對人類白血球及微膠細胞之抗發炎作用

人類白血球為專一抗發炎細胞實驗模式，可有效篩選出具研究開發潛力之中草藥。

在抗發炎作用實驗中，本研究以吳茱萸萃取物與其四種活性成分為樣品；先檢測這些藥 物對人類嗜中性白血球之自由基是否有抑制作用，接着檢驗他們是否抑制中樞發炎細胞 (微膠細胞)之自由基，研究發現吳茱萸萃取物與其四種活性成分均可抑制活化的人類嗜 中性白血球之 ROS 產生(圖 23)，吳茱萸萃取物與 Syn 均強力抑制 Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) 與 N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) 誘導之 ROS 產生，

兩者 IC₅₀接近(表 20)，推測吳茱萸萃取物抗發炎的活性，可能與 Syn 成分的含量有關。

白血球之 NADPH oxidase 是一種酵素，當活化時會製造許多自由基，DPI 可以抑制此酵 素，實驗結果發現 DPI 50uM 時可抑制 NADPH 氧化酶活性大於 80%，吳茱萸萃取物 50

g/mL 時可抑制 NADPH 氧化酶活性約 40%，其它四種活性成分對此酵素活性抑制作用 小於 20%(圖 24)，由於吳茱萸萃取物對白血球的細胞 ROS 抑制作用強，但對酵素 NADPH 氧化酶作用弱，推測吳茱萸萃取物可能抑制發炎訊息傳導作用(圖 25)。例如:細胞內鈣離 子增加(fMLP)，或是蛋白激酶 C(PKC)的活化(PMA)。吳茱萸萃取物對 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 清除作用約為 Trolox 的 25%，比其四種活性成分的清除作用強。

lipopolysaccharide (LPS)會刺激神經微膠細胞(BV2)，產生 20 µM 的 NO (圖 26) ，本研 究發現對此 NO 抑制的強弱，以吳茱萸萃取物最強，其次是 Evo﹥DeHE﹥Rut，Syn 則 無效。以一種 NOS 抑制劑 L-NAME(20 µM)當對照藥品，吳茱萸萃取物顯然比 L-NAME 強。LPS 會誘導 iNOS 蛋白質之表現，本研究證明吳茱萸萃取物對 iNOS 的表現比其 3 種活性成分強，在 3 種活性成分中 Evo、DeHE 及 Rut 皆為可抑制 iNOS 產生，效價為 Evo﹥DeHE﹥Rut (圖 27)。

表 20 吳茱萸乙醇萃取物與其四種活性成分在人類嗜中性白血球中抑制 PMA 與 fMLP 誘導之 ROS 產生之 IC₅₀的比較表。

Drugs IC50in PMA-induced IC50in fMLP-induced Exr 2.7±0.3* (μg/ml) 3.3±1.0 (μg/ml)

DeHE 22.4±2.2 (μM) ND

Evo ND ND

Rut ND ND

Syn 4.1±0.5* (μM) 3.5±1.4 (μM) DPI 1.6±0.8* (μM) 0.5±0.1 (μM) Apocynin 53.3±3.5* (μM) 4.4±0.7 (μM)

Note：PMA- Phorbol-12-myristate-13-acetate

fMLP- N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine DPI- diphenylene iodonium

ROS- reactive oxygen species

Apocynin- an inhibitor of NADPH-oxidase

* p<0.05.

Drug concentration (M or g/ml)

Drug concentration (M or g/ml)

1 10 100

Note：I- DeHE, II- Evo, III- Rut, IV- Syn,

Exr- ethanol extract of Evodia Rutaecarpa.

Drug concentration (M or g/ml)

Note：I- DeHE, II- Evo, III- Rut, IV- Syn, Exr- ethanol extract of Evodia Rutaecarpa.

DPI- diphenylene iodonium; * p<0.05.

DPPHradical-scavengingcapacity ODunits/30min)

Note：I- DeHE, II- Evo, III- Rut, IV- Syn, Exr- ethanol extract of Evodia Rutaecarpa.

DPPH：1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl；Trolox：The antioxidant.

* p<0.05.

NO(M)

Note：I- DeHE, II- Evo, III- Rut, IV- Syn, Exr- ethanol extract of Evodia Rutaecarpa.

LPS:lipopolysaccharide.; L-NAME:N^G-nitro-L-arginine methyl ester

* p<0.05.

Note：I- DeHE, II- Evo, III- Rut, IV- Syn, Exr- ethanol extract of Evodia Rutaecarpa.

LPS:lipopolysaccharide.;

本研究結果顯示吳茱萸萃取物只有抗氧化及抑制 NO 產生之能力，所以合理解釋吳 茱萸本身具抗發炎之作用。而本研究證明吳茱萸萃取物的抗發炎作用可歸功於它的四種 活性成分，分別可以抑制發炎細胞之 NADPH 氧化酶所製造的 ROS 以及 iNOS 所製造的 NO。由於吳茱萸萃取物及其活性成分對活細胞的抑制作用，強於對酵素(NADPH 氧化酶) 的直接抑制作用，很可能是藥物作用於訊息傳導層次。例如:fMLP 所誘發的細胞內鈣增 加及 PMA 所活化的蛋白激酶 C，皆可能是藥物之標的。

本部分實驗再一次的證實，吳茱萸甲醇萃取物之不同抗發炎作用指標，均高於所含 化學成分 Syn、DeHE、Evo 及 Rut。這可能是萃取物之作用為不同成分之相互作用，甚 至是四種成分以外的其他成分也參與了重要角色所致。