生物科技研究所
碩士論文
利用定點飽和突變技術對於酵母菌氧化鯊烯環化酵素中
Gly383及Thr384進行功能性分析並藉由表現之蒺藜苜蓿轉
醣酵素對三萜類化合物進行醣基衍生化之研究
Functional Analysis of Glycine-383 and Threonine-384
within Oxidosqualene-lanosterol Cyclase from
Saccharomyces Cerevisiae by Site-Saturated Mutagenesis
and Expressed Medicago Truncatula Glucosyltransferases
for Triterpenes Glycosylation
研 究 生 : 陳怡臻
指導教授 : 吳東昆 博士
Thr384進行功能性分析並藉由表現之蒺藜苜蓿轉醣酵素對三萜類化
合物進行醣基衍生化之研究
Functional Analysis of Glycine-383 and Threonine-384 within Oxidosqualene-lanosterol Cyclase from Saccharomyces Cerevisiae by
Site-Saturated Mutagenesis and Expressed Medicago Truncatula Glucosyltransferases for Triterpenes Glycosylation
研究生：陳怡臻 Student: Yi-Chen Chen 指導教授：吳東昆 博士 Advisor: Dr. Tung-Kung Wu
國 立 交 通 大 學
生物科技研究所
A Thesis
Submitted to Department of Biological Science and Technology College of Biological Science and Technology
National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of Master
in
Biological Science and Technology July, 2011
利用定點飽和突變技術對於酵母菌氧化鯊烯環化酵素中
Gly383及Thr384進行功能性分析並藉由表現之蒺藜苜蓿轉
醣酵素對三萜類化合物進行醣基衍生化之研究
學生: 陳怡臻 指導教授: 吳東昆 博士 國立交通大學 生物科技研究所碩士班 摘要 在酵母菌以及哺乳類動物中，氧化鯊烯環化酵素(ERG7或OSC) 催化直鏈狀的氧化鯊烯((3S)-2,3-oxidosqulaene)進行環化/重組反應 而產生羊毛硬脂醇。在不同的生物物種中，像是動物、真菌和植物會 藉由不同的環化酵素和反應機制形成不同的產物。這個複雜的環化/ 重組反應機制，包含了氧化鯊烯上的環氧基(epoxide)被質子化而起 始環化反應，以及一連串的氫化基、甲基的重組和最後高度專一性的 去質子化步驟。根據先前的研究，在環化酵素中對於活性區域及立體 化學結構具有重要影響的胺基酸進行突變，可以得到單環、三環和四 環等多樣性固醇類產物。為了更進一步瞭解其他關鍵胺基酸對於OSC 在環化過程及反應機制所扮演的角色，利用飽和定點突變的方式，分 析存在於酵素假設活性區中的相對應胺基酸，Gly383 及Thr384。在ERG7T384X 和 ERG7G383X突變株中，分離出許多四環和三環產物，包 括parkeol、9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol、protosta-16,24-dien-3β-ol 和 (13αH)-isomalabarica-14(26),17,21-trien-3β-ol 等。而藉由酵素結構模 擬圖我們也注意到Gly383 和Thr384位在受質C-17原脂醇碳陽離子旁 的環狀區域（loop）上。Gly383 和Thr384 對於穩定C-14 和C-17原 脂醇碳陽離子，以及最後脫氫反應的C8 / C-9 碳陽離子中間物似乎扮 演重要的角色，對這兩個胺基酸進行突變可能會對酵素活性區域的結 構及環化/重組反應造成影響，而得到這些非專一性的多樣性產物。 三萜皂苷是一群具有相似化學結構的多樣性產物，由三萜皂苷配 基和醣基所組成，為分布於高等植物中的二級代謝產物且多方面的生 物活性可被廣泛應用。大部分的三萜皂苷其C-3上的OH 基都接有醣 基或醣鏈，而此結構也被認為是其具有生物活性的關鍵。在利用定點 突變研究氧化鯊烯環化酵素重排和環化機制的實驗當中，分離出許多 四環的中間物及脫氫位置不同的產物，為了使這些產物有更多的應用 性。我們合成出由蒺藜苜蓿所分離出的轉醣酵素基因-UGT73K1，並 得到大小為 52-kDa 的蛋白質。未來希望將氧化鯊烯環化酵素的突變
Functional Analysis of Glycine-383 and Threonine-384
within Oxidosqualene-lanosterol Cyclase from
Saccharomyces Cerevisiae by Site-Saturated Mutagenesis
and Expressed Medicago Truncatula Glucosyltransferases
for Triterpenes Glycosylation
Student: Yi-Chen Chen Advisor: Dr. Tung-Kung Wu
Institute of Naitonal Chiao Tung Unversity
Abstract
Oxidosqualene-lanosterol cyclase (OSC or ERG7) catalyzes the cyclization/rearrangement of the linear form substrate, oxidosqualene, into tetracyclic lanosterol in yeast and mammals. Different species of organisms including S. cerevisiae OSC, A. thaliana CAS and P. sativum PSY operate through different conformational intermediates within the oxidosqualene cyclization process. The postulated cyclization/rearrangement reaction encompasses an acid-catalyzed epoxide protonation, consecutive cationic/π interaction-directed tetracyclic ring cyclizations, hydrides or methyl groups rearrangement, and a final highly specific deprotonation step. According to previous reports, the mutated OSC produced diverse product profiles ranging from mono- to polycyclic triterpene alcohols by utilizing the diverse structural and stereochemical control in various catalytically important residues
mutant. In order to further illustrate other critical amino acids involved in the catalytic significance and/or enzymatic plasticity of OSC, site-saturated mutagenesis experiments were carried out on the Gly383 and Thr384 of ERG7 to investigate their functional roles in the oxidosqualene cyclization/rearrangement reaction. Various tetracyclic or
tricyclic truncated products, including parkeol, 9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol, protosta-16,24-dien-3β-ol, and (13αH)-isomalabarica-14(26),17,21-trien-3β-ol were isolated from the ERG7T384X and ERG7G383X mutants. In parallel, we also observed that the Gly383 and Thr384 are located on the loop of ERG7 below the C-17 protosteryl cation from the examination of homology models. These results indicated that the Gly383 and Thr384 residues may play an important role in stabilizing C-17 and C-14 protosteryl cation as well as the final C-9 lanosteryl cationic intermediate. The mutated substitution in these two residues, Gly383 and Thr384, may affect the structure of protein active site that interfere the cyclization/rearrangement reaction cascade and thus resulted in the generation of the altered cyclized/deportonated product.
Triterpene saponins are a group of diverse compounds with a similar chemical structure, consisting of a triterpene aglycone and sugars moiety. They are a class of plant natural products with a wide range of bioactivities. The presence of a sugar chain attached to the aglycone at its
ERG7 mutants and subject them for the application of pharmaceutical field in future. We try to attach a sugar moiety to the C-3 hydroxyl position of tetracyclic products in ERG7 mutants. Herein, we first
obtained one glucosyltransferase gene, UGT73K1, from Medicago
truncatula and expressed it with predict molecular mass about 52-kDa,
revealed by a SDS-PAGE. In the future, various OSC mutants’ products will be substrates of UGT73K1, and apply these structural derivatives for various bioactivity analyses.
