聚合酶連鎖反應

本實驗聚合酶連鎖反應主要之模板為質體DNA 或白色念珠菌之染色體 DNA，利用 所設計的引子夾出並放大所需之DNA 片段。將下列物質混合於 0.5 ml 微量離心管內：

總體積50 µl 的反應液中包含 5 µl 的 10 x PCR buffer、1 unit rTag Polymerase(5 unit /1µl)、200 µM dNTP、primer F 和 primer R 約 0.2 ~ 1.0 µM、模板 DNA(白色念珠菌染色 體DNA 約 0.1 ~ 1 µg，質體 DNA 約 1ng)，無菌二次水。反應步驟為: (1)94 ºC，5 分鐘 (2)94 ºC，40 秒 (3)50 ºC ~ 60 ºC，30 秒(依引子 Tm 值減 2 ºC) (4)72 ºC，1~3 分鐘 (5)重複(2) ~ (4)步驟 34 次反應 (6)72 ºC，10 分鐘 (7) 4 ºC 停止反應。

3.2 利用電穿透法(Electroporation)進行大腸桿菌的轉形(Transformation) 勝任細胞的製備:

將 DH5α 或 JM109 接種於 5 ml LB 培養液中，於 37 ºC 培養箱中以 150 rpm 震盪隔 夜培養。將隔夜培養之菌液加入1 L 新鮮的 LB 培養液中，放入 37 ºC 培養箱中以 150 rpm 震盪培養至 OD600至0.4 ~ 0.7 左右。將菌液放置冰上 15 ~ 30 分鐘後轉移至 4 個欲先 冷卻之500 ml 離心瓶中，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，以 200 ml/each bottole 冰的無菌二次水沖洗細胞後，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，

以50 ml/each bottole 冰的無菌二次水沖洗細胞後，以 5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心

地去掉濾液，以10 ml/each bottole 冰的 10 % glycerol 懸浮細胞，將細胞轉移至 50 ml 離 心管後以5K rpm，4 ºC 離心 5 分鐘。小心地去掉濾液，以 2 ml/each tube 冰的 10 % glycerol 懸浮細胞。以每管80 µl 細胞量分裝至 1.5 ml 離心管後放入-80 ºC 冰箱保存。.

大腸桿菌電穿透法:

於-80 ºC 冰箱取出勝任細胞(competent cells)(DH5α 或 JM109)置於冰上解凍。在 80 µl 的勝任細胞中加入0.1 ~ 1 µg 的質體 DNA，輕輕混合均勻後將此 cell/DNA 混合物加入 預先冷卻的0.2 ml electroporation cuvette 中，輕拍管壁使樣本集中於底部。將 BioRAD Gene Pulse 設定在 25 µF 和 2.45 kV，並將 pulse controller 設定在 200 Ω。以拭紙擦去 electroporation cuvette 管壁外的水氣，將 cuvette 放入 slide 中，並將 slide 推入 chamber 內直到cuvette 確實緊密位於 chamber 中，同時按壓機器左側的兩個紅色 Pulse 按扭直到 聽到嗶嗶聲。取出cuvette 後以回溫之 1 ml SOC 培養液懸浮細胞，將細胞轉移至先前 1.5 ml 離心管，放入 37 ºC 培養箱內以 150 rpm 水平震盪一小時。一小時後取出離心管 於桌上型離心機中以3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉大多數濾液，留下約 100 µl 的培養液 重新懸浮細胞。取100 µl 的細胞均勻塗抹至 LB amp 培養基上並於 37 ºC 培養箱內培養 12 至 18 小時。

3.3 將質體 DNA 轉形至啤酒酵母中(LioAc method)

將啤酒酵母細胞培養在 3 ml 選擇性培養液中，於 30 ºC，150 rpm 震盪培養隔夜後，

轉養至15 ml YPD 培養液，調整菌液濃度至 OD600為0.4 左右。於 30 ºC，150 rpm 振盪 數小時，直到菌液濃度約在OD600為0.8 左右。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後以 15 ml 1x TE (pH7.5) 懸浮細胞，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後加入 4 ml 0.1M LioAc/TE (pH7.5) 懸浮細胞，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉濾液後以 1 ml 0.1 M LioAc/TE (pH7.5)懸浮菌體，靜置室溫 10 分鐘。以 100 ºC 加熱 10 mg/ml salmon sperm DNA 2 分鐘，

