對人類白血球及微膠細胞之抗發炎作用 1、實驗藥材、藥品：

NaCl、KCl、KH2PO4、NH4Cl、KHCO3、NaHCO3、Na2HPO4^、EDTA、Giemsa 溶液、

luminol、postassium phosphate、Glycerol 、bromophenol blue、dextran、HBSS、

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)、NADPH、Tris、Bis-Acrylamide、TEMED、

APS、Ficoll 溶液 (Histopaque 1077)，皆購自 Sigma。

DMSO、PMA、fMLP、SDS、2-mercaptoethanol、lucigenin、sodium azide，皆購自 Merck。

青黴素、鏈黴素，皆購自 Gibco。

Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM )、 L-glutamine 皆 購 自 Biological Industries。

Heparin (Leo, Deamerk)。

FBS (HyClone)。

protease inhibitor cocktail (Roche)。

enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Biosciences, USA)。

蛋白質初級抗體 (goat anti-iNOS, BD Bioscience Pharmingen, USA)。

PVDF 膜 (Millipore)。

脫脂奶粉 (安佳)。

X 光片 (Kodak, USA) 。

細胞培養盤、培養皿、96-well plate，皆購自 BD. Falcon。

２、儀器設備：

流式細胞儀 (Flow cytometer, FACSCalibur, Becton Dickinson, USA)。

冷光偵測機 (Microplate Luminometer, Orion^TM, Germany)。

密度偵測機 (Densitometer, SHARP, JX-330, USA)。

96 孔微盤偵測計錄器 (ELISA reader, PowerWave XS, USA)。

蛋白質垂直電泳 (Mighty small II, Amersham Pharmacia® , USA)。

半乾式水平電轉移器 (Hoefer TE70, Amershan Pharmacia®, USA)。

超音波 (Branson-3210, USA)。二氧化碳之恆溫培養箱 (Binder, USA)。

3、藥物之準備

吳茱萸樣品溶於 dimethyl sulfoxide (DMSO)溶液，儲存濃度為 10 mM 再以滅菌之 PBS 製成 1-100 μM 等不同的濃度備用。

4、人類白血球之製備

採集人類靜脈血液，以肝素 (20 unit/ml) 當抗凝血劑，離心後加入低張溶液，室溫 中靜置 20-30 分鐘，待大部分紅血球沉降後，小心收集上層富含白血球之血漿

(leukocyte-rich plasma)，以 PBS 重新懸浮。把此細胞懸浮液輕輕注入裝有 Ficoll 溶液上 層， 注意此二層溶液不能稍有混雜。再於 20℃，400g 連續離心 40 分鐘，去除上層所

有液體，所留下之細胞沉澱物便是嗜中性白血球。打散細胞沉澱物，以 10 ml 冷的紅血 球溶解緩衝液 (155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA, pH 值為 7.4) 完全漲碎 殘留紅血球，再於 20℃，120g 離心 10 分鐘，所得細胞沉澱物以 PBS 清洗二次，最後 取 1-2 萬顆細胞用細胞離心製片機打片，經 Giemsa 溶液染色，在顯微鏡下觀察或以流式 細胞儀檢驗，一般幾乎完全是多核的嗜中性球，純度一般大於 95%。經製備好之嗜中性 球最後懸浮於 HBSS 或 PBS 溶液中備用。

5、白血球活性氧屬 (ROS)產生量的測量

加入 10 µl 待測藥物 (1-100 µM)於 96-well plate 中，加入 50 µl 白血球 (1x10⁷/ml)，

室溫混合 15 分鐘後加 50 µl lucigenin 或 luminol，混合 10 分鐘後加 50 µl

phorbol-12-myristate- 13-acetate（PMA）或 N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine（fMLP）

於冷光偵測機測冷光值 10-30 分鐘。

6、人類白血球細胞質及細胞膜萃取物之製備及 NADPH oxidase (NOX) 活性測試 細胞數目 1X10⁷/ml 以冰冷 PBS 清洗二次後，改懸浮於細胞溶解緩衝液，經超音波