謝誌
不知該如何提筆的開頭，在這瞬間很多回憶畫面不斷浮現在腦海， 於是兩年就這樣過了，感謝大家的陪伴，這段帶有歡笑、感動與充實 的日子。 謝謝我的指導教授吳東昆老師，提供一個非常完善的實驗環境讓 我們能夠無憂無慮專心在自己的研究，除了實驗上的指導，您總是默 默的關心和擔心我們，能進入這樣溫馨和諧的大家庭，真的很幸運也 很謝謝老師。 感謝口試委員李耀坤老師和李宗璘老師在百忙之中抽空審閱修 改我的論文、親臨指導口試，並且不吝惜的給予許多寶貴的建議，使 我收穫良多。 感謝實驗室最亮的光明燈－翔哥，謝謝你抽空幫我修改論文，帶 我認識了許多實驗上相關的背景資料；感謝媛婷學姊這兩年總是帶著 笑容和耐心與我討論實驗，給予最大的支持和鼓勵陪我們度過難關； 感謝裕國學長在蛋白質實驗上給我很多建議和幫忙；感謝實驗室儀器 的守護神－豪哥，謝謝你不辭辛勞維持和看管實驗室大大小小的儀器， 還有環安相關的工作；感謝晉源學長指導我關於蛋白質表現和純化的 實驗，以及幫我們解決很多關於電腦模擬的操作問題；感謝文鴻學長， 雖然與你見面的時間不多，但每次跟你聊天都很愉快，瘦體脂大作戰 一起加油吧；Thank you, Mili. I’ll always miss your India food.；感謝紅 姊這兩年的照顧，博愛校區實驗室有你在就會讓人覺得很安心，我要給你一個大擁抱；感謝一直不斷發 paper 的 Allen 從不吝嗇與我們分
。 最後要感謝我親愛的家人：爸爸、媽媽和姊姊，謝謝你們給我依 靠和支持，有你們我真的很幸福；還有一路陪我走到現在的好哥兒們、 好姊妹們，謝謝你們陪我談心、散心和傾聽自己的心。 祝福所有愛我和我愛的人都能夠帶著微笑度過每一天，事事順利 和快樂幸福。再次感謝大家！
目錄
中文摘要 ... I 英文摘要 ... III 謝誌 ... VI 目錄 ... VIII 表目錄 ... XII 圖目錄 ... XIII 第一章 序論... 1 1.1 氧化鯊烯環化酵素簡介 ... 1 1.1.1 氧化鯊烯的結構與其環化機制 ... 6 1.2 氧化鯊烯環化酵素探討 ... 9 1.2.1 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 ... 9 1.2.2 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 ... 10 1.2.3 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素反應機制 ... 11 1.2.3.1 開環起始反應和 A 環的形成 ... 12
1.2.5 氧化鯊烯-香桂素與氧化鯊烯-羽扇醇合成酵素 ... 26 1.3 皂苷簡介 ... 28 1.3.1 皂苷的生物活性 ... 30 1.3.2 皂苷生合成探討 ... 32 1.4 研究目的 ... 35 1.4.1 對氧化鯊烯環化酵素進行定點飽和突變 ... 36 1.4.2 將 OSC 突變產物應用於轉醣酵素 ... 43 第二章 實驗方法 ... 46 2.1 對酵母菌 ERG7 進行定點飽和突變 ... 46 2.1.1 重組質體的建構 ... 47 2.1.2 酵母菌株 TKW14C2 的電穿孔作用 ... 53 2.1.3 功能性補充篩選 ... 55 2.1.4 酵母菌的培養 ... 55 2.1.5 非皂化脂質的萃取 ... 56 2.1.6 管柱液相色層分析 ... 56 2.1.7 薄層色層分析 ... 57 2.1.8 氣相層析-質譜儀（GC-MS）的條件 ... 58 2.1.9 突變電腦模擬圖的建構 ... 58 2.2 蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）之轉醣酵素UGT3K1 ... 59
2.2.1 合成 UGT73K1 基因序列 ... 59 2.2.2 質體 DNA 的放大與酵素鑑定 ... 61 2.2.3 建構表現質體 ... 61 2.2.4 重組質體於大腸桿菌之表現 ... 62 2.2.5 金屬離子親和性管柱層析 ... 63 2.2.6 蛋白質的分子量與純度分析 ... 63 2.2.7 蛋白質濃度測量 ... 64 第三章 實驗結果與討論 ... 66 3.1 酵母菌 ERG7G383X與 ERG7T384X功能性分析 ... 66 3.1.1 建構 ERG7G383X與 ERG7T384X的定點飽和突變株 ... 66 3.1.2 ERG7G383X與ERG7T384X突變株功能性補充篩選 ... 66 3.1.3 ERG7G383X與ERG7T384X突變株產物分析 ... 68 3.1.4 ERG7G383X與ERG7T384X突變株電腦模擬分析 ... 71 3.1.4.1 ERG7G383 與受質間的關係 ... 73 3.1.4.2 ERG7G383X 環化過程及生合成途徑推測 ... 76 3.1.4.3 ERG7T384 用極性和非極性胺基酸取代的差異 ... 79
3.2.1 對 UGT73K1 合成序列之洋菜膠電泳檢驗 ... 88 3.2.2 表現質體之構築與確認 ... 89 3.2.3 重組基因在大腸桿菌之表現 ... 90 3.2.4 利用基質輔助雷射脫附質譜儀對UGT73K1作確認 ... 91 3.2.5 利用酵素耦合對UGT73K1進行活性測試 ... 93 3.2.6 皂苷轉醣酵素胺基酸序列比對 ... 95 第四章 結論與未來展望 ... 99 4.1 酵母菌ERG7G383和ERG7T384 功能性分析 ... 99 4.2 轉醣酵素UGT73K1的取得 ... 103 第五章 參考文獻 ... 105
表目錄
《表1-1》阿拉伯芥中 CAS 定點突變產物及其比例分配表 ... 25
《表2-1》酵母菌 ERG7G383X定點飽和突變之引子設計 ... 49
《表2-2》酵母菌 ERG7T384X定點飽和突變之引子設計 ... 49
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之材料條件 .... 50
《表2-4》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之聚合酶連鎖 反應條件 ... 50
《表2-5》DpnI 切除 PCR 產物 DNA 母股之條件 ... 51
《表2-6》特定限制酶鑑定之材料條件 ... 52
《表2-7》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材 料 ... 53
《表2-8》12.5 % separating gel（上）及 5 % stacking gel（下）電 泳膠片的配方 ... 64
《表3-1》酵母菌 ERG7G383X功能性篩選 ... 67
《表3-2》酵母菌 ERG7T384X功能性篩選...68
《表3-3》酵母菌 ERG7G383X的產物分析表 ... 70
圖目錄
《圖1-1》三萜類環化酵素在不同物種間的產物專一性和多樣性... 2 《圖1-2》固醇類生合成途徑... 4 《圖1-3》氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物... 8 《圖1-4》人類OSC X-ray 晶體結構，圖中黑色處為抑制劑 Ro48-8071，用以指出與受質結合時的反應活性位置... 10 《圖1-5》氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之環化機制... 12 《圖1-6》酵母菌 ERG7 假設開環環化機制 ... 13 《圖1-7》人類 OSC 開環環化機制 ... 14 《圖1-8》Trp387、Phe444 與 Trp581 能穩定 A 環與 B 環形成時 C-6、C-10 碳陽離子中間物；Tyr98 的側鏈藉由立體空間 障礙促使 B 環形成能量較不傾向的船形結構 ... 16 《圖1-9》利用類似物作為受質結果顯示 C 環會先形成五圓環 ... 17 《圖1-10》Hess 認為 C 環與 D 環會經由過度態 10 同時形成 ... 18《圖 1-11》Johnson 提出的理論模型 Johnson Model ... 19
《圖1-12》Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 理論模組 ... 20
《圖1-13》具有高度保留性的芳香族胺基酸可以利用碳陽離子與 π電子共振交互作用去穩定甲基與氫化基的骨架轉移重 排... 21
《圖1-14》氧化鯊烯環化酵素及其產物-羊毛硬脂醇形成複合物 的結構圖。圖中所顯示的胺基酸基團為距離產物在5Å 內的位置，水分子只有在Asp456 及 His232 附近被觀察 到 ... 21 《圖1-15》Tyr410（◆）、His477（＊）與Ile481（▼）在CAS1高度 保留，而在ERG7中則被Thr、Cys、Gln及Val所取代... 23 《圖1-16》氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素中 Tyr410、His477 與 Ile481 的相對位置... 24 《圖1-17》酵素催化氧化鯊烯形成達瑪烯碳陽離子及原脂醇 碳陽離子中間物... 26 《圖1-18》皂苷配基的典型骨架結構，（A）、（B）為固醇皂苷 ，（C）為三萜皂苷，R 為醣基... 29
《圖1-19》lotoidoside D（1）和 lotoidoside E（2）在低濃度下
對於HeLa cell 也有很好的抑制活性... 31 《圖1-20》3-O-β-D-glucuronopyranosyl-quillaic acid 對於治療
