建構 REP4 基因同型缺陷突變株

利用引子HJL496 與 HJL497 進行聚合酶連鎖反應，得到含有篩選標誌 URA3 與 REP4 同源序列的聚合酶連鎖反應片段，將此片段轉形至白色念珠菌 BWP17 與 BWP17/

tetR-HIS1 後分別得到 2 個與 0 個轉形株。之後再萃取出轉形株之染色體 DNA，並利用 引子HJL133、HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應。如圖九之(A)所示，如果 URA3 已成功地置換掉第二個REP4 allele，利用引子 HJL133 及 HJL469 進行聚合酶連鎖反應，

可得一大小約2.2 kb 之 DNA 片段。另外，同時以引子 HJL241 及 HJL469 進行聚合酶連 鎖反應，再次確認已置換成功的ARG4 篩選標誌，可得一大小約 1.5 kb 之 DNA 片段。

由圖九之(B)可知，轉形至 BWP17 後所得到的 2 個轉形株皆已成功地置換掉第二個 REP4 allele，且第一個 REP4 allele 確實已成功地被置換成篩選標誌 ARG4。後將兩個 rep4/rep4 同型缺陷突變株分別命名為WJC24 與 WJC31。

4.7 建構四環黴素調控表現系統(Tetracycline-regulatable expression system, TR system ; Nakayama et al., 2000)過度表現 REP4 基因

欲研究一特定基因之功能，除了直接將其破壞，觀察缺少此基因時有無表型之改 變；也可予以過度表現，查看基因表現量是否會影響特定表型之變化。四環黴素調控表 現系統主要是利用一可被doxycycline調控之TR啟動子達成基因調控之目的。此系統有兩 個重要的元素：一為TR啟動子，內含tet O序列；另一則為TR transactivator(tet R)，此為 doxycycline結合之主要部份。在沒有doxycycline之環境下，TR transactivator (Tet R)會與 TR啟動子中的tet O 結合，促使欲研究基因大量表現；但是當生長環境中含有doxycycline 時，doxycycline會和Tet R結合，抑制Tet R與 tet O結合，而使基因不表現，此系統即是 利用此原理達成基因調控。

四環黴素調控表現系統建構法如圖十所示。將一含有目標基因同源序列與TR啟動子 和篩選標誌URA3之DNA片段，轉形至含有目標基因異型缺陷突變株之白色念珠菌內，

利用TR啟動子替換目標基因啟動子，達成調控目標基因之目的。利用上述方式，將含有 TR啟動子之DNA片段轉形至WJC22和WJC23(BWP17/tetR-HIS1/REP4/rep4::ARG4)後，

各得到11個與6個轉形株，隨後分別萃取數個轉形株之染色體DNA，並利用聚合酶連鎖 反應確認是否已成功地置入TR啟動子。如圖十一之(A)所示，如果已成功地將TR啟動子 置入REP4/rep4異型缺陷突變株內，利用引子HJL199及HJL506進行聚合酶連鎖反應後，

可得到約2.1 kb的聚合酶連鎖反應產物。圖十一之(B)顯示，由WJC22及WJC23所得到的 轉形株萃取出之染色體DNA，經過聚合酶連鎖反應後，皆可得到和預期大小相符合的2.1 kb DNA片段。

4.8 建構rep4/rep4::REP4單套基因置入補救株

由於rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 在藥物敏感性試驗(Etest)中的表型 有些許改變(圖十四)，在 fluconazole 作用下，雖然 rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 及 WJC31 和野生菌株 SC5314 相比 MIC 值不變，但是和野生型 SC5314 相比，WJC24 抑

菌圈內菌數較多，看起來較模糊；而 WJC31 抑菌圈內菌數較少，顯得較乾淨。而在

itraconazole 作用下，野生型 SC5314 的 MIC 值約為 0.032 µg/ml，而 WJC24 的 MIC 值 約為0.125 µg/ml，WJC31 的 MIC 值約為 0.023 µg/ml。為了確定此現象之真實性，故將 REP4 單套基因重新置入 WJC24 與 WJC31 中(示意圖參見圖十二)，查看表型之變化能 否回復。方法為將含有 REP4 單套基因和篩選標誌 HIS1 基因之質體 pWJB43 轉形至

rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC24 與 WJC31 內，利用同源重組置換產生單套基因置入 補救株。萃取所得菌落之染色體 DNA，進行聚合酶連鎖反應，確認 REP4 單套基因是 否已成功地置入。圖十三之(A)顯示，若經轉形成功得到含 REP4 單套基因置入，以引 子HJL516 及 HJL507 進行聚合酶連鎖反應後，可在被成功置入含 REP4 單套基因的染 色體上得到大約2 kb 之 DNA 片段。圖十三之(B)是以 1 %洋菜膠分析聚合酶連鎖反應 所得產物。結果顯示，不論WJC24 或 WJC31 所得到的轉形株，均可得到約 2 kb 大小 的 DNA 片段。後將由 WJC24 所得到的 6 株 rep4/rep4::REP4 單套基因置入株命名為 WJC67 至 WJC72，將從 WJC31 所得到的 6 株 rep4/rep4::REP4 單套基因置入株命名為 WJC73 至 WJC78。

4.9 南方墨點法(southern blot analysis)確認正確的rep4/rep4同型缺陷突變株

由於得到的兩個rep4/rep4同型缺陷突變株於藥物敏感性試驗(Etest)中得到的結果不 一致(圖十四)。為了要確定是否已在染色體正確的位置破壞REP4基因，且於同源重組置 換REP4基因時有無其他基因遭受破壞，故採用南方墨點法並設計不同的探針驗證同型 缺陷突變株的正確性。

此次實驗分為兩部分，第一部分主要確認是否已於正確位置破壞REP4基因。探針 設計如圖十五之(A)所示，取出已用限制酵素Xho I 處理之染色體DNA，和大小約740 bp 的探針進行雜合作用，如果探針和包含REP4基因之片段雜合後，可得到一大小約5.5 kb 之訊號；如果探針和包含置換成功ARG4基因之片段雜合後，可得一大小約6.6 kb之訊 號；如果探針和包含置換成功URA3基因之片段雜合後，可得一大小約2.4 kb之訊號。由 圖十五之(B)結果可知，編號1為以聚合酶連鎖反應合成之探針片段，故已用DIG- label 之 探針會與其雜合，此為正對照組。編號2與3分別為野生型SC5314與BWP17，其內之REP4 基因未受破壞，由結果看出只有5.5 kb大小之訊號。編號4與5為兩個REP4/rep4::ARG4 異型缺陷突變株WJC18及WJC21，經由探針雜合後得到兩個DNA片段，分別為6.6 kb與 5.5 kb。編號6與7為兩個rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，經由 探針雜合後得到兩個DNA片段，分別為6.6 kb與2.4 kb。編號8與9為將篩選標誌HIS1基因 分別轉形至編號6與7後所得到的轉形株WJC32與WJC41，如同編號6與7之結果，同樣得 到6.6 kb與2.4 kb之DNA片段。將篩選標誌HIS1基因分別轉形至編號6與7(示意圖見圖二 十六)之目的在於補齊菌株內之營養缺陷(BWP17有3個營養缺陷分別為ARG4^－、 URA3^－ 與HIS1^－，建構同型缺陷突變株時已補進了ARG4^－與URA3^－，故只剩下HIS1^－缺陷)，使

所得菌株不具營養缺陷，便於之後性狀分析(characterization)之判讀與討論。

第二部份主要在於確認進行REP4基因破壞時，有無其他基因同時遭受破壞。此次 於篩選標誌ARG4與URA3上分別設計探針，圖示於圖十六之(A)。取出已用限制酵素Xho I 處理之染色體DNA，分別和探針1(probe1)與探針2(probe2)進行雜合作用，如果探針1 和包含置換成功ARG4基因之片段雜合後，可得一大小約6.6 kb之訊號；如果探針2和包 含置換成功URA3基因之片段雜合後，可得一大小約2.4 kb之訊號。由圖十六之(B)結果可 知，編號1至6皆可看到6.6 kb之訊號(圖右側下方箭頭所指處)，而編號1至7於6.6 kb片段 上可見另一訊號形成(圖右側上方箭頭所指處)。圖十五之(C)結果得知，編號1至4皆可看 到2.4 kb之訊號，而編號5至7偵測不到任何訊號，因此推論並無其他基因同時遭受破壞。

4.10 性狀分析(Phenotypic characterization)

4.10.1 rep4/rep4同型缺陷突變株與REP4基因過度表現株藥物敏感性試驗(Etest)結果 藥物敏感性試驗(Etest)為將特定菌株均勻塗布至特定培養基上(此實驗採用SD培養 基) ， 後 放 上 5 個 不 同 的 藥 物 試 片 ， 本 實 驗 採 用 4 種 azoles 類 藥 物 - fluconazole 、 ketoconazole、itraconazole和voriconazole與polyene類藥物amphotericin B，主要目的在於 測試特定菌株對於不同藥物之敏感性。

