第二章 實驗方法
2.1 對酵母菌 ERG7 進行定點飽和突變
2.1.1 重組質體的建構
利 用 Stratagene 公 司 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互 補引子。再以含有正常功能的野生型pRS314 ERG7 質體作為模板，
利用QuikChange Site-direct mutagenesis 的方式《圖 2-2》，建構定點 突變之質體。
《圖2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis 示意圖
（1）引子設計：
將所要突變之胺基酸以粗體字表示，並在突變點之後設計一個靜 默突變（Silent mutation，灰色鋼底表示），藉此增加一個切位（下標 線標示為切位序列）作為酵素鑑定之用。如下表：
《表2-1》酵母菌 ERG7G383X定點飽和突變之引子設計
YOSC primer name Sequence
YCC‐YOSC‐G383IKMNRST‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gAN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐G383CFLSWY‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gTN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐G383HLPQR‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gCN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐G383ADEGV‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
《表2-2》酵母菌 ERG7T384X定點飽和突變之引子設計
YOSC primer name Sequence
YCC‐YOSC‐T384IKMNRST‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg AAN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐T384CFLSWY‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg ATN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐T384HLPQR‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg ACN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
YCC‐YOSC‐T384ADEGV‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg AgN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
（2）QuikChange Site-Directed Mutagenesis
DNA。
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之材料條件
Reagent Volume (μl)
Primer1 (1μg/μl) 0.5
《表2-4》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之聚合酶連鎖反應條件
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min
《表2-5》DpnI切除PCR產物DNA母股之條件
Reagent Volume (μl)
PCR products 12
10X NE Buffer 4 1.5
Dpn I 1.5
（4）突變質體的放大與酵素鑑定 製備勝任細胞
取少許 XL1-Blue在含有 Tetracycline（100 mg/L）的 LB Agar 培養皿上劃四區，於 37℃培養箱一天後。由 Tetracycline/ LB Plate 上挑取單一菌落培養於含有 Tetracycline（100 mg/L）的 3 ml LB試 管，同樣在 37℃下於培養箱隔夜培養。接著將菌液接種於 1,000 ml 的 SOB培養液（含有0.02 M的MgCl2），於震盪培養箱中以 37℃、
250 rpm震盪條件培養 4至 5小時使其 OD600介於 0.5至 0.6之間。
將菌液置於經高壓滅菌過之離心瓶中，並冰浴十分鐘，接著在 4℃下 以 4,100 rpm的條件離心十分鐘，待去除上清液之後以經高壓滅菌過 之二次水清洗菌體，冰浴十分鐘後，再以 4,100 rpm、4℃條件離心十 分鐘。去除上清液後，以 320 ml TB buffer清洗 pellet，並重複上述
DNA的轉殖與放大以及限制酶鑑定 境下將菌液塗在 LB plate（with Ampicillin 100mg/l），在 37℃下培 養約 16小時後挑取單一菌落培養於 3 ml的LB tube（with Ampicillin 100mg/L），於 37℃、200 rpm震盪條件下培養12小時即可抽取放大 之質體DNA。
將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依《表2-6》所示條件，
將設計用於鑑定之限制酶與特定緩衝液混和，並置於 37℃水域槽中 反應四小時，再以 DNA電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。
《表2-6》特定限制酶鑑定之材料條件
Reagent Volume (μl) Volume (μl)
Plasmid 2 2
10X NE Buffer 1 1
BSA ‐ 1
Enzyme 0.5 0.5
DDW 6.5 5.5
（5）突變質體的定序
將 上 述 經 由 限 制 酶 鑑 定 過 之 含 有 突 變 的 質 體 DNA 以 Sangerdideoxynucleotide chain termination 進 行 定 序 。 首 先 利 用 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 以《表2-7》所示之材 料 依 廠 商 所 附 之 溫 度 條 件 下 進 行 聚 合 酶 連 鎖 反 應 ， 其 引 子 為 CTL-YOSC-C457ADEGV-AlwnI-2（5’-CTT CTg CAg T(g/C)N CAT
CAg CCA CTg TAT AgC C-3’）。在反應過後以酒精沈澱法取得DNA，
再以ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
《表2-7》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
Reagent Volume (μl)
Plasmid 2