第三章 實驗結果與討論
3.1 酵母菌 ERG7 G383X 與 ERG7 T384X 功能性分析
3.1.4 ERG7 G383X 與 ERG7 T384X 突變株電腦模擬分析
3.1.4.1 ERG7 G383 與受質間的關係
先前有提到在各物種產生四環產物羊毛硬脂醇的EGR7和環阿屯 醇的CAS中，其序列比對Gly383在這個位置都是高度保留的狀態。而 在酵母菌ERG7G383X突變株中，我們所得到的結果大致上是除了比較 小的胺基酸（Ala, Ser, Pro）外，其餘所有的突變株都會導致酵素失 去活性，比較特別的是當突變成Asp和Asn時，酵素不但可產生大量 的羊毛硬脂醇，甚至還有三環產物的生成。因此我們將以ERG7G383D 和ERG7G383N 突變株與野生型ERG7的電腦模擬圖為例，加以比較並進 行探討。
從《圖3-2A、B和C》可以看出當Gly383突變成Asp時，其帶有電 荷的酸基側鏈伸向了活性區域中，且受質羊毛硬脂醇、His234和 Phe699的位置都有明顯的改變。當 Gly383突變成 Asn時也可以看到 類似的情況《圖3-3A、B和C》，其醯胺基側鏈也伸向了活性區域中，
且受質的偏轉幅度很大。而由這些模擬結構圖我們推測，對Gly383 進行突變會影響酵素受質甚至是鄰近胺基酸在活性區域中的位置，
所以當帶有較大官能基和側鏈的殘基取代時，可能會改變酵素活性區
可以發現不管是 ERG7 還是 ERG7 ，其與C-14及C-17 碳陽 離子的距離都跟野生型ERG7差不多，這表示或許對於Gly383這個位 置，胺基酸與受質間的適當距離不會中斷活性區域中的環化反應但因 為突變後殘基所帶的官能基不同而對環化機制造成影響。
《圖3-2》酵母菌 ERG7G383D結構模擬圖，野生型ERG7 結構以綠色表示
3.1.4.2 ERG7 環化過程及生合成途徑推測
止反應形成 Protosta-16,24-dien-3β-ol。在 ERG7G383D的部分也有四環 產物 Protosta-16,24-dien-3β-ol的生成，而同樣也是在 C-14碳陽離子 中間物脫氫的三環產物，但與 ERG7G383N生成之三環產物不同，一個基酸位置的移動或者是受質摺疊構型的改變，甚至造成酵素失活。而 由 Asp和 Asn取代後所產生的三環及四環產物，則說明了雖然與受 質間的適當距離不會中斷活性區域中的環化反應，但因為突變後殘基 的官能基不同而對環化機制造成影響，使得部分受質在 C-14和 C-17 碳陽離子中間物終止了反應。
O (3S)-2,3-Oxidosqualene
3.1.4.3 ERG7
T384用極性和非極性胺基酸取代的差異
Thr384這個位置在產生四環產物羊毛硬脂醇的 EGR7中 Thr是 高度保留的，而在形成環阿屯醇的 CAS中則是高度保留 Tyr，由於 這兩個酵素環化機制的唯一差異就是，在環化反應進行到最後一步去 質子化步驟時，CAS會催化脫除 C-9上的氫而生成環阿屯醇，而 ERG7則催化 C-8上的氫行脫除反應而生成羊毛硬脂醇，加上有文獻 報導 CASY410T（對應到 ERG7為 Thr384）這個突變株可產生羊毛硬 脂醇。因此對於這個位置在酵素中扮演的角色，是不是與脫氫反應有 關讓人想更深入探討。
ERG7T384X的產物分布大部分都為四環產物，這與可能會影響酵 素環化機制之脫氫反應的觀點不謀而合，但特別的是 19種胺基酸中，
大約有一半的胺基酸對 Thr384取代後會有三環產物的產生，接下來 將針對這點進行討論。
由產物分析表可以發現一個現象，會生成三環產物的取代胺基酸 可區分為兩類，極性及非極性胺基酸。首先，以生成產量最多的非極 性胺基酸 Gly來做探討《圖3-5》，當 Thr突變成 Gly後，受質和鄰
氫的四環產物生成，因此推測經非極性胺基酸取代後，如果造成活性 區域立體結構的空洞，可能會導致受質不穩定而影響環化反應的進 行。
《圖3-5》酵母菌ERG7T384G結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示
在極性胺基酸的部分，以與 Thr結構類似的 Ser和 Cys來做比較，
當 Thr突變成 Ser《圖3-6A》，利用由受質尾端俯瞰的圖可以發現，
Gly383也被影響而朝左邊轉動，前面探討 ERG7G383時有提到如果 Gly383改變可能會導致其鄰近胺基酸 His234和 Phe699的位置也跟 著變動，從模擬圖也再次驗證此推論；而當 Cys取代 Thr《圖3-6B》，
