REP5 基因不會影響芽管生成

為了得知 REP5 基因是否與白色念珠菌型態轉換有關，故於誘發菌絲生長之環境中 (37 ºC 高溫培養及加入胎牛血清)觀察其芽管生成狀況。本實驗以構築好已含 TR 啟動子 之REP5 菌株 WJC58 及 WJC63 進行芽管試驗，並選用野生菌株 SC5314 及雙基因突變 破壞株( cph1/cph1 efg1/efg1) HLC54 作為正負對照。將菌落接種於含 10 %胎牛血清之 Brain Heart Infusion 液態培養液中，並以 doxycycline(20 µg/ml) 抑制 REP5 基因在 Tet R 調控株 WJC58 和 WJC63 的表現模式，於 37 ºC 反應三小時後觀察芽管形成現象。圖二 十四的結果顯示，不論有無doxycycline 作用，野生菌株 SC5314、WJC58 與 WJC63(Tet R 調控株)皆可發現芽管形成，而雙基因突變株 HLC54 則無芽管之形成。由此結果可知，

在本實驗的條件下，REP5 基因並不會影響白色念珠菌之形態變化。

五、討論

5.1 REP3 基因會影響白色念珠菌對於抗真菌藥物 azoles 類的藥物敏感性，但不影響其形 態之轉變

REP3基因位於白色念珠菌的contig19-10194中，ORF號碼為19.3928。Rep3p具有380 個胺基酸，大小約41.8 kDa的蛋白質。Rep3p含有六個C2H2形式的鋅指狀區域(zinc finger domain)，和人類的鋅指狀蛋白2 (zinc finger protein2，humam ZNF2)具有微弱之相似性，

Znf2p的功能為轉錄抑制者(transcription repressor)。在許多高等和低等真核生物中，C2H2 鋅指狀蛋白組成了含量豐富的核酸結合蛋白(nucleic acid-binding proteins)。C2H2鋅指狀 結構於生物體扮演的功能非常廣泛，可從和DNA或RNA結合到牽涉蛋白質與蛋白質間的 交互作用。已知C2H2鋅指狀區域為轉錄因子(transcriptional factor)之特性，利用2個具有 保留性的胺基酸cysteine和histidine與鋅離子(zinc ion)作用，達成基因調控之目的。在已 知的相關白色念珠菌基因中，CaNrg1p，為含有2個C2H2型式之鋅指狀蛋白，已知會和 含 有Nrg1 response element(NRE) 序 列 (A/C)(A/C/G)C3T 之 啟 動 子 的 基 因 結 合 ( 如 CaHWP1)。於白色念珠菌中，CaNrg1p主要功能為轉錄抑制者，抑制yeast-hypha型態 (morphogenesis)轉換和hypha專一性(hypha-specific)基因的表現(Murad et al., 2001)。另一 個基因則為Tac1p，為含有Zn(2)-Cys(6) motif 的轉錄因子，實驗證明TAC1基因會影響白 色珠菌的藥物感受性且為CDR1的異位調控因子(Coste et al., 2004)。

5.2 REP3 基因對於抗真菌藥物 azoles 類的藥物敏感性結果

以同源重組置換方式將白色念珠菌 REP3 基因破壞後，於藥物敏感性試驗(Etest) 中發現，和野生型SC5314(REP3/REP3)相比，rep3/rep3 同型缺陷突變株(CSC106、109、

111)對於 azoles 類藥物 - fluconazole、itraconazole 和 voriconazole 的敏感性具有提高現 象(雖然 MIC 值沒有明顯的改變，但是抑菌圈內菌落較少，顯得較透明乾淨)(紀錦昇，

交大碩士論文，2004)；而將 REP3 單套基因重新置入 rep3/rep3 同型缺陷突變株後發現，

rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株(WJC52、53、56)，對於 fluconazole 和 voriconazole 的敏感性有回復現象(本論文圖三之一與三之二) (和 rep3/rep3 同型缺陷突變株相比，MIC 值不變，但抑菌圈內菌數較多，呈現模糊不透明狀)，但仍不及野生型 SC5314。而在 itraconazole 的作用下，無法清楚於 rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株中觀察到敏感