《圖1-23》本實驗室目前已得到在C-17cation位置脫氫的 新產物... 38 《圖1-24》酵母菌ERG7活性區域中C-17 cation位置及其鄰近 之胺基酸... 39 《圖1-25》G383 與 T384 在 CAS 和 ERG7 各物種間的序列比對. 40 《圖1-26》人類OSC與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑 Ro48-8071 結合在活性區域的反應中心，透明網狀 的部分為受質進出酵素的通道... 42 《圖1-27》酵母菌 ERG7 的蛋白質結構，圈起來的部分為 Gly383 和 Thr384 所在位置... 42 《圖1-28》UGT73K1 在蒺藜苜蓿中的簡略生合成途徑...45 《圖2-1》實驗流程圖... 46
《圖2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis 示意圖... 48
《圖3-1》野生型酵母菌 ERG7G383和 ERG7T384與附近胺基酸之 結構模擬圖... 72 《圖3-2》酵母菌 ERG7G383D結構模擬圖，野生型ERG7 結構 以綠色表示...74 《圖3-3》酵母菌 ERG7G383N結構模擬圖，野生型ERG7 結構 以綠色表示...75
《圖3-4》酵母菌ERG7G383X假設產物生成路徑推測圖...78
《圖3-5》酵母菌ERG7T384G結構模擬圖，野生型ERG7結構
以綠色表示...80
《圖3-6》A. 酵母菌ERG7T384S結構模擬圖，野生型ERG7結構
以綠色表示；B. 酵母菌ERG7T384C結構模擬圖，野生型
ERG7結構以綠色表示...81
《圖3-7》A. 酵母菌ERG7T384N結構模擬圖，野生型ERG7結構
以綠色表示；B. 酵母菌ERG7T384D結構模擬圖，野生型
ERG7結構以綠色表示...82
《圖3-8》A. 酵母菌ERG7T384F結構模擬圖，野生型ERG7結構
以綠色表示；B. 酵母菌ERG7T384Y結構模擬圖，野生型 ERG7結構以綠色表示...84 《圖3-9》酵母菌ERG7T384X假設產物生成路徑推測圖...86 《圖3-10》ERG7T384N（藍色）、ERG7G383N（紅色）與野生型 ERG7（綠色）之比較模擬結構圖...88 《圖3-11》合成之質體 DNA- YCCUGT73K1_pMK-RQ 電泳
《圖3-13》pET28a（+）UGT73K1在大腸桿菌BL21（DE3） 的表現及純化結果...91 《圖3-14》轉醣酵素 UGT73K1 之 MALDI-TOF MS 圖...92 《圖3-15》利用 CID 對胜肽片段（m/z 1490.789）進行碎裂 所得到之 MS/MS 圖譜...92 《圖3-16》酵素耦合反應式...94 《圖3-17》UGT73K1酵素耦合活性測試反應結果... 94 《圖3-18》皂苷轉醣酵素 UGT73K1、GmSGT2、UGT74M1、 GmSGT3 與 UGT71G1 胺基酸序列比對結果...96 《圖3-19》轉醣酵素 GmSGT2 及 GmSGT3 的作用機制...98
第一章 序論
1.1 氧化鯊烯環化酵素簡介
氧化鯊烯環化酵素屬於自然界三萜類環化酵素家族的一族，三萜 類化合物（triterpenoid）是一群以五個碳的異戊二烯（isoprene）為其 單元組成所衍生而來的多烯類產物。目前，已知由天然來源而產生的 不同多烯類骨架的三萜類化合物有近兩百多種 1。這些三萜類化合物 主要是以直鏈狀的氧化鯊烯（(3S)-2,3-oxidosqualene）為受質，經由 單一酵素的催化反應，並藉由酵素與受質間具有立體選擇性的環化及 骨架重排作用，包括雙鍵或環氧鍵（epoxide）的質子化（protonation）、 誘導開環、環化（cyclization）、甲基與氫化基之重組（rearrangement）、 與最後的中止脫除（elimination）反應，生成存在於自然界各物種中 具有特異性的產物。不同物種間依其不同的環化酵素，能分別將氧化 鯊烯催化形成多個不對稱立體中心的多環類脂醇或三萜類化合物2 。 在較高等的植物與藻類中，氧化鯊烯可以被環阿屯醇合成酵素（cycloartenol synthase, CAS ） 環 化 進 而 生 成 四 環 之 環 阿 屯 醇
bacterium ） 中 ， 氧 化 鯊 烯 - 羊 毛 硬 脂 醇 環 化 酵 素 （oxidosqualene-lanosterol cyclase, OSLC）則會將氧化鯊烯環化形成 四環之羊毛硬脂醇（lanosterol, LA）。這些具有產物專一性的環化產 物，可分別依反應產物骨架的複雜性進而區分為 6-6-6-5 四環、 6-6-6-6-5 五環、6-6-6-6-6 五環或其他單環、雙環、三環與六環的三萜 類化合物《圖1-1》。 Squalene (3S)-2,3-Oxidosqualene O OH Hopanol Hopene Bacterial Bacterial HO Lanosterol HO Lupeol Animals and Fungi Higher plants HO Cycloartenol HO β-Amyrine Higher plants Higher plants 《圖1-1》三萜類環化酵素在不同物種間的產物專一性和多樣性 固醇類（sterol）是多環脂醇類物質的通稱，其組成通常是以四
至六環作為其結構的中心骨架，並含有一個長短不一且經由不同官能 基修飾之側鏈，同時在其C-3位置上會有一羥基者稱之。自然界的固 醇類普遍存在於動、植物與真菌中，例如：膽固醇（cholesterol）、 麥角固醇（ergosterol）、植物固醇（phytosterol）。在大多數的真核 細胞中，固醇類物質扮演著細胞膜組成及生理調控的重要角色3，所 以固醇類的生合成途徑與其代謝調節機制一直是近年來十分重要的 研究課題。 自然界固醇類的生合成，是由兩個碳的乙醯輔酶-A（Acetyl-CoA） 開始合成，在經由幾個步驟的反應縮合後，利用其速率決定步驟－3- 羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）的催化而形 成二羥甲基戊酸（Mevalonic acid），之後再經一連串的ATP水解參與 反應，進而生成異戊二烯類的中間物（Isoprenoid intermediates），隨 後六個五碳的異戊二烯單元體經過縮合及還原反應分別形成二萜基
焦磷酸鹽（ geranyl pyrophosphate ） ；三萜基焦磷酸鹽（ farnesyl pyrophosphate）與最後產生的疏水性鯊烯（Squalene）。鯊烯經氧化 代謝生成的氧化鯊烯，會經由環化及一連串反應，進而合成其最終產
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Mevalonate Geranyl pyrophosphate Fernesyl pyrophosphate Squalene Hopene SHC HMG-CoA synthase HMG-CoA reductase (30C ) Isoprenoid intermediates(5C) (3S)2,3-Oxidosqualene CAS cycloartenol LUS Lupenol AMS β-Amyrin OSC Lanosterol
Phytosterol Ergosterol Cholesterol
Squalene monooxygenase
Acetoacetyl-CoA
( Bacteria )
Oleanane-type triterpene saponins
( Plants ) ( Plants ) ( Plants ) ( Fungi ) ( Animal )
《圖1-2》固醇類生合成途徑 在動物體內，最常見的固醇類物質為膽固醇其是以一種類似脂肪 的複合體存在於人體。膽固醇在動物體內參與了許多與新陳代謝相關 的生理調控。其主要是由肝臟製造產生，其次是在腎上腺皮質及動脈 管壁上生成，同時也可經由食物攝取而獲得4。由於它是細胞膜脂質
筏（Lipid raft）的重要成分，脂質筏是指細胞膜中一塊固性區域，即 一塊較不具流動性的富含膽固醇的區域，當細胞膜上膽固醇比例增加 時，細胞膜的流動性會減少，因此可藉此調控細胞膜的流動性，進而 影響胞內外物質的滲透5。許多文獻研究也指出，脂質筏可能與訊息 傳遞、發炎反應、細胞移動（Migration）、並與神經傳導等疾病的發 生有關，如阿茲海默症（Alzheimer’s disease）等6 。此外，膽固醇亦 可藉此調控細胞膜上之蛋白質使其進行訊息傳遞、代謝反應與催化等 作用7。膽固醇也是膽汁、固醇類荷爾蒙、維生素D、紅血球與其它五 種固醇類激素的重要前驅物，如糖皮質固醇（Glucocorticoids）中的 皮質醇（Cortisol）、礦物皮質固醇（Mineralocorticoids）中的醛固酮 （Aldosterone）、雄性激素（Androgens）、雌激素（Estrogens）與 黃體酮（Progestins）。 人體也可利用膽固醇，自行合成脂溶性維生素D，而維生素D 是一 種具有激素功能的固醇，會影響鈣質吸收，進而造成血鈣與骨鈣的回 饋循環平衡，以刺激基因表現與增加骨質的密度。另外，在酵母菌的 實驗也發現，部份具特定結構的固醇類，以及其相對應的激素，對於
Fluvastatin 等。此類藥物抑制的位置位於膽固醇生合成的上游，因此 會進而影響其下游產物異戊二烯中間物與三萜類化合物的生成，導致 具有重要功能之二次代謝物的生成與調節受到影響。而氧化鯊烯環化 酵素位於整個反應的中下游，若由此處做為研發抑制物的研究標的， 對身體的副作用理論上會相對較小，故近年來針對氧化鯊烯環化酵素 抑制劑的合成，已成為研發降膽固醇和抗黴菌藥物的新目標8。
1.1.1 氧化鯊烯的結構與其環化機制
