REP3 基因突變株不會影響在 37 ºC 及加入胎牛血清培養中芽管的生成

為了要了解 REP3 基因突變後，在誘發菌絲生長之環境中(37 ºC 高溫培養及加入胎 牛血清)會不會影響芽管生成，故取 rep3/rep3 同型缺陷突變株(CSC106)及 REP3 單套基 因置入補救株(WJC52)進行芽管試驗。本實驗以野生菌株 SC5314 及雙基因突變破壞株

(cph1/cph1 efg1/efg1) HLC54 作為正負對照。將菌落接種於含 10 %胎牛血清之 Brain Heart Infusion 液態培養液中，於 37 ºC 反應三小時進行芽管試驗。圖五的結果顯示在含有胎 牛 血 清 之 狀 況 中 ， 野 生 菌 株 SC5314 、 CSC106 (rep3::ARG4/rep3::URA3) 、 WJC52 (rep3/rep3::REP3) 皆可發現芽管形成，而雙基因突變株 HLC54 則無芽管之形成。由此 結果可知，在本實驗的條件下REP3 基因並不會影響白色念珠菌之形態改變。

◆ REP4 基因相關研究

4.5 利用 β-galactosidase filter assay 確認活化 CDR1 啟動子的 open reading frame (ORF)

本研究先前在azoles 類藥物 miconazole 的誘導下進行 library screening 實驗，篩選 出五個能在啤酒酵母中增加β-galactosidase 活性之基因 (紀錦昇，交大碩士論文，2004)。

其中一個library clone 為 C19。C19 具有兩個 ORFs - orf19.5019 和 orf 19.5020，為了確 認影響 CDR1p-lacZ 活性的為何者，遂利用限制酵素分別加以破壞，之後將所得的建構 物(constructs)轉形至含有 348CDR1p-lacZ 質體之啤酒酵母內，後利用 β-galactosidase filter assay 確認影響 CDR1 啟動子之 open reading frame。

圖六為 β-galactosidase filter assay 的結果。圖六(A)為質體建構示意圖。編號 1 為正 對照組，含CaNDT80，為已知能活化 CDR1p-lacZ 之正向調控基因；編號 2 ~ 4 為 C19(內 含 orf19.5019 和 orf19.5020)；編號 5 和 9 為負對照組，內含空的載體；編號 6 ~ 8 為 c19.5020，只含 orf19.5020 之載體；編號 10 ~ 12 為 orf19.5019，只含 orf19.5019 之載體。

由圖六(B)得知，含有 orf19.5020 質體之轉形株其菌落顏色為藍色，此結果和經 C19 轉 形後所得菌落類似。而orf19.5019 質體轉形後所得菌落顏色為白色，此結果和負對照組 之顏色類似。正對照組，含有 CaNDT80 之轉形株的藍色深度大於 orf19.5020。故，由 此結果可知，orf19.5020 能夠和 CDR1 起動子作用，活化 lacZ 基因的表現，因而造成菌 落具有呈色反應；而orf19.5019 無法和 CDR1 啟動子作用，故無法活化 lacZ 基因表現，

使得菌落不具有呈色能力。綜合以上結果得知，orf19.5020 才是真正能夠和 CDR1 起動 子作用，活化其後報導基因 lacZ 表現之 ORF，故將此 ORF 命名為 REP4，用以代表 Regulator of Efflux Pump 4。

4.6 建構 REP4 基因異型缺陷突變株與同型缺陷突變株

由之前的研究得知，在啤酒酵母 2B/int5314CDR1p-lacZ 中，REP4 基因能夠提高

β-galactosidase 活性約 5.5 倍。後於啤酒酵母中發現，過量表現 REP4 基因時，對於抗真 菌藥物amphotericin B 和 ketoconazole 之敏感性有提高之現象(紀錦昇，交大碩士論文，

2004)。上述研究都是在啤酒酵母中進行，由於 REP4 為白色念珠菌之基因，為了瞭解其 功能，故採用同源重組置換方式(圖七)，利用帶有 REP4 同源片段(5'端和 3'端各 70 個鹼 基對)的特殊引子進行聚合酶連鎖反應，將此同源片段分別連接至篩選標誌 ARG4 和 URA3 兩側，之後將此建構好之聚合酶連鎖反應產物轉形至白色念珠菌 BWP17 以及 BWP17 /tetR-HIS1 中，得到 REP4 基因的異型缺陷突變株與同型缺陷突變株。