後立即置於冰上。取4 µl salmon sperm DNA 當作載體 DNA，1 ~ 3 µg 欲被轉形的質體 DNA 和 0.7 ml 50% PEG3350 /0.1 M of LioAc/TE 均勻混合後，於 30 ºC 培養箱慢速旋轉 30 分鐘後，於42 ºC 水浴槽，進行熱休克(heat shock)反應 15 分鐘後，置於冰上 2 分鐘。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去除濾液後以 1 ml 1x TE (pH 7.5)懸浮細胞。以 3000 rpm 離心 5 分鐘，去掉大部份濾液，留下約100 µl 的 buffer 重新懸浮菌體，將菌液均勻塗抹至適當 的篩選培養基上，於30 ºC 培養 3 至 4 天。

3.4 於加藥狀況下測量 β-galactosidase 活性(Colony-Lift Filter Assay)

將啤酒酵母細胞培養在具選擇性的培養基上，於 30 ºC 培養箱中培養 2 至 3 天後將

啤酒酵母細胞複製到含有濾紙的新培養基上，放入30 ºC 培養箱中隔夜培養。配製藥品

miconazole (miconazole 溶於 DMSO 中)至濃度為 100 mg/ml，以 1:1000 倍稀釋加入選擇 性的培養液中。將濾紙浸入含有100 µg /ml miconazole 培養液中，並將長有菌落之另一 濾紙放於含有miconazole 之濾紙上，將濾紙放入 30 ºC 培養箱中 1 小時。一小時後取出

長有菌落之濾紙，浸入液態氮內1 分鐘，後置於室溫下回溫(此步驟可使細胞穿透)。於

回溫間隔中以Z buffer/2ME/X-gal stock(10 ml/14 ul/84 ul)之溶液浸潤新濾紙。將長有菌 落的濾紙小心地放在已含Z buffer/X-gal 之濾紙上，趕走濾紙間的氣泡，放入 30 ºC 培養 箱中反應，每隔15 至 20 分鐘觀察呈色結果。

3.5 建構含C19 library clone之主要兩個open reading frames (ORFs)之一的質體(參見圖 六(A))

C19染色體DNA片段上具有兩個主要的ORFs- orf19.5019和orf19.5020。將C19以限制 酵素BsrGⅠ及SalⅠ切割，此步驟移除大部分的orf19.5020片段，破壞了orf19.5020，隨後 以Klenow酵素將質體DNA尾端補齊，產生只包含完整orf19.5019之質體。利用相同策略，

以限制酵素XhoⅠ切除質體C19中之orf19.5019片段，當質體自我接合後得到了只具有完 整orf19.5020的質體。

3.6 建構 rep3/rep3::REP3 單套基因置入(knockin)補救株

將包含 REP3 完整基因及上下游基因部分片段之 BamHⅠDNA 片段接入質體 pGEM-HIS1 中，將此質體命名為 pWJB24。以限制酵素 AflⅡ切割 pWJB24，切割位置位 於REP3 基因的下游基因中，此一步驟將質體切割成線型，之後將質體轉形至白色念珠 菌CSC80、CSC81 及 CSC101(rep3/rep3 同型缺陷突變株)中。萃取所得轉形株之染色體 DNA，利用引子 HJL458 及 HJL505 進行聚合酶連鎖反應，確認是否已將 REP3 單套基 因正確地置入轉形株內後，將正確的轉形株分別命名為WJC52、WJC53 以及 WJC56。

3.7 白色念珠菌轉形(Candida transformation)

將白色念珠菌接種至 3 ml YPD+Uridine 的培養液中，於 30 ºC 培養箱，以 180 rpm 震盪培養隔夜後，取270 µl (1:100 稀釋)菌液轉養至 27 ml YPD+Uridine 培養液內(OD600