此具有反應複雜性、產物多樣性和重要生理功能，且僅需單一步 驟的氧化鯊烯環化酵素催化反應，對於其催化氧化鯊烯進行環化反應， 進而形成多環多烯類（terpenes）的催化機制在這半世紀以來一直是 分子生物學家及化學家所公認是最迷人及最具挑戰性的生物轉化反 應之一。 在先前的研究文獻中，Corey 與 Bloch 證明了哺乳類中其氧化 鯊烯環化酵素合成羊毛硬脂醇的反應受質是2,3-氧化鯊烯9 。Barton 則 更進一步證明真核生物是利用3(S)-2,3-氧化鯊烯做為其環化的反應受 質，而其非3(R)的鏡像異構物10 。另外，突變實驗證明了胺基酸 Asp456 在氧化鯊烯環化酵素家族中具有高度保留性並且為催化所必須之胺 基酸。因此，此 Asp 被認為是誘導環氧基開環的重要基團。目前已被報導出來約有近兩百多種氧化鯊烯環化酵素的產物，它 們是經由類似的酵素催化機制因此都具有相似的骨架結構，但由於酵 素活性區域與受質結合區的不同，導致其在環化骨架上的差異。整體 來說環化過程是由環化酵素中的酸性胺基酸提供電子，進而使得親核 性的雙鍵或是環氧基藉由其親核性作用進行開環起始反應，其中包含 了16 個鍵的斷裂與生成，並經過一連串的碳陽離子-烯烴環化作用 （cation-olefin cyclization）生成帶有正電的高能碳陽離子中間產物 （cationic intermediates）。而大部分的碳陽離子中間產物皆只存在於 十分短暫的時間，所以並不容易被科學家所分離。相同的反應受質氧 化鯊烯在不同的氧化鯊烯環化酵素活性區域中具有兩種摺疊方式，期 分 別 為 椅 形 - 船 形 - 椅 形 （chair-boat-chair ） 與 椅 形 - 椅 形 - 椅 形 （chair-chair-chair），因為摺疊方式不同造成了立體構形相異的反應 機制，再經質子化及一連串的雙鍵電子轉移後，會生成二種類型的碳 陽離子中間物，（一） 經由 chair-boat-chair 骨架摺疊生成的原脂醇 碳陽離子中間物（Protosteryl Cation intermediates），其再經過不同的 甲基與氫化基之轉移等骨架重排作用後，會在不同位置進行脫氫反應，
Cationintermediates），其在不同酵素中繼續誘導環化形成 6-6-6-6-5 及 6-6-6-6-6 之五環的碳陽離子中間物，接著經由類似的骨架重排與 脫氫作用而生成達瑪雙烯醇（Dammaradienol）、羽扇醇、α-香桂素 及ß-香桂素等11-13 《圖1-3》。 O (3S)-2,3-Oxidosqualene chair-boat-chair O Enz AH+ chair-chair-chair O Enz AH+ Protosteryl Cation HO H HO H Lanosterol HO Cycloartenol HO Dammarenyl Cation HO Baccharenyl Cation HO Lupenyl Cation HO Lupeol HO β-Amyrin HO Dammaradienol HO -Amyrin 《圖1-3》氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物
1.2 氧化鯊烯環化酵素探討
氧化鯊烯在不同物種間會經由不同的折疊方式而形成四環或五 環之二次代謝產物的前驅物，如：固醇類、膜組成物、固醇類激素或 其他二級代謝物。而接下來將對氧化鯊烯環化酵素的酵素催化反應及 環化機制作進一步的介紹。1.2.1 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素
Thoma等人在 2004年將人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）之 X-ray晶體結構解出，並發表於當年的 Nature 期刊中14。
由於 OSC結構的確定《圖1-4》，除了對酵素活性區域及其胺基酸基 團可能參與的反應機制有更深入的瞭解，也可以利用人類 OSC的結 晶結構作為模板，提供結構與環化機制等相關訊息，將對於不同物種
《圖1-4》人類OSC X-ray 晶體結構，圖中黑色處為抑制劑Ro48-8071，
用以指出與受質結合時的反應活性位置14
1.2.2 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素
氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素主要存在於真菌類與動物中，催
化受質氧化鯊烯進行環化反應以形成四環的羊毛硬脂醇。在酵母菌
（Saccharomyce scerevisiae）中，S.c.ERG7 是由ERG7 基因所轉譯出
來的膜蛋白，由2,196個鹼基對轉譯所生成的731胺基酸序列，其理論 分子量為83.7 kDa。此酵素具有與膜結合的特性，加上分子量很大，
因此在純化上其實十分不易，至今尚未有結晶結構被解析出來，所以 目前對 ERG7結構與催化機制方面的探討，主要是透過分生技術及反 應受質類似物等以下三種方式來進行：（1）利用氧化鯊烯的類似物 來取代受質進行環化機制的研究。（2）比對不同物種之羊毛硬脂醇 環化酵素之蛋白質序列，從得到的序列資訊進行結構與機制上的探討。 （3）以定點突變的方式來研究酵素上某些胺基酸基團在環化機制上 所扮演的角色。而這三種方法中又以第三種最為普遍，本實驗也是利 用突變實驗所得到的產物，藉此推測環化過程中胺基酸的催化功能。
1.2.3 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素反應機制
如前一節所述，酵素會誘導受質(3S)-2,3氧化鯊烯在活性區域摺 疊成椅形-船形-椅形（chair-boat-chair）的構型。接著酸性胺基酸 Asp 會提供質子來誘導環氧基進行開環反應，引起電子的轉移環化而形成 A至D環，並產生許多高能量的碳陽離子中間物，最後碳陽離子會落 在C-20 位 置 上 形 成 原 脂 醇 碳 陽 離 子 中 間 物 （ protosteryl cationic intermediate），再經過甲基與氫化基的轉移後，酵素會藉由鹼性胺基 酸或是與水的交互作用以進行脫氫反應而形成最終的產物羊毛硬酯O AH HO H 10 HO H 14 13 HO 14 H HO H H H 20 17 9 8 (3S)-2,3-Oxidosqualene O HO Lanosterol 《圖1-5》氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之環化機制
1.2.3.1 開環起始反應和 A 環的形成
在先前的研究中指出，若將鯊烯（squalene）置於中性或弱酸的 溶液中，在室溫下可穩定地存放一天，因此強酸被認為是開環起始反 應中所必需的。1997年，Corey 等人利用一系列丙胺酸定點突變式掃瞄法（alanine scanning site-directed mutagenesis）針對酵母菌 ERG7 活性區域內高度保留性的胺基酸進行實驗，結果顯示酵母菌 ERG7 中 His146, His234, Asp456 位置在催化機制上扮演十分重要的角色
15,16
。這些研究認為 ERG7在催化環氧基開環反應時，His146 會藉由 氫鍵拉扯效應來增強 Asp456的酸性，進而提供質子促使環氧基質子
化而開環《圖1-6》17
。另外從人類 OSC的X-ray結晶結構也可以發現， Cys456 和 Cys533 兩 者 皆 與 Asp455 間 有 氫 鍵 連 結 ， 可 藉 此 增 強 Asp455的酸性以誘導環氧基的質子化開環，同時 Asp455還可透過與 水分子及 Glu459的羧酸基團作用，或是藉由最後脫氫步驟的質子轉
移而再質子化《圖1-7》18
。
《圖1-7》人類OSC開環環化機制18 另外，在1997年 Corey等人也利用酸性催化劑對5,6不飽和環氧 乙烷（5,6-unsaturated oxiranes）和其衍生物進行一系列的反應19 ，此 實驗證明環化反應的起始除了需要有酸性基團在適當的位置提供質 子外，還需要受質在適當的摺疊方式下，使其環氧基上C-O鍵在斷裂 的同時，伴隨著C-C雙鍵的斷裂，而使開環反應和A環的形成同時發 生。近年來，理論計算的結果也都認同在經由質子化開環反應後，會 同步引起A環的環化形成，因此這兩個步驟目前為止被認為是同步發 生的20-22。
1.2.3.2 環化過程和受質穩定之假說
早期在環化機制尚不清楚時，Matsuda等人在研究B環的形成發現 在酵母菌 ERG7內的胺基酸 Val454位置具有高度的保留性。將其對應到植物 CAS的 Ile481位置亦然。所以他們利用分子生物學的方法 將 Val454突變成同為疏水性胺基酸的 Phe, Leu與 Ile，還有立體空間 較為簡單的 Ala與 Gly。實驗結果顯示在 Ala與 Gly的突變中，會得 到單環的產物，所以他們認為 Val454會藉由其立體空間較大的側鏈 來幫助B環形成23 。 在2004年 Nature 所發表的人類 OSC結晶結構中，關於B環形成 時能量較不傾向的船形結構方面，Thoma認為 Tyr98其立體空間較大 的側鏈推動氧化鯊烯C-10上的甲基到分子平面之下，而進一步地阻礙 B環形成能量較傾向的椅形構形《圖1-8》14 。不過在對於酵母菌 ERG7 胺基酸 Tyr99位置進行飽和定點突變實驗的結果顯示，Tyr99被證實 是 穩 定C-14 碳 陽 離 子 的 角 色 ， 在 此 位 置 進 行 突 變 則 會 得 到 (13αH)-isomalabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol, (13αH)-isomalabarica- 14Z,17E, 21–trien-3β-ol與羊毛硬脂醇等相關產物24 。而 Thoma等人也 指出幾個具有高度保留性的胺基酸位置，其中 Trp387, Phe444與 Trp581會利用其含有苯環的側鏈，並透過碳陽離子-π電子共振交互作 用，來穩定形成A環與B環時產生的C-6和C-10碳陽離子中間產物。