其鄰近胺基酸的位置則幾乎沒有改變。從三環產物分布的結果來看
ERG7T384S較 ERG7T384C多，且因其連帶使 His234和 Phe699的位置移
動，所以推測是此原因造成 C-17碳陽離子脫氫之四環產物的生成。
《圖3-6》A. 酵母菌ERG7T384S結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示 B. 酵母菌ERG7T384C結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示
另外，也將Asn《圖3-7A》和Asp《圖3-7B》這兩個極性胺基酸 提出來討論，從圖中可以看到，當Thr被這兩個胺基酸取代後，由於 側 鏈 較 長 所 以 與 His234 和 Tyr510 的 距 離 縮 短 了 ， ERG7T384N與
C-20原脂醇碳陽離子中間物的功能，而 His234和 Tyr510也被認為是 環化機制中脫氫反應的關鍵胺基酸，因此推論 Asn和 Asp的側鏈可 能對 His234和 Tyr510造成影響而使環化反應提早終止而生成三環 和四環產物。與 ERG7T384D不同的是，ERG7T384N有單環產物的生成，
推測應該是因為 Asp為帶負電之胺基酸，所以應該會較 Asn能穩定 碳陽離子中間物，這可能也是 ERG7T384N三環產物產量很多的原因。
《圖3-7》A. 酵母菌ERG7T384N結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示 B. 酵母菌ERG7T384D結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示
藉由 ERG7T384D與 ERG7T384N的討論，或許也能說明為何帶正電 的胺基酸（Lys, Arg, His），除了因其側鏈很長有立體結構上的障礙，
使 Lys和 Arg取代 Thr時造成酵素失活外，由產物分析表可以看到在
ERG7T384H有單環產物和三環產物生成，ERG7T384K也有大量單環產物
產生，此結果應該也是因為帶正電之胺基酸影響了碳陽離子中間物使 環化反應無法進行。
最後，對芳香族胺基酸 Phe《圖3-8A》和 Tyr《圖3-8B》進行討 論，從圖中可以發現，當 Thr突變成 Phe時其芳香基團縮短了 Thr 與 His234和 Tyr510的距離，ERG7T384F與 His234的距離由 7.7 Å縮短 為 5.1 Å與 Tyr510的距離由 6.8Å縮短為 4.7Å。距離的量測告訴我們，
Phe芳香基團的位置較往 Tyr510偏轉，而 Tyr510在本實驗室先前的 研究中，認為它可以穩定行成A環時的碳陽離子中間物，因此推測
ERG7T384F可能會去影響 Tyr510而導致單環產物 Achilleol A的生成。
而將 Thr用 Tyr取代後，因為 Tyr的芳香環基團比 Phe多了個 OH基，
造成其與 His234和 Tyr510的距離變得非常近， ERG7T384Y與 H234 的距離由 7.7 Å縮短為 4.1 Å與 Tyr510的距離由 6.8Å縮短為 3.4Å。
直接對脫氫反應造成影響，使受質無法在對的位置脫氫而形成其它四 環產物。
《圖3-8》A. 酵母菌ERG7T384F結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示 B. 酵母菌ERG7T384Y結構模擬圖，野生型ERG7結構以綠色表示
3.1.4.4 ERG7
T384X環化過程及生合成途徑推測
從產物分析表可以發現，通常為組成蛋白質二級結構的 Pro，和
側鏈很大很長的 Trp和 Arg，由這些胺基酸取代時都會造成酵素失活，
之前也利用模擬圖探討 Thr384突變成各個胺基酸後所造成的影響，
綜合以上，當由非極性胺基酸取代時，在 C-14碳陽離子中間物脫氫 的三環產物(13αH)isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol和在C-17碳 陽 離 子 中 間 物 脫 氫 的 Protosta-16,24-dien-3β-ol 與 Protosta-13(17),24-dien-3β-ol，它們的產量會隨著取代基的增大而遞減 到零；因此我們認為 Thr384具有維持活性區域中，環化反應所需之 立體空間結構的功能，太小與側鏈太大的胺基酸都會影響環化反應的 進行，或使受質不穩定而有在環化過程中脫氫的產物。