中等強度(30％ power)震盪 10 秒間隔以冰浴一分鐘共五次，1000g，4℃ 離心 10 分鐘；

取上清液經測定蛋白質濃度後分裝置於–70℃以備用。加 10 µl 待測藥物 (1-100 µM)於 96-well plate 中，加 50 µl(200 μg) 上述之上清液，室溫混合 15 分鐘後加 50 µl lucigenin 混合 10 分鐘加後 50 µl (1.6 mM) NADPH 於冷光偵測機測冷光值，30 分鐘求其不同藥物 濃度下之曲線下面積以計算抑制百分比或 IC50。

7、 DPPH 自由基之清除能力

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)加入乙醇溶解成 0.2 mM。測試藥物(1-100 μM) 與 DPPH 溶液混合避光反應 40 分鐘，測光譜 517 (OD₅₁₇nm)吸收之減低量(紫色溶液 褪色情形)，利用藥物不同濃度求其抑制百分比或 IC50。

8、微膠細胞株 BV-2 之培養及亞硝酸根 ( nitrite；NO2

-) 濃度之測定

BV-2 培養於 Dulbecco’smodified Eaglemedium (DMEM) 中添加 5% 去活化 FBS (HyClone Cat. No. A-1115-L Bottle 11152221g)，最後濃度 100 IU/ml 青黴素和 100g/ml 鏈黴素、2 mM L-glutamine。細胞以直徑 100 mm 之細胞培養盤培養於 37℃潮溼之環境 5％ 二氧化碳之恆溫培養箱。BV2 之生長倍增時間 (doubling time) 為十九小時，當細胞 生長約達 80 %的密度時，以 pipetaid 溫和地以 37℃ 之 PBS 溶液將細胞沖下，種到 96 孔盤，以備實驗用或分置於新的培養皿繼續培養。

9、亞硝酸根 ( nitrite；NO2

-) 濃度之測定

將細胞之培養液取 100 µl 轉換至 96 孔之尖底盤以 250×g 離心十分鐘，然後取 80 µl 之細胞培養上清液轉注於新的 96 孔盤再與等體積之 Griess 試劑 (GriessI 與 GriessII 試 劑 1:1 混合) 完整充分混合，於室溫反應十分鐘以 microplate reader 於 550 nm 波長測定 吸光值之後將吸光值以不同濃度的亞硝酸鈉作成之標準曲線換算得到亞硝酸根的濃度。

10、西方點墨蛋白質電泳分析 (Western blotting)

取等量之細胞萃取液，加入等體積之 SDS sample buffer，以 SDS-PAGE 膠體電泳，

進行電泳分離。待完成後將凝膠裝置在半乾式水平電轉移器中，以電轉移緩衝液，將膠 體內之蛋白質轉漬到 PVDF 膜上。轉漬後之膜先以含 5% 脫脂奶粉之 TBS (tris buffered saline) 緩衝溶液於室溫下 blocking 一小時之後，換到含有欲偵測之蛋白質初級抗體 (1:200)與 4% 脫脂奶粉之 TBS 緩衝溶液中，於室溫下振盪培養 2 小時。PVDF 膜以 TBS 緩衝溶液清洗三次，每次 10 分鐘，然後再換至含有 horseradish peroxidase 結合 (HRP conjugated) 之次級抗體 (sheep anti-goat, Amersham) (使用稀釋倍數為 1:2000) 及含 4%

脫脂奶粉之 TBS 緩衝溶液中，於室溫下振盪培養 1 小時 PVDF 膜上帶有次級抗體的蛋 白質經 TBS 緩衝溶液清洗 3 次後，以 ECL (enhanced chemiluminescence, Amersham)系 統反應，使用 X 光片進行自動冷光顯影，再以光學密度偵測機 (densitometer)做蛋白質 影像相對定量。