如圖十七之結果可知，對於受試藥物amphotericin B而言，所有菌株(包含野生型 SC5314)的MIC值皆為0.38 µg/ml。而所有菌株(包含野生型SC5314)對於ketoconazole的敏 感性極低，沒有明顯的抑制現象。在抗真菌藥物fluconazole與voriconazole作用下，雖然 rep4/rep4同型缺陷突變株WJC32與WJC41與REP4單套基因置入補救株WJC67與WJC73 和野生型SC5314相比，其MIC值沒有改變(fluconazole MIC值約為0.75 ~ 1.0 µg/ml；

voriconazole MIC值約為0.016 µg/ml)，但WJC32抑菌圈內菌數較野生型SC5314多而 WJC41抑菌圈內菌數較野生型SC5314少；而WJC67抑菌圈內菌數看起來較WJC32少，

WJC73抑菌圈內菌數較WJC41多。WJC44與WJC48在fluconazole的作用下，MIC值約為 1.5 µg/ml；而在voriconazole的作用下MIC值約為0.023 µg/ml；在itraconazole作用下，野 生型SC5314、WJC41、WJC67與WJC73的MIC值約為0.032 µg/ml；WJC32的MIC值約為 0.125 µg/ml；在沒有doxycycline作用下，也就是REP4基因大量表現時，WJC44與WJC48 的MIC值約為0.064 µg/ml。

4.10.2 rep4/rep4同型缺陷突變株與REP4基因過度表現株agar dilution assay之結果

本研究先前進行的 library screening 實驗，是於 azoles 類藥物 miconazole 的誘導 下，篩選出五個能在啤酒酵母中增加β-galactosidase 活性之基因(紀錦昇，交大碩士論文，

2004)。為了了解 rep4/rep4 同型缺陷突變株與 REP4 基因過度表現株對於 miconazole 之 敏感性是否具有差異現象，又因尚未具有miconazole 這一類的藥物試片可供抗真菌藥物 試驗(Etest)利用，故改採 agar dilution assay，並於不同濃度之 miconazole 作用下觀察菌 株的藥物敏感性現象。

由圖十八之結果得知，在miconazole濃度為1 µg/ml到5 µg/ml之狀況下，和野生菌株 SC5314相比(編號2)，rep4/rep4(WJC32，編號3) 、rep4/rep4::REP4(WJC67，編號4) 、 rep4/rep4(WJC41，編號5)以及rep4/rep4::REP4(WJC73，編號6)的菌株對於miconazole的 敏感性大致相同，都具有稍微提高之現象(菌落生長的較弱)，只是此現象並沒有很明顯；

而在含有4 %胎牛血清之培養基中，此現象便消失了。在miconazole濃度為1 µg/ml到5 µg/ml之狀況下，編號7的REP4基因過度表現株WJC44對於miconazole的敏感性比標號2 的野生型SC5314高，且此種對miconazole敏感性提高之現象也較編號3 ~ 6的菌株明顯。

而在含有4 %胎牛血清之培養基中仍可觀察到如同未加胎牛血清般相同的趨勢。

4.10.3 REP4基因破壞與過度表現時皆不會影響芽管生成

為了要了解REP4 基因破壞以及過度表現後，在誘發菌絲生長之環境中(37 ºC 高溫 培養及加入胎牛血清)是否會影響芽管生成，故取 rep4/rep4 同型缺陷突變株 WJC32、

WJC41 與 REP4 單套基因置入補救株 WJC67 與 WJC73；REP4 基因過度表現株 WJC44 進行芽管試驗。本實驗以野生菌株 SC5314 及雙基因突變破壞株(cph1/cph1 efg1/efg1) HLC54 作為正負對照。將菌落接種於含 10 %胎牛血清之 Brain Heart Infusion 液態培養

液中，於37 ºC 反應三小時，進行芽管試驗。圖十九的結果顯示，在含有胎牛血清之狀

況下，野生菌株SC5314、WJC32、WJC41、REP4 單套基因置入株 WJC67 與 WJC73、

REP4 基因過度表現株 WJC44 皆可發現芽管形成，而雙基因突變株 HLC54 則無芽管之

REP4 基因過度表現株 WJC44 皆可發現芽管形成，而雙基因突變株 HLC54 則無芽管之