Thr384似乎能穩定環化最後步驟脫氫反應的進行，當由極性或芳 香基團胺基酸取代時，一方面除了拉近與鄰近胺基酸的距離，另一方 面是這兩種胺基酸都可藉由其側鏈之取代基上帶電荷、電負性或π-電子效應的特性，直接或間接影響環化反應的進行，以及 His234與 Tyr510的氫鍵拉扯作用，而有中途脫氫的三環與四環產物，和無法在 C8 / C-9 碳 陽 離 子 中 間 物 正 確 位 置 脫 氫 的 Parkeol 與 9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol《圖3-9》。
O
3.1.4.5 ERG7
G383與 ERG7
T384在環化過程所扮演的角色
Gly383和 Thr384雖然相連在一起組成 C-17碳陽離子旁的環狀 區域結構，但所具備的功能卻迥然不同，從產物分析圖和突變後的電 腦模擬圖《圖3-10》就可以發現，我們將 ERG7G383N和 ERG7T384N與 野生型 ERG7放在一起做比較，從圖中可以明顯看到 Gly383Asn位於 受質的旁邊，而 Thr384Asn則位於受質上方，不管是對 Gly383還是 對 Thr384 進 行 突 變 都 不 太 會 影 響 到 隔 壁 胺 基 酸 的 位 置 ， 但
ERG7G383N會造成受質大幅度的變動，ERG7T384N則不會。對於這兩個
胺基酸在酵素中所扮演的角色，推論 Gly383可能位於受質通道上，
具有專一性，將此位置由別的胺基酸取代，會影響受質進入活性區域 或受質在酵素中的位置而導致酵素失活；Thr384可能具有穩定酵素進 行環化反應和維持反應進行時活性區域立體結構空間的功能，將此位 置由別的胺基酸取代，會影響環化機制的運作，且因其與鄰近胺基酸 His234和 Tyr510位於同一平面（受質上方），所以也會影響脫氫反 應的位置。而此實驗結果似乎也應證了，為何 Gly383這個位置是高 度保留在 ERG7和 CAS中，而 Thr384則分別由 Thr和 Tyr高度保留
《圖3-10》ERG7T384N（藍色）、ERG7G383N（紅色）與野生型ERG7（綠色）之 比較模擬結構圖
3.2 轉醣酵素 UGT73K1 之取得
3.2.1 對 UGT73K1 合成序列之洋菜膠電泳檢驗
取 出 少 量 由 Mr.Gene 公 司 合 成 完 之 質 體 DNA -YCCUGT73K1_pMK-RQ，先利用勝任細胞XL1-blue進行放大，熱休 克（heat shock）後在 37℃ 下培養約 16 小時，於 LB 培養基中挑 取兩個單一菌落分別培養於 3 ml 含Kanamycin的 LB 試管，接著將 放大抽取所得的質體 DNA，與限制酶 BamHI 和 NotI 反應，反應 後以洋菜膠電泳檢驗，如果所設計的序列及放大的過程沒有問題，則 會切出基因大小為 1.5Kb的 UGT73K1和 2.3Kb的載體 pMK-RQ《圖 3-11》。
《圖3-11》合成之質體DNA-YCCUGT73K1_pMK-RQ電泳檢驗圖
3.2.2 表現質體之構築與確認
將質體 DNA- YCCUGT73K1_pMK-RQ 和載體 pET28a（+）都 先以限制酶 NotI 及 BamHI 切出所需要連接的片段，接著利用T4 DNA接合酶將基因 UGT73K1與載體 pET28a（+）進行接合作用，
所 得 之 重 組 質 體 為 pET28a（+）UGT73K1。一樣利用勝任細胞 XL1-blue對重組質體進行放大，並挑取兩個單一菌落分別培養於 3 ml 含Kanamycin 的 LB 試管，接著將放大抽取所得的重組質體，以
《圖3-12》重組質體DNA- pET28a（+）/ UGT73K1電泳檢驗圖
3.2.3 重組基因在大腸桿菌之表現
確認定序結果無誤，將 pET28a（+）UGT73K1 重組質體轉形至 BL21（DE3）勝任細胞後，培養於 3 ml 含 Kanamycin 的 LB 試管
確認定序結果無誤，將 pET28a（+）UGT73K1 重組質體轉形至 BL21（DE3）勝任細胞後，培養於 3 ml 含 Kanamycin 的 LB 試管