 ºC，150 rpm 震盪培養隔夜後，
轉養至15 ml YPD 培養液，調整菌液濃度至 OD600為0.4 左右。於 30 ºC，150 rpm 振盪 數小時，直到菌液濃度約在OD600為0.8 左右。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後以 15 ml 1x TE (pH7.5) 懸浮細胞，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後加入 4 ml 0.1M LioAc/TE (pH7.5) 懸浮細胞，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後以 1 ml 0.1 M LioAc/TE (pH7.5)懸浮菌體，靜置室溫 10 分鐘。以 100 ºC 加熱 10 mg/ml salmon sperm DNA 2 分鐘，
後立即置於冰上。取4 µl salmon sperm DNA 當作載體 DNA，1 ~ 3 µg 欲被轉形的質體 DNA 和 0.7 ml 50% PEG3350 /0.1 M of LioAc/TE 均勻混合後，於 30 ºC 培養箱慢速旋轉 30 分鐘後，於42 ºC 水浴槽，進行熱休克(heat shock)反應 15 分鐘後，置於冰上 2 分鐘。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去除濾液後以 1 ml 1x TE (pH 7.5)懸浮細胞。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉大部份濾液，留下約100 µl 的 buffer 重新懸浮菌體，將菌液均勻塗抹至適當 的篩選培養基上，於30 ºC 培養 3 至 4 天。
3.4 於加藥狀況下測量 β-galactosidase 活性(Colony-Lift Filter Assay)
將啤酒酵母細胞培養在具選擇性的培養基上，於 30 ºC 培養箱中培養 2 至 3 天後將
啤酒酵母細胞複製到含有濾紙的新培養基上，放入30 ºC 培養箱中隔夜培養。配製藥品
miconazole (miconazole 溶於 DMSO 中)至濃度為 100 mg/ml，以 1:1000 倍稀釋加入選擇 性的培養液中。將濾紙浸入含有100 µg /ml miconazole 培養液中，並將長有菌落之另一 濾紙放於含有miconazole 之濾紙上，將濾紙放入 30 ºC 培養箱中 1 小時。一小時後取出
長有菌落之濾紙，浸入液態氮內1 分鐘，後置於室溫下回溫(此步驟可使細胞穿透)。於
回溫間隔中以Z buffer/2ME/X-gal stock(10 ml/14 ul/84 ul)之溶液浸潤新濾紙。將長有菌 落的濾紙小心地放在已含Z buffer/X-gal 之濾紙上，趕走濾紙間的氣泡，放入 30 ºC 培養 箱中反應，每隔15 至 20 分鐘觀察呈色結果。
3.5 建構含C19 library clone之主要兩個open reading frames (ORFs)之一的質體(參見圖 六(A))
C19染色體DNA片段上具有兩個主要的ORFs- orf19.5019和orf19.5020。將C19以限制 酵素BsrGⅠ及SalⅠ切割，此步驟移除大部分的orf19.5020片段，破壞了orf19.5020，隨後 以Klenow酵素將質體DNA尾端補齊，產生只包含完整orf19.5019之質體。利用相同策略，
以限制酵素XhoⅠ切除質體C19中之orf19.5019片段，當質體自我接合後得到了只具有完 整orf19.5020的質體。
3.6 建構 rep3/rep3::REP3 單套基因置入(knockin)補救株
將包含 REP3 完整基因及上下游基因部分片段之 BamHⅠDNA 片段接入質體 pGEM-HIS1 中，將此質體命名為 pWJB24。以限制酵素 AflⅡ切割 pWJB24，切割位置位 於REP3 基因的下游基因中，此一步驟將質體切割成線型，之後將質體轉形至白色念珠 菌CSC80、CSC81 及 CSC101(rep3/rep3 同型缺陷突變株)中。萃取所得轉形株之染色體 DNA，利用引子 HJL458 及 HJL505 進行聚合酶連鎖反應，確認是否已將 REP3 單套基 因正確地置入轉形株內後，將正確的轉形株分別命名為WJC52、WJC53 以及 WJC56。
3.7 白色念珠菌轉形(Candida transformation)
將白色念珠菌接種至 3 ml YPD+Uridine 的培養液中，於 30 ºC 培養箱，以 180 rpm 震盪培養隔夜後，取270 µl (1:100 稀釋)菌液轉養至 27 ml YPD+Uridine 培養液內(OD600
約在0.1 左右)，於 30 ºC 培養箱中以 180 rpm 振盪培養 4 至 6 小時，直到 OD600約在0.7 到1.0 之間。將菌液轉移到 50 ml 離心管內，室溫下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，之後以 10 ml 的無菌二次水，5 ml sterile 1x TE buffer (pH 7.5)，2 ml sterile 0.1 M LioAc/TE buffer 順次沖洗細胞，室溫下以3000 rpm 離心 10 分鐘後，以 250 µl 0.1 M LioAc/TE buffer 懸 浮細胞，於室溫下靜置10 分鐘後即為念珠菌之勝任細胞。取 5 ~ 10 µg 欲轉形之 DNA 片 段(溶於 1 x TE buffer; pH 8.0；體積 ≤ 13 µl )及 10 µl 的 10 mg/ml Salmon sperm DNA(預 先以100 ºC 加熱 2 分鐘再迅速置於冰上 2 分鐘)和 100 µl 的勝任細胞混合均勻，於 30 ºC 靜置30 分鐘後加入 700 µl 50 % PEG3350 /0.1 M of LioAc/TE，於 30 ºC 培養箱內慢速搖晃 16 小時後，在 44 ºC 水浴槽中進行熱休克作用(heat shock)15 分鐘後置冰上 2 分鐘。室溫 下以3000 rpm 離心 5 分鐘，去除濾液，加入 1 ml 1 x TE buffer (pH 7.5)懸浮菌體，室溫 下以3000 rpm 離心 5 分鐘，去除大部份濾液，留下約 100 µl buffer 重新懸浮細胞，將 菌液均勻塗抹至適當的篩選培養基，於30 ºC 培養 3 到 4 天。
3.8 建構 REP4/rep4 異型缺陷突變株及 rep4/rep4 同型缺陷突變株
利用含有與欲研究基因相同序列及篩選標誌(ARG4 和 URA3)之 DNA 片段在白色念 珠菌中進行重組置換而達到基因破壞的目的。以篩選標誌ARG4 替代 REP4 單套基因之 轉譯起始點上游302 bp 至轉譯終止點上游 87 bp 區域。方法為利用含有 REP4 基因相同
利用含有與欲研究基因相同序列及篩選標誌(ARG4 和 URA3)之 DNA 片段在白色念 珠菌中進行重組置換而達到基因破壞的目的。以篩選標誌ARG4 替代 REP4 單套基因之 轉譯起始點上游302 bp 至轉譯終止點上游 87 bp 區域。方法為利用含有 REP4 基因相同