4.6.1 建構 REP4 基因異型缺陷突變株

利用引子 HJL495 與 HJL496 進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 ARG4 與 REP4 同源序列的聚合酶連鎖反應片段，將此片段轉形至白色念珠菌 BWP17 與 BWP17/

tetR-HIS1 後分別得到 4 個與 2 個轉形株。接著萃取出轉形株之染色體 DNA，並利用引 子HJL468 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應，如圖八之(A)所示，如果 ARG4 已成功地置 換掉第一個REP4 allele，經過聚合酶連鎖反應後可得兩片段，一為含有篩選標誌 ARG4 之3.7 kb DNA 片段，另一片段為含有另一股 REP4 allele 之 2.6 kb DNA 片段。由圖八之 (B)可知，轉形至 BWP17 與 BWP17/tetR-HIS1 所得到的轉形株皆已成功地置換掉第一個 REP4 allele，且由正對照組結果得知，所有的轉形株內尚存在著另一股 REP4 allele。

4.6.2 建構 REP4 基因同型缺陷突變株

利用引子HJL496 與 HJL497 進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 URA3 與 REP4 同源序列的聚合酶連鎖反應片段，將此片段轉形至白色念珠菌 BWP17 與 BWP17/

tetR-HIS1 後分別得到 2 個與 0 個轉形株。之後再萃取出轉形株之染色體 DNA，並利用 引子HJL133、HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應。如圖九之(A)所示，如果 URA3 已成功地置換掉第二個REP4 allele，利用引子 HJL133 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應，

可得一大小約2.2 kb 之 DNA 片段。另外，同時以引子 HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連 鎖反應，再次確認已置換成功的ARG4 篩選標誌，可得一大小約 1.5 kb 之 DNA 片段。

由圖九之(B)可知，轉形至 BWP17 後所得到的 2 個轉形株皆已成功地置換掉第二個 REP4 allele，且第一個 REP4 allele 確實已成功地被置換成篩選標誌 ARG4。後將兩個 rep4/rep4 同型缺陷突變株分別命名為WJC24 與 WJC31。

4.7 建構四環黴素調控表現系統(Tetracycline-regulatable expression system, TR system ; Nakayama et al., 2000)過度表現 REP4 基因

欲研究一特定基因之功能，除了直接將其破壞，觀察缺少此基因時有無表型之改 變；也可予以過度表現，查看基因表現量是否會影響特定表型之變化。四環黴素調控表 現系統主要是利用一可被doxycycline調控之TR啟動子達成基因調控之目的。此系統有兩 個重要的元素：一為TR啟動子，內含tet O序列；另一則為TR transactivator(tet R)，此為 doxycycline結合之主要部份。在沒有doxycycline之環境下，TR transactivator (Tet R)會與 TR啟動子中的tet O 結合，促使欲研究基因大量表現；但是當生長環境中含有doxycycline 時，doxycycline會和Tet R結合，抑制Tet R與 tet O結合，而使基因不表現，此系統即是 利用此原理達成基因調控。

四環黴素調控表現系統建構法如圖十所示。將一含有目標基因同源序列與TR啟動子 和篩選標誌URA3之DNA片段，轉形至含有目標基因異型缺陷突變株之白色念珠菌內，

利用TR啟動子替換目標基因啟動子，達成調控目標基因之目的。利用上述方式，將含有 TR啟動子之DNA片段轉形至WJC22和WJC23(BWP17/tetR-HIS1/REP4/rep4::ARG4)後，

各得到11個與6個轉形株，隨後分別萃取數個轉形株之染色體DNA，並利用聚合酶連鎖 反應確認是否已成功地置入TR啟動子。如圖十一之(A)所示，如果已成功地將TR啟動子 置入REP4/rep4異型缺陷突變株內，利用引子HJL199及HJL506進行聚合酶連鎖反應後，

可得到約2.1 kb的聚合酶連鎖反應產物。圖十一之(B)顯示，由WJC22及WJC23所得到的 轉形株萃取出之染色體DNA，經過聚合酶連鎖反應後，皆可得到和預期大小相符合的2.1 kb DNA片段。

4.8 建構rep4/rep4::REP4單套基因置入補救株

由於rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 在藥物敏感性試驗(Etest)中的表型 有些許改變(圖十四)，在 fluconazole 作用下，雖然 rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 及 WJC31 和野生菌株 SC5314 相比 MIC 值不變，但是和野生型 SC5314 相比，WJC24 抑