性回復。又，以library screening 時所選用的篩選藥物 miconazole 進行 agar dilution assay 時發現(圖四)，rep3/rep3 同型缺陷突變株(CSC106)在菌落數為 10³ cells 時，已有明顯的 被抑制現象；而rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株(WJC52)在菌落數為 10³ cells 時，

尚未出現明顯的抑制現象，但在菌落數為10² cells 時，便可觀察到抑制現象。反觀野生 型SC5314，直到菌落數為 10¹ cells 時才有抑制現象的產生(圖四)。

綜合上述結果發現，rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株對於 fluconazole、

voriconazole 以及 miconazole 的敏感性回復現象介於野生型 SC5314 和 rep3/rep3 同型缺 陷突變株間，推論可能的原因有：(1)dosage effect 現象(Kohler & Fink, 1996)，REP3/REP3

＞rep3/rep3::REP3＞rep3/rep3，隨著野生型 REP3 copy 數增加，藥物敏感性回復現象也 隨之明顯。(2)由於 REP3 單套基因置入補救實驗(見圖一)是將一含有篩選標誌 HIS1 基因 與REP3 基因的質體放回 rep3/rep3 同型缺陷突變株內，雖然基因放回正確的位置(與上 下游基因的相對位置不變)，但是多插入了一段外來質體 DNA 序列，此多餘序列可能造 成REP3 基因表現受到妨礙，故無法具有和野生型 SC5314(REP3/REP3)一致的藥物敏感 性結果。(3) Heterozygosity Effect:白色念珠菌中的兩個 REP3 allele 可能具有不同的表現 程度。因此，如果我們以表現程度較弱的REP3 allele 補救表現程度較強的 REP3 allele 時，所得到的rep3/rep3::REP3 單套基因置入補救株中的 REP3 基因表現量自然會有減弱 趨勢發生。

Azoles 類 藥 物 主 要 和 ergosterol 生 合 成 途 徑 中 的 C14α-demethylase 作 用 ， 導 致

14α-methylsterols(例如lanosterol和14α-methyl-3-6-diol)大量累積，干擾細胞膜主要成分 ergosterol合成與其功能，藉此達成抑制白色念珠菌之目的(Kelly et al., 1997)。已知Cdr1p 與fluconazole 、 ketoconazole 、 itraconazole 和 miconazole 之 輸 出 有 關 (Nakamura et al., 2001)，又cdr1/cdr1同型缺陷突變株(DSY448)對於fluconazole、 ketoconazole和itraconazole 具有較高之敏感性(hypersensitivity)(Sanglard et al., 1996)。此外，REP3基因在啤酒酵母 中過量表現時，可增加CDR1p-lacZ活性大約四倍(紀錦昇，交大碩士論文，2004)。綜合 以上結果推論，rep3/rep3同型缺陷突變株，可能是藉由降低排藥幫浦CDR1之表現量，

而提高白色念珠菌對於azoles類藥物之敏感性。

5.3 REP3 基因不會影響白色念珠菌之型態變化

本實驗室於 2005 年文獻：Efg1 Involved in Drug Resistance by Regulating the Expression of ERG3 in Candida albicans (Lo et al., 2005)公佈發現致病性(virulence)和抗藥

性(drug resistance)途徑彼此相連的論點。在此研究中明白指出和致病性相關的 EFG1基 因可藉由負向調控白色念珠菌 ergosterol 生合成途徑 ERG3 基因，同時參與藥物抵抗性 之途徑。由於此概念之影響(致病性和抗藥性途徑是可以連結的)，使得我們在研究 REP3

