第四章 結論與未來展望
4.1 酵母菌ERG7 G383 和ERG7 T384 功能性分析
（1）在酵母菌 ERG7G383X 的功能性篩選的結果中，除了比較小的胺 基酸（Ala, Ser, Pro）及 Asp和 Asn外，其餘所有的突變株都會導致 酵素失去活性。
（2） 當 Gly383突變成 Asp和 Asn時，其胺基酸側鏈伸向了活性區 域中，造成 His234和 Phe699的位置有明顯改變且導致受質的偏轉幅
基不同對環化機制造成影響而有三環和四環產物的生成。
（3）在 ERG7G383N的部分，當環化反應走依反馬可尼可夫法則形成 6-6-5 C-14碳陽離子中間物，此時有一部分受質會在此行終止反應而 形成 (13αH)isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol，而當環化反應走 到 C-20原脂醇碳陽離子，開始進行甲基與氫化基的轉移，重排至 C-17 碳 陽 離 子 中 間 物 時 有 一 部 分 受 質 也 會 在 此 終 止 反 應 形 成 Protosta-16,24-dien-3β-ol。
（4）在 ERG7G383D的部分也有四環產物 Protosta-16,24-dien-3β-ol的 生 成 ， 和 同 樣 在 C-14 碳 陽 離 子 中 間 物 脫 氫 的 三 環 產 物 ， 但 與
ERG7G383N生成之三環產物不同，一個是受質進入酵素活性區域摺疊
成椅型-船型-椅型的 (13αH)-isomalabarica-14Z,17E,21-trien-3β-ol，一
個 是 摺 疊 成 椅 型 - 椅 型 - 椅 型 的
(13αH)-malabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol。
（5）Gly383可能位於酵素的受質通道上，具有維持活性區域結構的 功能；因其為環狀區域的組成胺基酸，所以突變之後可能造成受質和 鄰近胺基酸位置的移動或者是受質摺疊構型的改變，而影響環化機制 甚至造成酵素失活。
（6）在酵母菌 ERG7GT384X 的功能性篩選的結果中四個會使酵素失 去活性的突變株中，Lys取代會產生大量的單環產物和少許四環產物，
至於其他致死的三個胺基酸取代（Trp, Arg 和Pro），則完全沒有 m/z 值為 426 的產物。在其它的胺基酸取代中除了羊毛硬脂醇還會有許 多三環和四環產物的生成。
（7）當 Thr384由非極性胺基酸取代時，在 C-14碳陽離子中間物脫 氫 的 三 環 產 物(13αH)isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol 和 在 C-17 碳 陽 離 子 中 間 物 脫 氫 的 Protosta-16,24-dien-3β-ol 與 Protosta-13(17),24-dien-3β-ol，它們的產量會隨著取代基的增大而遞減 到零；因此 Thr384可能具有維持環化反應進行時活性區域所需之立 體空間結構的功能，太小與側鏈太大的胺基酸都會對其造成影響，或 使受質不穩定而有在環化過程中脫氫的產物。
（8）Ser和 Cys的取代在 384位置與Thr384結構類似，但從三環產物 分布的結果來看 ERG7T384S卻較 ERG7T384C多，當 Thr384突變成 Ser 時，Gly383也被影響而朝左邊轉動，而 Gly383改變可能會影響其鄰
所以與 His234和 Tyr510的距離縮短了，因此 Asn和 Asp的側鏈可能 對 His234和 Tyr510造成影響而使環化反應提早終止而生成三環和 四環產物。與 ERG7T384D的差異是，ERG7T384N有單環產物的生成，推 測應該是因為 Asp為帶負電之胺基酸，似乎較 Asn能穩定碳陽離子 中間物，這可能也是 ERG7T384N三環產物產量很多的原因。
（10）ERG7T384F與 His234的距離由 7.7 Å縮短為 5.1 Å與 Tyr510的 距離由 6.8Å縮短為 4.7Å。距離的量測顯示，Phe芳香基團的位置較 往 Tyr510偏轉，因此推測 ERG7T384F可能會去影響 Tyr510而導致單 環產物 Achilleol A的生成。
（11）Tyr比 Phe的胺基酸側鏈多了個 OH基，當 384位置置換成 Tyr 後，將造成其與 His234和 Tyr510的距離變得非常近， 其與 H234 的距離由 7.7 Å縮短為 4.1 Å與 Tyr510的距離由 6.8Å縮短為 3.4Å。
且 ERG7T384Y生成的全都是四環產物，比例占最多的除了羊毛硬脂醇，
大 部 分 都 是 Parkeol 和 9 β -lanosta-7,24-dien-3 β -ol ， 因 此 推 測
ERG7T384Y可能藉由其芳香環基團直接對脫氫反應造成影響，使受質
無法在適當的位置脫氫而導致形成其它四環產物。
（12）Thr384似乎能穩定環化最後步驟脫氫反應的進行，當由極性或 芳香基團胺基酸取代時，除了拉近與鄰近胺基酸的距離，其可能藉由
側鏈之取代基上帶電荷、電負性或π-電子效應的特性，直接或間接影 響環化反應的進行，或 His234與 Tyr510的氫鍵拉扯作用，而有中途 脫氫的三環與四環產物，和無法在C8 / C-9 碳陽離子中間物正確位置 脫氫的 Parkeol與 9β-lanosta-7,24-dien-3β-o。