菌圈內菌數較多，看起來較模糊；而 WJC31 抑菌圈內菌數較少，顯得較乾淨。而在

itraconazole 作用下，野生型 SC5314 的 MIC 值約為 0.032 µg/ml，而 WJC24 的 MIC 值 約為0.125 µg/ml，WJC31 的 MIC 值約為 0.023 µg/ml。為了確定此現象之真實性，故將 REP4 單套基因重新置入 WJC24 與 WJC31 中(示意圖參見圖十二)，查看表型之變化能 否回復。方法為將含有 REP4 單套基因和篩選標誌 HIS1 基因之質體 pWJB43 轉形至

rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 內，利用同源重組置換產生單套基因置入 補救株。萃取所得菌落之染色體 DNA，進行聚合酶連鎖反應，確認 REP4 單套基因是 否已成功地置入。圖十三之(A)顯示，若經轉形成功得到含 REP4 單套基因置入，以引 子HJL516 及 HJL507 進行聚合酶連鎖反應後，可在被成功置入含 REP4 單套基因的染 色體上得到大約2 kb 之 DNA 片段。圖十三之(B)是以 1 %洋菜膠分析聚合酶連鎖反應 所得產物。結果顯示，不論WJC24 或 WJC31 所得到的轉形株，均可得到約 2 kb 大小 的 DNA 片段。後將由 WJC24 所得到的 6 株 rep4/rep4::REP4 單套基因置入株命名為 WJC67 至 WJC72，將從 WJC31 所得到的 6 株 rep4/rep4::REP4 單套基因置入株命名為 WJC73 至 WJC78。

4.9 南方墨點法(southern blot analysis)確認正確的rep4/rep4同型缺陷突變株

由於得到的兩個rep4/rep4同型缺陷突變株於藥物敏感性試驗(Etest)中得到的結果不 一致(圖十四)。為了要確定是否已在染色體正確的位置破壞REP4基因，且於同源重組置 換REP4基因時有無其他基因遭受破壞，故採用南方墨點法並設計不同的探針驗證同型 缺陷突變株的正確性。

此次實驗分為兩部分，第一部分主要確認是否已於正確位置破壞REP4基因。探針 設計如圖十五之(A)所示，取出已用限制酵素Xho I 處理之染色體DNA，和大小約740 bp 的探針進行雜合作用，如果探針和包含REP4基因之片段雜合後，可得到一大小約5.5 kb 之訊號；如果探針和包含置換成功ARG4基因之片段雜合後，可得一大小約6.6 kb之訊 號；如果探針和包含置換成功URA3基因之片段雜合後，可得一大小約2.4 kb之訊號。由 圖十五之(B)結果可知，編號1為以聚合酶連鎖反應合成之探針片段，故已用DIG- label 之 探針會與其雜合，此為正對照組。編號2與3分別為野生型SC5314與BWP17，其內之REP4 基因未受破壞，由結果看出只有5.5 kb大小之訊號。編號4與5為兩個REP4/rep4::ARG4 異型缺陷突變株WJC18及WJC21，經由探針雜合後得到兩個DNA片段，分別為6.6 kb與 5.5 kb。編號6與7為兩個rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，經由 探針雜合後得到兩個DNA片段，分別為6.6 kb與2.4 kb。編號8與9為將篩選標誌HIS1基因 分別轉形至編號6與7後所得到的轉形株WJC32與WJC41，如同編號6與7之結果，同樣得 到6.6 kb與2.4 kb之DNA片段。將篩選標誌HIS1基因分別轉形至編號6與7(示意圖見圖二 十六)之目的在於補齊菌株內之營養缺陷(BWP17有3個營養缺陷分別為ARG4^－、 URA3^－ 與HIS1^－，建構同型缺陷突變株時已補進了ARG4^－與URA3^－，故只剩下HIS1^－缺陷)，使

所得菌株不具營養缺陷，便於之後性狀分析(characterization)之判讀與討論。

第二部份主要在於確認進行REP4基因破壞時，有無其他基因同時遭受破壞。此次 於篩選標誌ARG4與URA3上分別設計探針，圖示於圖十六之(A)。取出已用限制酵素Xho

第二部份主要在於確認進行REP4基因破壞時，有無其他基因同時遭受破壞。此次 於篩選標誌ARG4與URA3上分別設計探針，圖示於圖十六之(A)。取出已用限制酵素Xho