蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）之轉醣酵素UGT3K1

接下來將對第二部分的實驗，如何取得UGT73K1 蛋白質進行實 驗方法的介紹。

2.2.1 合成 UGT73K1 基因序列

先於NCBI 資料庫中搜尋 UGT73K1 的完整核苷酸序列，接著在 序列的首端和末端分別加上限制酶

BamHI 和 NotI 的切位序列，此目

核苷酸序列確定後交由Mr. Gene 有限公司（Regensburg, Germany）

CATATCATCAAATTCCCATCAgCCCAACTCggTCTACCTACCggCgTTgAAAA CTAAACTAggCggCCgCAAAAggAAAA -3'

2.2.2 質體 DNA 的放大與酵素鑑定

從 -80℃ 冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取 1 μL 由 Mr.

Gene 公司合成後之質體 DNA ，加入 60 μL 的勝任細胞，冰浴 20 分 鐘使質體 DNA 附著於細胞的表面。置於 42℃ 的水浴一分鐘後，

在無菌環境下將菌液塗在 LB 培養基，在 37℃ 下培養約 16 小時 後 ， 挑 取 單 一 菌 落 培 養 於 3 mL 的 LB 試 管 （ 含 Kanamycin 25mg/mL），於 37℃、200 rpm 震盪條件下培養 12 小時，即可利 用 Plasmid Miniprep Purification Kit 抽取放大之質體 DNA。將放大 抽取所得的質體 DNA，與限制酶和特定緩衝液混和，並置於 37℃

水浴槽中反應四小時，再以 DNA 電泳來確定質體 DNA 經由限制酶 反應後的片段大小是否正確。

2.2.3 建構表現質體

將Mr. Gene 公司合成之質體 DNA 與載體 pET28a（+）先以 NotI 限制酶切割3 小時後，再加入 BamHI 限制酶切出所需要連接的基因 片段與載體，接著利用 T4 DNA 接合酶將基因片段與載體進行接合 作用，於 16℃反應 6 小時，所得之重組質體為 pET28a（+）/ UGT73K1。

Kanamycin 25mg/mL）前，會把所挑取的單一菌落先劃眉於 LB plate 上再放入 LB 試管中，兩者同樣在 37℃培養箱中培養 16 小時，酵 素鑑定完正確後即可將此 LB plate 送交廠商（明欣生物科技有限公 司）做重組質體之定序。

2.2.4 重組質體於大腸桿菌之表現

所建構之重組表現質體以 42℃熱休克方式送入大腸桿菌 BL21

（DE3）勝任細胞中。挑選出帶有表現載體的菌落，將之培養於含有 25mg/mL Kanamycin 的 3 ml LB 試管中，於 37℃進行隔夜振盪培養，

次日將之於無菌操作下倒入已高壓滅菌過的 500 mL LB 培養液中，

於 37℃振盪培養至菌液濃度達吸光值（波長 600 nm）為 0.7 時，始 加 入 0.5 mM 的 異 丙 基 硫 化 半 乳 糖 苷 （ isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），置於 20℃進行隔夜振盪培養，

以誘發重組蛋白質之生合成。隨後以 4000 g 離心 10 分鐘收取細胞，

使細胞懸浮於冰冷之 binding buffer （20 mM Tris、500 mM NaCl，

pH 7）中。將樣品置於冰上並以超音波振盪（sonication）方式打破細 胞，於 4℃以 11000 g 離心 30 分鐘後，分別收取菌體及上清液進行 SDS-PAGE 分析，並利用鎳離子層析管柱來分離純化。

2.2.5 金屬離子親和性管柱層析

取總體基為 20 mL 的塑膠管柱，加入 Ni-NTA 樹脂（Ni-NTA His-Band^® Resin）2 mL ，利用上述之 binding buffer （20 mM Tris、

500 mM NaCl，pH 7）平衡管柱後。將破菌後之上清液緩慢加入，分 別以含有不同imidazole 濃度的 washing buffer（20 mM Tris、500 mM NaCl、50 mM imidazole，pH 7）、（20 mM Tris、500 mM NaCl、100 mM imidazole，pH 7）、（20 mM Tris、500 mM NaCl、500 mM imidazole，

pH 7）沖提，將與樹脂上之鎳離子結合的重組蛋白析出，收集完畢後 分別取樣做蛋白質濃度測試與 SDS-PAGE 蛋白質電泳分析。

2.2.6 蛋白質的分子量與純度分析

配置適當比例的電泳膠片《表 2-8》，取出純化之蛋白質溶液與 樣品緩衝液為 4：1 的體積比例混合，在 95℃水浴下加熱 5 分鐘後，

柱入於膠片上端的樣品凹槽內。先固定以 90 伏特的電壓進行電泳，

當染劑（Dye）到達 separating gel 層後，再將電壓增加到 120 伏特，

之後通電壓約 1～1.5 小時，待染劑至膠片底端後即完成。以膠片染

30 % acrylamide / 1 % bis‐acrylamide  8 mL  ELISA plate 之中，加入已混合均勻的 BCA 試劑 180μL（Reagent A/B

= 50/1 的比例），置於 37℃下反應 20 分鐘，測量溶液在波長 560 nm 時的吸收值變化；同時，先配置好八個不同濃度的已知 BSA 標準溶 液，可定出一線性的標準曲線（linear standard curve），而所測得的吸 收值則可用內插法的方式，換算為對應蛋白質的濃度。