基因和抗藥性之間的關係時，也想同時觀察REP3 基因是否會影響白色念珠菌型態之改

變。由圖五的結果可知，野生型 SC5314(REP3/REP3)和 rep3/rep3 同型缺陷突變株 (CSC106)在 37 ºC，10 %胎牛血清誘導下皆有芽管形成，故可推論 REP3 基因和白色念 珠菌的型態改變沒有直接關係。綜合所有結論可知：REP3 基因會影響白色念珠菌對於 azoles 類抗真菌藥物的敏感性，但在此實驗條件下，不影響其形態之轉變。

5.4 REP4 基因功能探討

REP4 基因位於白色念珠菌的 contig19-10216，ORF 號碼為 19.5020。Rep4p 可產生 具有340 個胺基酸，大小約 37.4 kDa 的蛋白質。於已知的資料庫(database)中無法找出和 REP4 基因具有明顯相似性的相似者(homologues)。此蛋白質具有 2 個 AT-hook motif，而 AT-hook motif 會利用 9 個具保留性的胺基酸與 DNA 的 minor groove 結合(Reeves &

Nissen, 1990; Aravind & Landsman, 1998)。在許多含有此 motif 的蛋白質當中發現，他們 藉由扮演附屬因子(accessory factors)的角色，而影響轉錄因子和 chromatin 的結合，進而 達到調控轉錄過程的目的(Thanos & Maniatis, 1992; Strick & Laemmli, 1995)。已有實驗證 實，含有AT-hook motif 的蛋白質 HMG-I(Y)，對於穩定 chromatin 結構扮演非常重要的 角色，且其作用為轉錄因子之共同輔因子(transcription factor cofactors)(Onate et al., 1994;

Falvo et al., 1995; Girard et al., 1998)。而同樣具有 2 個 AT-hook motif 的 REP4 基因，於 白色念珠菌中所扮演的角色為何，我們仍不清楚。

5.5 rep4/rep4 同型缺陷突變株的藥物敏感性結果

以所得到的rep4/rep4同型缺陷突變株(WJC24與WJC31)進行藥物敏感性試驗(Etest)後 發現(圖十四)，在fluconazole和itraconazole的作用下，和野生型SC5314(REP4/REP4)相 比，雖然MIC值沒有明顯的改變，但是rep4/rep4同型缺陷突變株WJC24抑菌圈內菌數較 多，也因而顯得較模糊不透明；而和野生型SC5314(REP4/REP4)相比，rep4/rep4同型缺 陷突變株WJC31抑菌圈內菌數較少，顯得較乾淨透明。後於amphotericin B作用下發現，

雖 然rep4/rep4 同 型 缺 陷 突 變 株 WJC24 與 WJC31 與 野 生 型 SC5314 的 MIC 值 相 同 (0.38 µg/ml)，但是在rep4/rep4同型缺陷突變株WJC24與WJC31的抑菌圈外發現多了一圈型態

較小的菌落產生，而此為野生型SC5314所沒有的。先前實驗室發現，造成此現象的原因 可能是由於菌株缺少了HIS1基因(WJC24與WJC31均有HIS1缺陷)，故將HIS1基因重新轉 形至rep4/rep4同型缺陷突變株WJC24與WJC31內，後將得到的HIS⁺ rep4/rep4同型缺陷突 變株分別命名為WJC32(由WJC24而來)與WJC41(由WJC31而來)。

以WJC32與WJC41再次進行藥物敏感性試驗(Etest)後發現(圖十四)，先前得到的 amphotericin B敏感性差異具有回復現象，野生型SC5314、WJC32與WJC41的MIC值仍 為0.38 µg/ml，但在WJC32與WJC41的抑菌圈外並無一圈型態較小的菌落產生。由於HIS⁺ 轉形株對於其他藥物的敏感性並沒有明顯差異，故可推論HIS1基因可能與amphotericin B 的敏感性有關，缺少此基因時會影響amphotericin B的判讀，故進行特定基因的藥物敏感 性試驗(Etest)前，必須先確定試驗菌株是否有HIS1缺陷，才不會誤判結果。

