對氧化鯊烯環化酵素進行定點飽和突變

過去近半世紀以來，氧化鯊烯環化酵素一直是科學家十分感興趣 的研究課題，因其在固醇類生合成途徑中扮演著重要的角色，且在生 理及演化上也有一定的重要性，因此對於此酵素的環化機制與其胺基 酸基團所具備的功能，值得做更深入的瞭解。在研究蛋白質結構與功 能的領域中通常會利用核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance，

NMR）及蛋白質 X-ray 單晶繞射（Protein X-ray Crystallography，X-ray diffraction）來解出蛋白質結構。但上述兩種方法皆有所限制，核磁

假設活性胺基酸進行了許多突變實驗。利用突變對蛋白質進行研究已 經是蛋白質工程及分子生物技術中很常被應用的方法，而最常見的為 定點突變與隨機突變，定點突變通常是針對某個位置的胺基酸進行取 代、刪除或嵌入，用以探討某個重要區段上特定胺基酸序列所執行的 功能；而隨機突變是對蛋白質上的胺基酸序列不預設位置地進行突變，

通常並不會知道被突變的位置，且突變的量之大而需先建構成一個突 變株庫（library），再設計篩選方式從中挑選出所要的突變株。本實 驗則是利用定點突變的方式對於酵母菌 ERG7進行結構、功能以及機 制上的探討。

在實驗室先前的研究中，我們對酵母菌 ERG7位於活性區域中重 要位置的 F699，以及鄰近 F699的 I705，進行定點飽和突變及其功 能性的產物分析，因而得到了在 C-17cation位置脫氫的新產物，由 F699 的 突 變 產 物 中 分 離 出 protosta-13(17),24-dien-3β-ol 和 protosta-17(20),24-dien-3β-ol^29,30 ， I705 的 突 變 產 物 中 則 分 離 出 protosta-16,24-dien-3β-ol⁶⁴《圖1-23》。這些產物的取得意謂著對這兩個 位置做突變會影響環化反應的進行甚至是中間產物的立體化學結構，

環化反應具有極其重要的關鍵性且令人想更深入探討。 式可以看出在活性區域中 C-17 cation位置附近的胺基酸《圖1-24》，

如前章節所述，F699對於穩定 C-17 cation扮演重要的角色，而 H234 除了能穩定 C-14 cation，對於環化機制的最終步驟脫氫反應也是不 可或缺的重要胺基酸。另外從蛋白質結構可以看出，C-17 cation位在 環狀區域（loop regions）的一個轉彎處，而此轉彎處是由 G383和 T384組成。

的部分，Tyr 是高度保留在生成植物環阿屯醇的環化酵素 CAS 中，而 Thr 則是高度保留在生成真菌和哺乳類動物之羊毛硬脂醇的環化酵素 ERG7 中；在 Gly383 的部分，Gly 是高度保留在所有 CAS 和 ERG7 的蛋白質中，但在生成其他產物的其他物種環化酵素中的這個位置則 是由其他胺基酸所取代 ¹⁷，像在產生 β-香桂素的 AMS 中是由 Ser 取 代，而這種演化上的保留性是否對於反應機制上的意義有影響亦是一 個值得討論的課題。

《圖1-25》G383與T384在CAS和ERG7各物種間的序列比對¹⁷

A. thaliana (Ath), Pisum sativum (Psa), Panax ginseng (Pgi), Glycyrrhiza glabra

S. cerevisiae (Sce), Candida albicans (Cal ), Cephalosporium caerulens (Cca), Schizosaccharomyces pombe (Spo), Rattus norvegicus (Rno), Homo sapiens (Hsa)

另外在先前的研究中，Matsuda 等人將 CAS 的 Tyr410（在 ERG7 中為Thr384）突變成 Thr，使產物由原本的環阿屯醇轉變為羊毛硬脂 醇、parkeol 以及新產物 9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol，其中羊毛硬脂醇

的比例佔了六成之多³⁸。而本實驗室之前的研究，嘗試將酵母菌ERG7 高度保留的 Thr384、Gln450 和 Val454 突變成在 CAS 中序列位置相 對應的Tyr、His 和 Ile（S. cerevisiae ERG7T384Y/Q450H/V454I），雖然沒有 生成預期的環阿屯醇，但產物卻由羊毛硬脂醇完全轉變為 parkeol。

個別對這三個突變點（ERG7^T384Y, ERG7^Q450H, ERG7^V454I）進行產物分 析 後 ， 發 現 只 有 ERG7^T384Y 會 生 成 parkerol 和 其 他 四 環 產 物 protosta-13(17),24-dien-3β-ol, protosta-16,24-dien-3β-ol⁶³。

最後我們利用發表在 Nature 期刊中的人類 OSC X-ray 晶體結構

14《圖 1-26》，與酵母菌 ERG7 的蛋白質結構《圖 1-27》比對後發現，

G383 和 T384 距離受質進出酵素的通道很近。基於以上種種因素更加 深對這兩個胺基酸做進一步探討的動機，因此我們將 Gly383 和 Thr384 進行定點飽和突變，希望能藉此瞭解其與 C17-cation 之間的關 係，以及酵素在環化機制上和對於活性區域甚至是整體蛋白質結構的 影響。

《圖1-26》人類OSC與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑Ro48-8071結合在活 性區域的反應中心，透明網狀的部分為受質進出酵素的通道¹⁴

《圖1-27》酵母菌 ERG7 的蛋白質結構，圈起來的部分為 Gly383 和 Thr384 所 在位置