《圖1-8》Trp387、Phe444與Trp581能穩定A環與B環形成時C-6、C-10碳陽離子
中間物；Tyr98的側鏈藉由立體空間障礙促使B環形成能量較不傾向的船形結構14
在酵母菌 ERG7 Trp390位置的飽和定點突變實驗結果中，發現 了單環產物 Achilleol A以及 Camelliol C，這也說明了在人類 OSC 中 Trp387可能扮演穩定在A環形成時的C-6碳陽離子中間物。而在酵 母菌 ERG7 Trp587位置的飽和定點突變實驗結果卻有所不同，對產 物進行分析後，十九種突變胺基酸除了同樣都是芳香族的胺基酸，其 餘胺基酸皆沒有產物產生，這證明了 Trp587是利用芳香族胺基酸上 的π電子雲來進行受質的辨認62 。最後，在酵母菌 ERG7 Phe445的定 點突變實驗中，得到了三環與在三個不同位置去質子化的四環產物， 由此證明在酵母菌 ERG7中，Phe445會影響形成C環時的C-14碳陽離 子中間物與最後在C-8/C-9的去質子化步驟25 。
1995年，Corey等人在以 20-oxaoxidosqualene 取代氧化鯊烯作為 受質的實驗中，發現除了 6-6-6-5的四環產物以外還有 6-6-5的三環 系統產物，藉由此結果他們推測，在C環形成的過程中會先形成五圓 環，再經由擴環反應成為六圓環《圖1-9》18,26 。另一方面，利用電腦 模擬所作的理論能量計算方面，也認為C環的環化過程會先形成五圓 環再行擴環作用成為六圓環22； Hess 則從他的計算結果認為 6-6-5 的三環碳陽離子中間物為環化過程中的第一個中間物，而之後C環與 D環的形成會同時發生，並非為先前所認為的會先形成六圓環的C環 再行擴環作用而產生27《圖1-10》。 《圖1-9》利用類似物作為受質結果顯示C環會先形成五圓環27
《圖1-10》Hess認為C環與D環會經由過度態 10 同時形成27 在人類 OSC的結晶結構中，His232與 Phe696被認為可以藉由其 胺基酸側鏈上富含π電子的特性，來穩定形成C環時依著反-馬可尼 可夫（anti-Markovnikov）法則所產生的二級碳陽離子，並且可以利 用π電子與碳陽離子的共振作用來穩定帶有正電荷之高能C-20碳陽離 子中間物，最後一連串的氧化鯊烯環化步驟會終止在由五圓環D環所 形成的C-20原脂醇碳陽離子。然而從酵母菌 ERG7 His234位置的飽和 定 點 突 變 實 驗 中 ， 分 離 出 (13RH)-isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol 三 環 產 物 ， 表 示 His234也參與C-14碳陽離子穩定的角色28 ；在 Phe699位置的飽和定點 突 變 實 驗 中 ， 除 了 三 環 的 相 關 產 物 以 外 ， 還 發 現 了 protosta-13(17)-dien-3β-ol 和 (17Z)-protosta-17(20),24-dien-3β-ol，這
結果則顯示 Phe699也對於C-17碳陽離子有所影響29,30
。
目前，有兩種假說被提出來說明酵素是如何穩定這些在環化過程
中具有高能量的碳陽離子中間物。1987年，Johnson提出了第一個理 論模型（Johnson Model）《圖1-11》，他認為酵素會利用具相位選擇 性（facing selective）的負電荷來穩定過渡狀態（transition state）的正
電高能量碳陽離子31,32。
《圖1-11》Johnson提出的理論模型 Johnson Model31,32
而在1992年 Griffin提出了另一個 Aromatic Hypothesis 的理論
模組33《圖1-12》。由於在氧化鯊烯環化酵素中，具有芳香族基團的
胺 基 酸 Tyr, Trp 與 Phe 在各物種中皆具有高度保留性，因此
《圖1-12》Griffin所提出的Aromatic Hypothesis理論模組33
1.2.3.3 骨架重排與脫氫反應
環化反應結束後，藉由酵素活性區域內許多具有高度π電子性質 的芳香族胺基酸（如 Trp192, Trp230, His232, Tyr237, Tyr503, Phe521 與 Phe696 等），透過碳陽離子-π電子的共振作用來穩定甲基與氫化
基 的 轉 移 重 排 ， 使 得C-20原脂醇碳陽離子得以順利轉移重排成
C-8/C-9碳陽離子中間物《圖1-13》7,14
。而在人類 OSC中，具有高度 保留性的胺基酸 His232（對應到酵母菌 ERG7為 His234），由於其 鹼性殘基十分靠近C-8/C-9碳陽離子，所以被認為是能夠接受質子， 並進行整個環化機制最後步驟－脫氫反應的關鍵胺基酸位置。另外， His232除了會透過鄰近水分子之交互作用去影響催化反應的進行外， 還會與其附近的 Tyr503側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯作用， 使得 His232得以定位於脫氫反應的最佳位置《圖1-14》14 。
《圖1-13》具有高度保留性的芳香族胺基酸可以利用碳陽離子與π電子共振交互 作用去穩定甲基與氫化基的骨架轉移重排14 《圖1-14》氧化鯊烯環化酵素及其 產物-羊毛硬脂醇形成複合物的結 構圖。圖中所顯示的胺基酸基團為 距離產物在5Å 內的位置，水分子 只有在Asp456 及 His232 附近被觀 察到14
在酵母菌 ERG7 His234與 Tyr510的飽和定點突變實驗結果也更 進一步證明這兩個胺基酸在活性區域內所具有的功能。在酵母菌
ERG7中 His234的定點突變產生了許多在不同地方進行脫氫反應的 四 環 產 物 如protosta-20,24-dien-3β-ol, protosta-12,24-diene-3β-ol 和 parkeol34,28
；在 Tyr510突變成 Ala的突變點中也發現了 parkeol35,36
。 綜合以上結果，更加證明了 His234在酵母菌 ERG7活性區域中的功 能，除了利用碳陽離子-π電子的共振作用穩定甲基與氫化基的骨架重 排以外，也會幫助酵素在正確的位置上進行脫氫反應37。
1.2.4 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素
氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）與氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環 化酵素（OSC）在環化的機制上，兩者都是利用氧化鯊烯作為受質， 且環化時受質皆會在酵素活性區內以椅形-船形-椅形的方式摺疊，之 後並經過一連串類似的環化過程而形成C-20原脂醇碳陽離子中間物， 並經由相同的甲基與氫化基轉移機制，只是進行到最後一步去質子化 步驟時，氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素會催化脫除C-9上的氫而生成環 阿屯醇，而氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素則催化C-8上的氫行脫除反 應而生成羊毛硬脂醇。從熱力學的觀點來看，環阿屯醇比羊毛硬脂醇較為不穩定，所以 學者認為環阿屯醇環化酵素之所以可以將產物環化成能量較不趨向 的環阿屯醇，可能是因為酵素 CAS中某些特定胺基酸的作用，另外 在兩者的序列比對中，其活性區域內胺基酸基團只有少數相同，因此 這些相異性的位置被認為是可能造成兩者脫氫位置不同的關鍵胺基 酸。在先前對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素（AthCAS1）的突變實驗中
也發現，Tyr410, His477 與 Ile481 在 CAS環化機制中扮演著十分重
要的角色且這些胺基酸在各物種的 CAS皆是具有高度保留的特性，
但是在 ERG7中則分別以 Thr, Cys, Gln 及 Val 的形式存在38-41
《圖
1-15》。
《圖1-15》Tyr410（◆）、His477（＊）與Ile481（▼）在CAS1高度保留，而
在ERG7中則被Thr、Cys、Gln及Val所取代39
His477雖不位於受質鍵結的活性區域，但是曾有報導指出，位於活性 區外圍（second-sphere）的 His477會與 Tyr410產生氫鍵的交互作用 而互相拉扯，進而影響環化機制的最終脫氫反應；在酵素 CAS中， Tyr410與 His257被認為在靠近C-19的位置會有氫鍵配對的交互作用，
因此可以藉此幫助最後的去質子化作用39《圖1-16》。
另外在雙重定點突變株AthCAS1I481V/Y410T中，發現其產生羊毛硬
酯 醇 的 比 例 比 其 他 定 點 突 變 株 高 出 許 多 ； 然 而 在 三 定 點 突 變
（His477Asn/Gln, Ile481Val, Tyr410Thr）中，因為 Thr的氫氧基距離 Asn與 Gln的氨基過遠，所以並沒有辦法促進羊毛硬酯醇的生成。而 經實驗的結果證實，產生羊毛硬脂醇效率最好的突變株為雙定點突變
株 AthCAS1H477N/I481V 40
《表1-1》阿拉伯芥中CAS定點突變產物及其比例分配表40 。 《圖1-16》氧化鯊烯-環阿屯醇 環化酵素中 Tyr410、His477 與 Ile481 的相對位置39 。
由上述及表1-1 可以看出在CAS的定點突變中，AthCAS1H477N,
AthCAS1I481V 與兩者的雙定點突變株可以導致植物 CAS產生最大
量的羊毛硬脂醇。Suzuki 等人在 2006 年時發表了植物羊毛硬脂醇 的合成酵素，他們從阿拉伯芥中發現 At3g45130可以在植物本身合成 羊毛硬脂醇，最後命名為 LAS（lanosterol synthesis）。有趣的是從 序列比對可以發現 LAS在 CAS胺基酸 His477與 Ile481位置分別被 換成 Asn與 Val，這和在 CAS中突變的結果不謀而合，也顯示這兩 個胺基酸對於羊毛硬脂醇合成的重要性。