約在0.1 左右)，於 30 ºC 培養箱中以 180 rpm 振盪培養 4 至 6 小時，直到 OD600約在0.7 到1.0 之間。將菌液轉移到 50 ml 離心管內，室溫下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，之後以 10 ml 的無菌二次水，5 ml sterile 1x TE buffer (pH 7.5)，2 ml sterile 0.1 M LioAc/TE buffer 順次沖洗細胞，室溫下以3000 rpm 離心 10 分鐘後，以 250 µl 0.1 M LioAc/TE buffer 懸 浮細胞，於室溫下靜置10 分鐘後即為念珠菌之勝任細胞。取 5 ~ 10 µg 欲轉形之 DNA 片 段(溶於 1 x TE buffer; pH 8.0；體積 ≤ 13 µl )及 10 µl 的 10 mg/ml Salmon sperm DNA(預 先以100 ºC 加熱 2 分鐘再迅速置於冰上 2 分鐘)和 100 µl 的勝任細胞混合均勻，於 30 ºC 靜置30 分鐘後加入 700 µl 50 % PEG3350 /0.1 M of LioAc/TE，於 30 ºC 培養箱內慢速搖晃 16 小時後，在 44 ºC 水浴槽中進行熱休克作用(heat shock)15 分鐘後置冰上 2 分鐘。室溫 下以3000 rpm 離心 5 分鐘，去除濾液，加入 1 ml 1 x TE buffer (pH 7.5)懸浮菌體，室溫 下以3000 rpm 離心 5 分鐘，去除大部份濾液，留下約 100 µl buffer 重新懸浮細胞，將 菌液均勻塗抹至適當的篩選培養基，於30 ºC 培養 3 到 4 天。

3.8 建構 REP4/rep4 異型缺陷突變株及 rep4/rep4 同型缺陷突變株

利用含有與欲研究基因相同序列及篩選標誌(ARG4 和 URA3)之 DNA 片段在白色念 珠菌中進行重組置換而達到基因破壞的目的。以篩選標誌ARG4 替代 REP4 單套基因之 轉譯起始點上游302 bp 至轉譯終止點上游 87 bp 區域。方法為利用含有 REP4 基因相同 序列70 mer 與篩選標誌 ARG4 序列 20 mer 之引子 HJL 494 及 HJL 495 及帶有 ARG4 基 因之質體pRS-ARG4∆ Spe I 當作模板進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 ARG4 及 部份REP4 基因之 2.3 kb DNA 片段，將此聚合酶連鎖反應片段轉形至白色念珠菌 BWP17 及BWP17/tetR-HIS1 中，建構 REP4/rep4 異型缺陷突變株。

接著以篩選標誌 URA3-dpl200-based cassette 替代 REP4 另一套基因之轉譯起始點下 游170 bp 至轉譯終止點上游 220 bp 區域。以含有 REP4 基因相同序列 70 mer 與篩選標 誌 URA3 序列 20 mer 之引子 HJL496 及 HJL497 及質體 pDDB57-URA3-dpl200-based cassette 當作模板進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 URA3 及部分 REP4 基因之 1.8 kb DNA 片段。將此片段轉形至 WJC18 建構 rep4/rep4 同型缺陷突變株。

3.9 建構 rep4/rep4::REP4 單套基因置入補救株

將包含 REP4 完整基因及上下游基因部分片段之 BamHⅠDNA 片段接入質體 pGEM-HIS1 中，將此質體命名為 pWJB43。以限制酵素 PmlⅠ切割 pWJB43，切割位置

位於REP4 基因的下游基因中，此一步驟將質體切割成線型，之後將質體轉形至白色念 珠菌WJC24 與 WJC31(rep4/rep4 同型缺陷突變株)中。萃取所得轉形株之染色體 DNA，

利用引子HJL516 及 HJL507 進行聚合酶連鎖反應，確認是否已將 REP4 單套基因正確地 置入轉形株內後，將正確的轉形株分別命名為WJC67 與 WJC73。