由於rep4/rep4同型缺陷突變株WJC24與WJC31於藥物敏感性(Etest)試驗中的結果不 一致，為了確定哪一株為正確的rep4/rep4同型缺陷突變株，遂進行了南方墨點法實驗。

又，想確認此敏感性的改變的確是由於REP4基因所造成，而不是其他因素，故以REP4 單套基因補救實驗來驗證結果。

5.6 南方墨點法確認正確的rep4/rep4同型缺陷突變株

由於得到的兩株rep4/rep4同型缺陷突變株WJC24與WJC31於藥物敏感性試驗(Etest) 結果不一致(圖十四)，為了確認何者為正確的rep4/rep4同型缺陷突變株，遂以南方墨點 法並利用兩組不同的探針驗證結果。圖十五之結果可知，以設計於REP4基因ORF外的探 針進行雜合反應後，皆可得到預期的片段產生：SC5314、 BWP17(含有REP4/REP4)，

得到5.5 kb的片段；REP4/rep4::ARG4異型缺陷突變株WJC18與WJC21，得到兩個片段分 別為5.5 kb與6.6 kb；rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，和將HIS1 基因補回同型缺陷突變株後所得到的HIS⁺同型缺陷突變株WJC32與WJC41，皆得到符合 預期之2.4 kb與6.6 kb片段。但在6.6 kb片段以上有其他的訊號產生，推測可能是以限制 酵素XhoI切割實驗所需之染色體DNA時(圖十五編號2~9)，沒有完全切割乾淨(incomplete digestion)所造成的背景值。從此次實驗結果得知，已於正確位置的染色體DNA上置換 REP4基因。

為了想確認進行REP4基因同源重組置換時，有無其他基因遭到破壞(即進行同源重 組置換所用的DNA片段是否插入到染色體DNA的其他位置)，故將探針分別設計於篩選 標誌ARG4(probe1)與URA3(probe2)上，希望藉此釐清問題所在。由圖十六之(B)結果可

知，以探針1(probe1)進行南方墨點法後，於菌株BWP17、REP4/rep4::ARG4異型缺陷突 變株WJC18與WJC21、rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，和將 HIS1基因補回同型缺陷突變株所得到的HIS⁺同型缺陷突變株WJC32與WJC41，皆可得到 預期的6.6 kb片段。但是在圖右側上方箭頭所指處，多了一個非預期的訊號產生，推測 可能是於染色體DNA中，存在著與探針1序列相似的DNA片段，造成此背景值出現。圖 十 六 之(C) ， 以 探 針 2(probe2) 進 行 南 方 墨 點 法 所 得 到 的 結 果 顯 示 ， 只 有 rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，和將HIS1基因補回同型缺陷突 變株所得到的HIS⁺同型缺陷突變株WJC32與WJC41有預期的2.4 kb訊號產生，而BWP17

知，以探針1(probe1)進行南方墨點法後，於菌株BWP17、REP4/rep4::ARG4異型缺陷突 變株WJC18與WJC21、rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，和將 HIS1基因補回同型缺陷突變株所得到的HIS⁺同型缺陷突變株WJC32與WJC41，皆可得到 預期的6.6 kb片段。但是在圖右側上方箭頭所指處，多了一個非預期的訊號產生，推測 可能是於染色體DNA中，存在著與探針1序列相似的DNA片段，造成此背景值出現。圖 十 六 之(C) ， 以 探 針 2(probe2) 進 行 南 方 墨 點 法 所 得 到 的 結 果 顯 示 ， 只 有 rep4::ARG4/rep4::URA3同型缺陷突變株WJC24與WJC31，和將HIS1基因補回同型缺陷突 變株所得到的HIS⁺同型缺陷突變株WJC32與WJC41有預期的2.4 kb訊號產生，而BWP17