1.2.5 氧化鯊烯-香桂素與氧化鯊烯-羽扇醇合成酵素
天然物中包含了數千種三萜類的產物，而這些產物大部分來自於
氧化鯊烯環化酵素這個家族，在高等植物中除了環阿屯醇環化酵素
（CAS），氧化鯊烯-香桂素合成酵素（β-amyrin synthase , AMS）和 氧化鯊烯-羽扇醇合成酵素（lupeol synthase , LUS）同樣都是利用氧 化鯊烯做為受質形成三萜類化合物。環阿屯醇環化酵素或氧化鯊烯羊
毛 硬 脂 醇 環 化 酵 素 會 將 氧 化 鯊 烯 折 疊 成 椅 形 - 船 形 - 椅 形
（chair-boat-chair），進而環化形成原脂醇碳陽離子，而不同於這兩 種酵素的羽扇醇合成酵素以及香桂素合成酵素則會將氧化鯊烯折疊
子中間物《圖1-17》。
O
O
pre-chair-chair-chair pre-chair-boat-chair
HO
Dammarenyl Cation Protosteryl Cation HO 《圖1-17》酵素催化氧化鯊烯形成達瑪烯碳陽離子及原脂醇碳陽離子中間物 羽扇醇合成酵素以及香桂素合成酵素，它們彼此之間的基因序列 比對相似度高達80%，在比對組成這兩個雙子葉植物酵素其基因的七 百多個胺基酸差異性發現，彼此間只有 80 個胺基酸相異，因為雙子 葉這種高等植物起始於近代，演化時間自然沒有很長，所以他們序列 上的相似度自然十分高；但是，由於其序列比對相似度高且其中間產 物達瑪烯碳陽離子也相同，卻產生兩種最終產物，這使得研究策略上 必須專注於彼此之間不同的胺基酸殘基而不是那些具有高度保留性
素彼此間這 80 個不同的胺基酸進行定點突變的研究，先進行酵素構 形的的模擬，找出可能為活性區域的胺基酸，接下來使用定點突變的
方式觀察其產物的差異；發現了LUS 中的 Leu256 對應於 AMS 中的
Trp259 為這兩個酵素產物特異性的調控胺基酸42
。因此研究人員將原
本產生羽扇醇 LUS 中的 Leu256 突變成 AMS 相對應的 Trp 結果產生
了高達 75%的 ß-香桂素，而將原本產生 ß-香桂素 AMS 中的 Trp259 突變成相對應的Leu，所產生的羽扇醇為 ß-香桂素的兩倍之多，藉此 確定這個位置的胺基酸為羽扇醇合成酵素和 ß-香桂素合成酵素的產 物特異性調控胺基酸。
1.3 皂苷簡介
皂苷（saponins）是廣泛分布於高等植物中很重要的二級代謝產 物，具有很好的表面活性，於空氣混和後能形成水溶液或膠固體水溶 液並能形成泡沫狀。皂苷由皂苷配基（sapogenin）與醣基（glycone） 組成，常見的糖有 D-葡萄糖（glucose）、L-鼠李糖（Rhamnose）、D-半乳糖（galactose）、L-阿拉伯糖（Arabinose）、L-木糖（xylose）；常見的糖醛酸有葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）、半乳糖醛酸（galacturonic
acid），一個或多個醣基會與皂苷配基分子中的 C3-OH 相縮合，或是
苷配基分子中的 COOH 也可能與醣基連接，形成酯苷鍵。根據已知 的皂苷分子結構，主要可區分為兩大類，一類為固醇皂苷（steroidal saponins），固醇皂甘配基大部分是由 27 個碳的碳鏈骨架組成，通常 為六環結構，有些在C26-OH 的位置接有醣基而為五環結構。另一類 為三萜皂苷（triterpenoid saponins），三萜皂苷配基一般是由 30 個碳 的碳鏈骨架組成，通常為五環結構43《圖1-18》。 《圖1-18》皂苷配基的典型骨架結構，（A）、（B）為固醇皂苷，（C）為三 萜皂苷，R 為醣基43
是為了保護自身來自食草動物及病原體的攻擊，以及在不適合的生存 環境下能夠繼續維持生命44。正因為如此，皂苷在高等植物所生成之 產物具有豐富的多樣性，目前對於其生合成中相關的酵素和機制還有 許多未知的地方，而 Haralampidis 等人認為在皂苷生合成途徑中最關 鍵的兩個步驟，一個為氧化鯊烯的環化作用，另一個為皂苷配基的醣 基化作用45。
1.3.1 皂苷的生物活性
皂苷由極性（醣基）與非極性（皂苷配基）兩部分組成，因此具 有很強的表面活性。其一般通性為，加水共搖混合形成膠體溶液可產 生持續性的泡沫，味道苦澀、辛辣，以及有強烈溶血活性。 皂苷擁有使紅血球破裂的能力，目前已有許多研究指出，此生物 效應是因為皂苷會與紅血球細胞膜內的固醇類物質進行交互作用，而 使細胞膜破裂並促進其滲透性提高而導致血紅素游離43。Oda 等人對 47 種不同之植物皂苷作溶血活性的探討，他們認為溶血程度與皂苷 配基的形態和醣基接上皂苷配基的型式有關，除此之外，具有醯基或 環氧基的皂苷似乎都較有溶血活性46。另外也有文獻報導，三萜皂苷 一般有顯著的溶血活性，但在C-3 及 C-22 或 C-26 都有醣基的三萜皂 苷和固醇皂苷則較不顯著47。皂苷對於冷血動物有很高的毒性，但對於恆溫動物其口服的毒性 則相當低，因其在動物體內幾乎不被吸收，但會影響小腸黏膜細胞的 通透性，而抑制營養性物質、藥物和毒物的吸收。皂苷也被發現可降 低血清中的膽固醇，其亦可抑制消化酵素，像是胰蛋白酵素（trypsin） 和凝乳蛋白（chymotrypsin），也可藉由與蛋白質形成複合物而防止酵 素降解 48-50。許多皂苷對黴菌有抑制活性的能力，對其他微生物也有
微弱的毒性，例如紫苜蓿皂苷就對 Rhizoctonia solani 和 Aspergillus
niger 等具有抑制效果 51 。而近年來也有許多文獻提出，皂苷對於細胞 毒殺能力和抗癌方面的研究，似乎也有不容小覷的潛力發展，像是 lotoidoside D 和 lotoidoside E52 《 圖 1-19 》 以 及 3-O-β-D-glucuronopyranosyl-quillaic acid53 《圖1-20》。
《圖1-20》3-O-β-D-glucuronopyranosyl-quillaic acid 對於治療 HIV、瘧疾和腫 瘤之疫苗具有作為佐劑的潛力53
1.3.2 皂苷生合成探討
皂苷顧名思義就是由皂苷配基和醣基所組成，關於三萜類化合物 和固醇類生合成途徑在前一章節已有充分的介紹， 氧化鯊烯藉由環 化酵素進行環化反應而形成各物種間多樣的產物型態。Vincken 等人 歸納整理了許多歷年來關於皂苷已發表的文獻，將皂苷配基大致區分 為11 類，此分類涵蓋了幾乎所有植物物種的皂苷 54 《圖1-21》。雖然 目前對於三萜類化合物骨架之後如何形成皂苷的生合成機制還未有 完 整 的 瞭 解 ， 但 由 於 生 物 資 訊 的 發 展 ， 學 者 利 用 表 現 序 列 標 幟(Expressed Sequence Tags, ESTs)，對選殖出來的殖株自動定序後，他
們認為三萜類化合物骨架除了原有的 C3-OH，其餘修飾皆為藉由細
胞色素P450 氧化酶（cytochrome P450 oxygenase）以進行羥化反應；
並藉由轉醣酵素（glycosyltransferases）進行其醣基化反應55,56
皂苷的結構擁有如此多樣性的變化，除了環化作用帶來皂苷配基
骨架上的不同，醣基化作用更是造成差異的主要因素。轉醣酵素將帶
有尿嘧啶核苷二磷酸（uridine 5'-diphosphate, UDP）的醣基轉移至皂 苷配基的氫氧基上，而這些氫氧基上的單醣、雙醣或著是醣鏈，是由 不同的轉醣酵素將醣基一個一個接上去，而不是預先形成醣鏈後才經 由酵素作用到皂苷配基上57。大部分的皂苷都有一項共同的特徵，其 C3-OH 上都會接有醣基或醣鏈，且此項特徵被認為是皂苷具有生物 活性的關鍵45。目前已知的轉醣酵素並不多，且已發表的文獻報導中 大多是由高等植物中之ß-香桂素衍伸而來的皂苷產物 44 《圖1-22》。
《圖1-22》由 ß-香桂素衍伸而來的皂苷產物，以及已被定義的轉醣酵素 UGT74M1、CYP93E1、UGT71G1、UGT73K144
1.4 研究目的
本論文研究，主要分為兩部分，第一部分為利用定點飽和突變對 氧化鯊烯環化酵素進行結構、功能及機制上的探討；第二部分為利用 OSC 定點突變後的產物當作皂苷之轉醣酵素的受質，除了能對本實1.4.1 對氧化鯊烯環化酵素進行定點飽和突變
過去近半世紀以來，氧化鯊烯環化酵素一直是科學家十分感興趣
的研究課題，因其在固醇類生合成途徑中扮演著重要的角色，且在生
理及演化上也有一定的重要性，因此對於此酵素的環化機制與其胺基
酸基團所具備的功能，值得做更深入的瞭解。在研究蛋白質結構與功
能的領域中通常會利用核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）及蛋白質 X-ray 單晶繞射（Protein X-ray Crystallography，X-ray diffraction）來解出蛋白質結構。但上述兩種方法皆有所限制，核磁 共振光譜只能夠解出分子量較小的蛋白質（小於30kDa）；而在進行 X-ray 單晶繞射之前則必須先純化出一定數量的蛋白質，但是在利用 蛋白質進行結晶試驗時，養晶的條件往往複雜不易拿捏。另外，我們 所研究的酵母菌氧化鯊烯環化酵素是一種膜蛋白，分子量大加上十分 不穩定且不容易被純化，所以我們無法利用上述兩種方法來得到氧化 鯊烯環化酵素的結構，且對於酵素催化機制的了解仍然有限。 隨著1997 年細菌的鯊烯環化酵素58 與2004 年人類 OSC14 X-ray 結晶結構的解讀，提供我們更多對酵母菌 ERG7的了解，尤其是人類 OSC的結晶結構，透過這些資訊可以知道受質於酵母菌 ERG7的整個 環化過程，以及在酵素活性區域的胺基酸基團扮演著辨識受質、穩定 中間產物等十分重要的功能，所以近年來科學家也針對活性區域內的