3.10 建構 REP5/rep5 異型缺陷突變株

利用含有與欲研究基因相同序列及篩選標誌 ARG4 之 DNA 片段在白色念珠菌中進 行重組置換而達到基因破壞的目的。目標為以篩選標誌ARG4 替代 REP5 單套基因轉譯 起始點上游 202 bp 至轉譯終止點上游 79 bp 區域。方法為利用含有 REP5 基因相同序列 70 mer 與篩選標誌 ARG4 序列 20 mer 之引子 HJL 479 及 HJL 480 及含 ARG4 基因之質體 pRS-ARG4∆ Spe I 當作模板進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 ARG4 及部分 REP5 基因之 2.3 kb DNA 片段，將此聚合酶連鎖反應片段轉形至白色念珠菌 BWP17 及 BWP17/tet R-HIS1 中，建構 REP5/rep5 異型缺陷突變株。

3.11 建 構 四 環 黴 素 調 控 表 現 系 統 (Tetracycline-regulatable expression system ， TR system)

本操作流程是利用四環黴素調控表現系統進行基因過度表現(overexpression)或是抑 制基因表現(inhibition of gene expression)的實驗 (Nakayama et al., 2000)。 首先要在已含 驅動tet R 表現之白色念珠菌(BWP17/tet R-HIS1)中，將欲研究基因的單套基因利用序列 同源基因重組置換的方式(homologous recombination)，進行單套基因的破壞(knockout)。

再將已建構含有TR 啟動子(TR promoter)及 URA3 基因與欲研究基因之質體以限制酵素 處理後，將含有TR 啟動子及 URA3 基因與欲研究基因之 DNA 片段轉形至前述基因破 壞所得到之轉形株。經過二次轉形後所得之突變菌株，在沒有 doxycycline 之環境下，

可以藉由Tet R 與 TR 啟動子上的 tet O 結合，促使欲研究基因大量表現；但是當生長環 境中含有doxycycline 時，doxycycline 會和 Tet R 結合，抑制 Tet R 與 tet O 結合，而使 基因不表現。

3.11.1 將 TR 啟動子及 URA3 標記置入 REP4 和 REP5 之異型缺陷突變株

以白色念珠菌之染色體 DNA 當作模板，利用引子 HJL514 和 HJL515 進行聚合酶連 鎖反應，得到REP4 啟動子區約 300 bp 之 DNA 片段(-121 ~ -423)，此 DNA 片段為 A 區

(A region)。以引子 HJL516 及 HJL517 再次進行聚合酶連鎖反應，得到包含轉譯起始點 約500 bp 之 DNA 片段(-3 ~ + 597)，此 DNA 片段為 B 區(B region)。將 A、B 兩片段分 別連接至含有 TR 啟動子及 URA3 基因之質體 p99CAU 中，之後以限制酵素 KpnⅠ及 SacⅡ處理此質體，得到包含 TR 啟動子及 URA3 基因與 REP4 A、B 區之 DNA 片段，

將此片段轉形至含有REP4 異型缺陷突變株 WJC22 及 WJC23 內，產生可以 doxycycline 調控表現之REP4 轉形株。

依同原理利用引子 HJL571 和 HJL572 進行聚合酶連鎖反應，得到 REP5 啟動子區 520 bp 大小之 DNA 片段(-124 ~ -643)，此 DNA 片段為 A 區(A region)。以引子 HJL573 及HJL574 再次進行聚合酶連鎖反應，得到包含轉譯起始點 514 bp 大小之 DNA 片段(-3

~ +511 )，此 DNA 片段為 B 區(B region)。將 A、B 兩片段分別連接至含有 TR 啟動子及 URA3 基因之質體 p99CAU 中，之後以限制酵素 KpnⅠ及 SacⅡ處理此質體，得到包含

~ +511 )，此 DNA 片段為 B 區(B region)。將 A、B 兩片段分別連接至含有 TR 啟動子及 URA3 基因之質體 p99CAU 中，之後以限制酵素 KpnⅠ及 SacⅡ處理此質體，得到包含