假設活性胺基酸進行了許多突變實驗。利用突變對蛋白質進行研究已 經是蛋白質工程及分子生物技術中很常被應用的方法，而最常見的為 定點突變與隨機突變，定點突變通常是針對某個位置的胺基酸進行取 代、刪除或嵌入，用以探討某個重要區段上特定胺基酸序列所執行的 功能；而隨機突變是對蛋白質上的胺基酸序列不預設位置地進行突變， 通常並不會知道被突變的位置，且突變的量之大而需先建構成一個突 變株庫（library），再設計篩選方式從中挑選出所要的突變株。本實 驗則是利用定點突變的方式對於酵母菌 ERG7進行結構、功能以及機 制上的探討。 在實驗室先前的研究中，我們對酵母菌 ERG7位於活性區域中重 要位置的 F699，以及鄰近 F699的 I705，進行定點飽和突變及其功 能性的產物分析，因而得到了在 C-17cation位置脫氫的新產物，由 F699 的 突 變 產 物 中 分 離 出 protosta-13(17),24-dien-3β-ol 和 protosta-17(20),24-dien-3β-ol29,30 ， I705 的 突 變 產 物 中 則 分 離 出 protosta-16,24-dien-3β-ol64 《圖1-23》。這些產物的取得意謂著對這兩個 位置做突變會影響環化反應的進行甚至是中間產物的立體化學結構，
環化反應具有極其重要的關鍵性且令人想更深入探討。 HO H H H 20 17 9 8 (3S)-2,3-Oxidosqualene O HO Protosteryl cation HO H H Protosta-16,24-dien-3β-ol H H H H HO H H H HO HO Protosta-13(17),24-dien-3β-ol Protosta-17(20),24-dien-3β-ol 《圖1-23》本實驗室目前已得到在C-17cation位置脫氫的新產物 隨著人類 OSC的 X-ray晶體結構在 2004 年被解開後14 ，我們便 可利用此晶體結構做為模板，對其他物種之氧化鯊烯環化酵素的結構 與反應機制進行更深入的研究，因此藉由電腦模擬酵母菌 ERG7的方 式可以看出在活性區域中 C-17 cation位置附近的胺基酸《圖1-24》，
如前章節所述，F699對於穩定 C-17 cation扮演重要的角色，而 H234 除了能穩定 C-14 cation，對於環化機制的最終步驟脫氫反應也是不 可或缺的重要胺基酸。另外從蛋白質結構可以看出，C-17 cation位在 環狀區域（loop regions）的一個轉彎處，而此轉彎處是由 G383和 T384組成。
的部分，Tyr 是高度保留在生成植物環阿屯醇的環化酵素 CAS 中，而 Thr 則是高度保留在生成真菌和哺乳類動物之羊毛硬脂醇的環化酵素 ERG7 中；在 Gly383 的部分，Gly 是高度保留在所有 CAS 和 ERG7 的蛋白質中，但在生成其他產物的其他物種環化酵素中的這個位置則
是由其他胺基酸所取代 17，像在產生 β-香桂素的 AMS 中是由 Ser 取
代，而這種演化上的保留性是否對於反應機制上的意義有影響亦是一
個值得討論的課題。
《圖1-25》G383與T384在CAS和ERG7各物種間的序列比對17
A. thaliana (Ath), Pisum sativum (Psa), Panax ginseng (Pgi), Glycyrrhiza glabra
(Ggl ), Luffa cylindrica (Lcy), Avena sativa (Asa), and D. discoideum (Ddi)
S. cerevisiae (Sce), Candida albicans (Cal ), Cephalosporium caerulens (Cca), Schizosaccharomyces pombe (Spo), Rattus norvegicus (Rno), Homo sapiens (Hsa)
另外在先前的研究中，Matsuda 等人將 CAS 的 Tyr410（在 ERG7
中為Thr384）突變成 Thr，使產物由原本的環阿屯醇轉變為羊毛硬脂
的比例佔了六成之多38。而本實驗室之前的研究，嘗試將酵母菌ERG7
高度保留的 Thr384、Gln450 和 Val454 突變成在 CAS 中序列位置相
對應的Tyr、His 和 Ile（S. cerevisiae ERG7T384Y/Q450H/V454I），雖然沒有
生成預期的環阿屯醇，但產物卻由羊毛硬脂醇完全轉變為 parkeol。
個別對這三個突變點（ERG7T384Y, ERG7Q450H, ERG7V454I）進行產物分
析 後 ， 發 現 只 有 ERG7T384Y 會 生 成 parkerol 和 其 他 四 環 產 物
protosta-13(17),24-dien-3β-ol, protosta-16,24-dien-3β-ol63
。
最後我們利用發表在 Nature 期刊中的人類 OSC X-ray 晶體結構
14 《圖 1-26》，與酵母菌 ERG7 的蛋白質結構《圖 1-27》比對後發現， G383 和 T384 距離受質進出酵素的通道很近。基於以上種種因素更加 深對這兩個胺基酸做進一步探討的動機，因此我們將 Gly383 和 Thr384 進行定點飽和突變，希望能藉此瞭解其與 C17-cation 之間的關 係，以及酵素在環化機制上和對於活性區域甚至是整體蛋白質結構的 影響。
《圖1-26》人類OSC與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑Ro48-8071結合在活
性區域的反應中心，透明網狀的部分為受質進出酵素的通道14
《圖1-27》酵母菌 ERG7 的蛋白質結構，圈起來的部分為 Gly383 和 Thr384 所
1.4.2 將 OSC 突變產物應用於轉醣酵素
研究目的第二部分為利用 OSC 定點突變後的產物當作皂苷之轉 醣酵素的受質。本實驗室利用定點飽和突變技術探討酵母菌氧化鯊烯 環化酵素的環化機制已經持續多年，此項研究日後的發展除了應用於 抑制膽固醇與抗黴菌藥物外，對於經由突變後所得到的許多產物，也 希望能在未來有其應用性及更多的發展。如前面皂苷簡介所提到的， 皂苷具有溶血、抗黴菌、抗癌，以及作為疫苗佐劑等生物活性，且許 多文獻報導也指出其生物活性的關鍵，推測與皂苷配基三萜類化合物 上之 C3-OH 的醣基修飾有關，因此如果能將實驗室許多經酵母菌 ERG7 定點突變後所生成的四環產物，在其 C3-OH 的位置也接上醣 基，是不是也能具有生物活性，這是個值得討論的課題。 由於植物所生成之皂苷具有多樣性，不管是皂苷配基的結構或者 是醣基部分，所以推測其轉醣酵素的專一性可能不如其他酵素如此嚴 謹，因此想嘗試藉此轉醣酵素將醣基轉移至經由 OSC 定點突變後所 分離之四環產物的 C3-OH 上。目前已被定義的轉醣酵素很少，像是醣基是由不同的轉醣酵素將醣一個一個接上去，而此篇報導在活性測
試的部分，使用了Hederagenin, soyasapogenol B 和 soyasapogenol E
作為受質，UDP-glucose, UDP-galactose 和 UDP-glucuronic acid 作為
醣的材料，而實驗結果顯示UGT73K1 轉移至皂苷配基上的醣基為葡
萄糖 59。因此，我們的目標是純化出蛋白質 UGT73K1，希望藉由其
將葡萄糖轉移到受質C3-OH 的功能，使醣基接上四環的 OSC 定點突
O HO O HOH2C OH HO O OH HO O HO CH2OH OH OH O CH2OH CO HO CH2OH COOH O O O O O HO HO OH HO O OH OH HO CH2OH OH O CH2OH COOH CH2OH OH HO HO β-amyrin Cytochrome P450s Hederagenin Soyasapogenol B Glycosyltransferases 3-Glc-Ara, 28-Glc-Hederagenin Soyasaponin I (3-Rha-Gal-GlcA-soyasapogenol B) 《圖1-28》UGT73K1 在蒺藜苜蓿中的簡略生合成途徑
第二章 實驗方法
2.1 對酵母菌 ERG7 進行定點飽和突變
實驗流程
2.1.1 重組質體的建構
利 用 Stratagene 公 司 所 出 品 的 QuikChange Site-Directed
Mutagenesis Kit 建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互
補引子。再以含有正常功能的野生型pRS314 ERG7 質體作為模板，
利用QuikChange Site-direct mutagenesis 的方式《圖 2-2》，建構定點
（1）引子設計： 將所要突變之胺基酸以粗體字表示，並在突變點之後設計一個靜 默突變（Silent mutation，灰色鋼底表示），藉此增加一個切位（下標 線標示為切位序列）作為酵素鑑定之用。如下表： 《表2-1》酵母菌 ERG7G383X定點飽和突變之引子設計 YOSC primer name Sequence YCC‐YOSC‐G383IKMNRST‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gAN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐G383CFLSWY‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gTN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐G383HLPQR‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT gCN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐G383ADEGV‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggN (C/g)AC AAA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ 《表2-2》酵母菌 ERG7T384X定點飽和突變之引子設計 YOSC primer name Sequence YCC‐YOSC‐T384IKMNRST‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg AAN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐T384CFLSWY‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg ATN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐T384HLPQR‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg ACN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’ YCC‐YOSC‐T384ADEGV‐BsrGI‐1 5’‐gAC CAT TAT ggg AgN (C/g)AA Tgg TgT ACA AAC CTg‐3’
DNA。
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之材料條件
Reagent Volume (μl) Primer1 (1μg/μl) 0.5 Primer2 (1μg/μl) 0.5 Template 0.5 dNTP (10 mM) 1.6 Pfu II buffer 2 Pfu II polymerase 0.4 DDW 14.5 Total 20
《表2-4》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 之聚合酶連鎖反應條件
segment cycles temperature time
1 1 95℃ 2 min 2 25 95℃ 30 sec 53℃ 1 min 68℃ 8 min 3 1 68℃ 7 min 4 1 4℃ ∞ （3）DpnI 酵素切除母股 DNA 將 PCR 產物以《表2-5》之條件放置在水浴槽中於 37℃下反應 四個小時，因 DpnI 限制酶具有截切甲基化 DNA 之特性，因此我 們可以用其去除不含有突變之母股 DNA。
《表2-5》DpnI切除PCR產物DNA母股之條件 Reagent Volume (μl) PCR products 12 10X NE Buffer 4 1.5 Dpn I 1.5 （4）突變質體的放大與酵素鑑定 製備勝任細胞
取少許 XL1-Blue在含有 Tetracycline（100 mg/L）的 LB Agar 培養皿上劃四區，於 37℃培養箱一天後。由 Tetracycline/ LB Plate 上挑取單一菌落培養於含有 Tetracycline（100 mg/L）的 3 ml LB試 管，同樣在 37℃下於培養箱隔夜培養。接著將菌液接種於 1,000 ml 的 SOB培養液（含有0.02 M的MgCl2），於震盪培養箱中以 37℃、 250 rpm震盪條件培養 4至 5小時使其 OD600介於 0.5至 0.6之間。 將菌液置於經高壓滅菌過之離心瓶中，並冰浴十分鐘，接著在 4℃下 以 4,100 rpm的條件離心十分鐘，待去除上清液之後以經高壓滅菌過 之二次水清洗菌體，冰浴十分鐘後，再以 4,100 rpm、4℃條件離心十 分鐘。去除上清液後，以 320 ml TB buffer清洗 pellet，並重複上述
DNA的轉殖與放大以及限制酶鑑定 從 -80℃冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取 10 μl 含有突 變點之質體 DNA，並加入 100 μl 的勝任細胞，冰浴 20分鐘使質體 DNA附著於細胞的表面。置於 42℃的水浴一分鐘，使細胞表面因熱 產生小孔洞而促使質體 DNA進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入 於 1 ml 的 LB試管中，以 37℃、200 rpm震盪條件培養一小時後， 將菌液以 8,000 rpm的條件離心一分鐘並去除上清液，接著在無菌環 境下將菌液塗在 LB plate（with Ampicillin 100mg/l），在 37℃下培 養約 16小時後挑取單一菌落培養於 3 ml的LB tube（with Ampicillin 100mg/L），於 37℃、200 rpm震盪條件下培養12小時即可抽取放大 之質體DNA。 將放大抽取所得之含有突變的質體 DNA，依《表2-6》所示條件， 將設計用於鑑定之限制酶與特定緩衝液混和，並置於 37℃水域槽中 反應四小時，再以 DNA電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。 《表2-6》特定限制酶鑑定之材料條件
Reagent Volume (μl) Volume (μl)
Plasmid 2 2
10X NE Buffer 1 1
BSA ‐ 1
Enzyme 0.5 0.5
（5）突變質體的定序
將 上 述 經 由 限 制 酶 鑑 定 過 之 含 有 突 變 的 質 體 DNA 以
Sangerdideoxynucleotide chain termination 進 行 定 序 。 首 先 利 用
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 以《表2-7》所示之材
料 依 廠 商 所 附 之 溫 度 條 件 下 進 行 聚 合 酶 連 鎖 反 應 ， 其 引 子 為
CTL-YOSC-C457ADEGV-AlwnI-2（5’-CTT CTg CAg T(g/C)N CAT
CAg CCA CTg TAT AgC C-3’）。在反應過後以酒精沈澱法取得DNA，
再以ABI PRISM 3100 auto-sequencer 進行定序反應。
《表2-7》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用之材料
Reagent Volume (μl) Plasmid 2 5X Sequencing Buffer 3 Primer 1 BigDye 3.1 0.8 DDW 13.2
2.1.2 酵母菌株 TKW14C2 的電穿孔作用
於 -80℃冰箱中取出 TKW14C2 菌株（MATa or MATα ERG7Δ::
LEU2 hem1Δ::G418 ade2-101 his3Δ-200 leu2-Δ1 lys2-801 trp1-Δ63
合成與 Heme 基因相關，當 Heme 基因被置換掉時，Methionine 的 生合成會受影響，故要額外補充)。將其接種於 3 mL 的YNB（含有 amino acids (Ade、Lys、His、Met、Uracil ) / hemin/ Ergosterol/ Glucose） 試管在 30℃培養箱中以 250 rpm 震盪條件培養約三天。繼而將菌液 倒入 100 mL 含有相同培養液條件下培養至其 OD600 值介於 1 至 1.5 之間，之後將全部菌液以 3,000 rpm 、4℃條件下離心十分鐘， 去除上清液後以經高壓滅菌之二次水（50 mL）緩慢沖洗菌體。重複 上述離心步驟後以 20 mL 經高壓滅菌之二次水沖洗菌體。再重複上 述離心步驟，倒除上清液並以 4 mL 經高壓滅菌之冰過的 1M D-sorbitol 溶液緩慢沖洗菌體。同樣地，再以 3,000 rpm、4℃條件下 離心十分鐘並倒除上清液。最後加入 50 μL × n（n 為所需轉殖的樣 品數目）之 D-sorbitol 溶液。之後取 50 μl 菌液混和 5 μL 含有突變 之質體 DNA，並於 4℃下冰浴 5 分鐘。接著將混合液置入 2 mm 的 電穿透玻璃管，設定玻璃管入脈衝控制器條件為 1.5 kV，200 Ω，25 μF 以進行電穿透作用。在電擊後立刻加入 500 μL 無菌的 1M D-sorbitol 溶液將細胞懸浮混勻，最後取 120 μL 的菌液塗佈在 YNB plate 中（含有amino acids (Ade、Lys、His、Met、Uracil ) / Hemin/ Ergosterol/ Glucose），於30℃培養箱中培養 3 至 5 天後待其菌落生 長即可進行功能性補充篩選分析。
2.1.3 功能性補充篩選
使質體轉植到 TKW14C2 酵母菌中，主要目的是為了利用宿主 本身基因的缺陷，進行麥角固醇補充篩選（Ergosterol supplement）。 將先前以電穿孔方式轉殖入酵母菌 TKW14C2之菌株培養皿取出，於 其上挑取單一菌落，並依序劃眉於以下兩組培養皿上：Glucose
+ amino acids (Ade、Lys、His、Met、Uracil ) + Hemin（實驗組）與 Glucose + amino acids (Ade、Lys、His、Met、Uracil ) + Hemin + Ergosterol（對照組）。利用外界補充麥角固醇與否，得以篩選出哪 些突變株會使酵素失去 ERG7正常的催化功能，並藉此分析那些突變 位置在 ERG7催化機制上具有重要影響性。
2.1.4 酵母菌的培養
從麥角固醇補充篩選培養皿上挑取含有突變之菌落，並接種於 3 ml 的 YNB 溶液中（含有 Glucose/ amino acids (Ade、Lys、His、 Met、Uracil ) / Hemin/ Ergosterol，若酵母菌 ERG7活性則不加 Ergosterol）於 37℃、250 rpm 震盪條件下培養約三天。將試管底部
